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Methodenartikel

Hochdurchsatz-Nitrobenzoxadiazole-Label Cholesterin-Efflux-Assay

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DOI:

10.3791/58891

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7. Januar 2019

 ,  , 
1Group of Genomics and Pharmacogenomics in HIV, Laboratory of Retrovirology and Viral Immunopathogenesis, IDIBAPS, Hospital Clínic de Barcelona

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Messung der in-vitro-Cholesterin Efflux Fähigkeit, Serum oder Plasma in Makrophagen Zellmodellen ist ein viel versprechendes Instrument als Biomarker für Atherosklerose. In der vorliegenden Studie wir optimieren und standardisieren eine fluoreszierende NBD-Cholesterin-Efflux-Methode und eine Hochdurchsatz-Analyse mit 96-Well Platten zu entwickeln.

Zusammenfassung

Arteriosklerose führt zu Herz-Kreislauf-Krankheit (CVD). Es ist noch unklar, ob Cholesterin HDL (cHDL) Konzentration spielt eine ursächliche Rolle in der Entwicklung von Atherosklerose. Allerdings ist ein wichtiger Faktor in frühen Stadien der Atherom Plaquebildung Cholesterin Efflux Fähigkeit, HDL (die Fähigkeit der HDL-Partikel, Cholesterin aus Makrophagen anzunehmen) um Zelle Schaumbildung zu vermeiden. Dies ist ein wichtiger Schritt bei der Vermeidung der Anhäufung von Cholesterin in das Endothel und ein Teil des umgekehrten Cholesterin-Transport (RCT), Cholesterin durch die Leber zu beseitigen. Cholesterin Efflux Fähigkeit, Serum oder Plasma in Makrophagen Zellmodellen ist ein viel versprechendes Instrument, das als Biomarker für Atherosklerose verwendet werden kann. Traditionell, [3H]-Cholesterin in Cholesterin-Efflux-Assays verwendet worden. In dieser Studie wollen wir ein sicherer und schneller mit fluoreszierenden gekennzeichnet-Cholesterin (NBD-Cholesterin)-Strategie in einem zellulären Assay, den Cholesterin Aufnahme und Fluth Prozess in THP-1-derived Makrophagen zu verfolgen. Endlich, wir optimieren und standardisieren die NBD-Cholesterin-Efflux-Methode und eine Hochdurchsatz-Analyse mit 96-Well Platten zu entwickeln.

Einleitung

Nach Angaben der Weltgesundheitsorganisation sind die aktuellen wichtigsten Todesursachen weltweit ischämischen Herzkrankheiten und Schlaganfall (Buchhaltung für insgesamt 15,2 Millionen Todesfälle)1. Beide sind Herz-Kreislauf-Erkrankungen (CVD), die Arteriosklerose und der Bruch des Atheroms Plaques in Blutgefäßen2,3vorangestellt werden können.

Atherosklerose ist ein Schiff Wand entzündliche Erkrankung in der T-Zellen, Makrophagen, Mastzellen und dendritischen Zellen infiltrieren das Endothel und sammeln aus dem Blut, schließlich bildet arteriosklerotische Plaques. Arteriosklerotische Plaques präsentieren ein Lipid Kern und Cholesterin-Kristalle, belegt durch hochauflösende B-Mode Sonographie Messungen der a. carotis Intima Media Dicke4,5. In Makrophagen wird Cholesterin Efflux zur Lipid-Akzeptor-Partikel mit Mitteln der ATP-bindende Kassette (ABC) Rezeptoren ABCA1, ATP verbindliche Kassette Unterfamilie G Mitglied 1 (ABCG1) und der Scavenger-Rezeptor SR-BI durchgeführt. Das Ungleichgewicht der Cholesterin Zustrom und Fluth in Makrophagen gilt ein Schlüsselprozess bei Arteriosklerose Einleitung6. Cholesterin-Efflux gilt als ein wichtiger Schritt in der Cholesterin-Beseitigung von peripheren Gewebe in das Plasma und Leber in einem Prozess namens reverse Cholesterin-Transport (RCT). Cholesterin wird von Makrophagen hauptsächlich an Apolipoprotein A1 (ApoA1) gefunden auf der Oberfläche des High-density-Lipoprotein (HDL) Teilchen übertragen. HDLs transportieren dann Cholesterin zur Leber für die Ausscheidung und Verwertung7,8,9.

Traditionell hat Tritium (3H) radioaktiv markierten Cholesterin Cholesterin Efflux10eingesetzt. Die Emission Signal von Radioisotopen ist hochempfindlichen10; Allerdings stellt die radioaktiv markierten Cholesterin offensichtliche Nachteilen wie lange Protokolle, Risiko einer Exposition gegenüber ionisierender Strahlung und die Notwendigkeit für spezielle Radioaktivität Einrichtungen und Anlagen zum sicheren Umgang mit radioaktiven Emissionen zu gewährleisten. Fluoreszenz ist hingegen erfolgreich in diagnostischen Techniken aufgrund seiner Einfachheit in fluoreszierenden Signalerkennung, die unterschiedlichsten Fluorophore verfügbar und seine Sicherheit11aufgenommen worden. Mehrere Leuchtstofflampen gekennzeichnet Sterole wurden verwendet, um Cholesterin-Stoffwechsel einschließlich Dehydroergosterol (mit intrinsische Fluoreszenz), Dansyl Cholesterin, 4,4-Difluoro-3a, 4adiaza-s-Indacene (BODIPY) studieren - Cholesterin und 22-(N) (7) Nitrobenz-2-oxa-1,3-Diazol-4-YL)Amino)-23,24-Bisnor-5-Cholen-3β-OL (NBD-Cholesterin). Insbesondere stellt NBD-Cholesterin eine effiziente Aufnahme in menschlichen Zellen12. Derzeit gibt es zwei verschiedene NBD gekennzeichnet-Cholesterin: 22-(N-(7-nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4-yl)amino)-23,24-bisnor-5-cholen-3b-ol (22-NBD) und 25-(N-[(7-nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4-yl)-methyl]amino)-27-norcholesterol (25-NBD; ( Abbildung 1). Cholesterin mit 22-NBD glyko-gekennzeichnet kann Cholesterin-Efflux-Studien, am besten passen, während 25-NBD-Cholesterin hauptsächlich in Zellmembran Dynamik Forschung13,14verwendet wird.

Zell-Linien in der Regel verwendet in in-vitro-Cholesterin-Efflux-Assays sind Monocyte-wie Zellen wie menschliche Leukämie abgeleitet THP-1-Zellen, murine Raw 264,7 Zellen15oder J774.1. Alle diese Zellen differenzieren sich in Makrophagen in Vitro mit Phorbol Myristate-12 13-Acetat (PMA), aber THP-1-derived Makrophagen (DmTHP-1) am besten widerspiegeln und imitieren die menschliche Makrophagen16.

In der vorliegenden Studie, wir optimieren und standardisieren eine fluoreszierende Hochdurchsatz-Methode auf, um die Cholesterin-Efflux-Kapazität der Serumproben auf DmTHP-1, ermitteln mit 22-NBD-Cholesterin als Alternative zu [3H]-Cholesterin. Darüber hinaus vergleichen wir die optimierte fluoreszierende Technik mit dem standard radioaktiven analogen.

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Protokoll

Für diese Studie wurden Ethikkommission Genehmigung (Comitè Ètic d' Investigacio Clínica, Klinik, Barcelona, Zulassungsnummer HCB/2014/0756) und schriftliche, informierte Zustimmung aller Fachrichtungen erhalten.

(1) NBD-Cholesterin Vorbereitung

  1. Auflösen der NBD-Cholesterin (MW 494.63; siehe Tabelle of Materials) in reinem Ethanol um das Lager (2 mM) zu erhalten. Lösen Sie für eine 10 mg Ampulle die gesamte Fläschchen Inhalte in einem 10,1 mL Volumen von Ethanol, ein 2 mM Lager zu erhalten auf.
  2. Verdünnen Sie die NBD-Cholesterin aus dem Bestand RPMI 1640 mit 10 % fetalen bovine Serum und 5 % Penicillin/Streptomycin (R10 Medium) ergänzt um eine Endkonzentration von 5 μM zu erreichen (z. B., erhalten 10 mL NBD-Cholesterin bei 5 μM Endkonzentration) durch verdünnen 25 μL der NBD-Cholesterin (2 mM) vorrätig R10 Medium. Diese Menge reicht für eine 96-Well-Platte.

2. Handy-Kultur und Seeding (2.Tag)

  1. Kultur-THP-1-Zellen in R10-Medium bei 37 ° C, 5 % CO2. Passen Sie auf 0,3 x 106 Zellen/mL alle 3 Tage.
  2. Samen der Zellen in einem weißen 96-Well-Platte mit einem flachen, klaren Boden bei 0,2 x 106 Zellen/Well in R10 Medium (100 μL pro Well).
  3. Behandlung der Zellen mit 100 nM Phorbol Myristate-12 13-Acetat (PMA; aus einem Bestand von 10 μM) für 48-72 h, Inkubation bei 37 ° C, 5 % CO2 THP-1 zu unterscheiden Zellen in DmTHP-1.
    Hinweis: Es wird empfohlen, 5 μL der PMA Lager (10 μM) verwenden in 500 μL der R10 Medium. Davor bereiten Sie eine 10 μM PMA Lager durch Auflösen einer Durchstechflasche lyophilisierten 1 g in 10 mL Dimethyl Sulfoxid (DMSO), aliquoten und Lager bei-20 ° C.
  4. Alternativ (Vorschlag) kombinieren Schritte 2.2 und 2.3 für besseren Homogenisierung. Bereiten Sie 10 mL THP-1-Zellen in der 15 mL Tube vor, fügen Sie 200 μL der PMA Lager (10 μM), mischen Sie vorsichtig und sofort Samen Sie 100 μL pro Well auf den Teller. Inkubieren Sie die Zellen, wie unter Punkt 2.3 beschrieben.

(3) Apolipoprotein B erschöpft Serum (ABDS) Vorbereitung (Tag 2 oder 3)

  1. Zur Vorbereitung einer Polyethylenglykol (PEG) Lösung verdünnen Sie Glycin in 10 % PBS (mit sterilen H2O) zu einer Konzentration von 200 mM bei pH 7,4. 40 mL 200 mM Glycin hinzufügen 10 g PEG 8000 PEG erhalten 20 % (w/V). Mischen Sie die Lösung kräftig zu homogenisieren.
  2. Gelten 4 Teile von 20 % pro 10 Teile von Serum/Plasma auf jede Serum/Plasma-Probe in einer 1,5 mL Tube PEG und lassen Sie die Mischung auf dem Eis für 25 min17 (z. B. für 100 μL Plasma oder Serum, fügen Sie 40 μL 20 % PEG Lösung).
  3. Zentrifugieren des PEG-Apolipoprotein B Niederschlags bei 13.000 X g für 15 min bei 4 ° C.
  4. Verwerfen Sie den Niederschlag. Übertragen Sie den Überstand auf einen neuen Schlauch.
    Hinweis: Wir empfehlen Ihnen, Vorbereitung der ABDS am Tag 3 (frisch). Wenn es nicht möglich ist, bereiten Sie die ABDS am 2. Tag und halten Sie es über Nacht bei 4 ° C.

4. NBD-Cholesterin Zelle laden (Tag 2)

  1. Entsorgen Sie das Kulturmedium des DmTHP-1 und waschen Sie die Zellen zweimal mit 1 x Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS).
  2. Die Wägezellen mit 5 μM NBD-Cholesterin (100 μL pro Well) in R10 Medium und Inkubation über Nacht bei 37 ° C, 5 % CO2.

(5) Inkubation mit Cholesterin Akzeptoren (Tag 3)

  1. Entsorgen Sie das Medium und waschen Sie die Zellen zweimal mit PBS.
  2. Inkubieren Sie die Zellen mit 2 – 5 % ABDS oder die gewünschte Konzentration von gereinigten Lipid-Akzeptor (HDL, ApoA, ApoE, etc.) verdünnt in farblos RPMI 1640 Medium (100 μL pro Well) für 4 – 6 h bei 37 ° c
    Hinweis: Enthalten Sie eine Negativkontrolle (c-) bestehend aus farblos RPMI 1640 Medium ohne Akzeptoren und eine Positivkontrolle (C +) (z. B. ABDS aus einem Pool von gesunden Spendern) oder gereinigte HDLs. Beachten Sie, dass die Positivkontrolle gilt, vor allem wenn Patientenproben (Erkrankungen) analysiert (ergänzende Abbildung1).
  3. Bereiten Sie eine 200 mL Brühe der Zelle Lysis Lösung 1 (50 mM Tris-Puffer, 150 mM NaCl, H2O). Mischen Sie die Zelle Lysis Lösung 1 bei 1:1 (V: V) Verhältnis mit reinem Ethanol die Lyse Lösung 2 zu erhalten.

(6) fluoreszierendes Signal zu erfassen (Tag 3)

  1. Medien-NBD-Cholesterin-Erkennung
    1. Die Zelle Medium von den Platten zu entfernen und in eine neue weiße 96-Well-Platte mit einer undurchsichtigen flachen Boden zu sammeln.
    2. Fügen Sie für eine optimale Fluoreszenz Signalerkennung in den Medien Proben 100 μL von reinem Ethanol 100 μL jeder mittlere Probe auf ein 1:1 Verhältnis in der weißen 96-Well-Platte zu erhalten hinzu.
    3. Halten Sie der Platte mit den behandelten Medien weitere Maßnahme der Fluoreszenzintensität (FI) bei einer 463⁄536 nm (Anregung/Emission) Wellenlänge in die Luminometer.
  2. Intrazelluläre NBD-Cholesterin-Erkennung
    1. Waschen Sie die Zellen zweimal mit PBS.
    2. Um den intrazellulären Cholesterinspiegel zu erhalten, lösen Sie die Zellen durch Inkubation sie mit 100 μL pro Well-Lyse Lösung 2 und schütteln Sie die Platte bei Raumtemperatur (RT) für 25 min.
    3. Für eine optimale Fluoreszenz Signalerkennung in die Zelle lysate Proben, erfassen der Fluoreszenzintensität der Zelle Lysates in der gleichen weißen 96-Well-Platte mit klaren flachen Boden (die gleiche Platte in dem in Schritt 2.2 Zellen ausgesät wurden).
  3. 6.3 während der Einstellung des Empfindlichkeit Parameters auf 50 in der Software der Fluoreszenzintensität (FI) in der Luminometer messen (siehe Tabelle der Materialien).

7. die Ergebnisermittlung

  1. Drücken Sie die Cholesterin-Efflux-Rate einer Probe als Prozentsatz berechnet, indem die Formel aus:
    figure-protocol-1
  2. Erhalten Sie das endgültige Maß der Cholesterin-Efflux (CE) durch Subtraktion der CE von der negativen Kontrolle (Beispiel mit NBD-Cholesterin geladen aber inkubiert mit farblosen RPMI 1640 Medium, ohne Cholesterin Akzeptoren) aus dem UZ der ein Muster gegeben:
    figure-protocol-2

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Ergebnisse

Der Cholesterin-Efflux-Test soll in Vitro die Cholesterin Efflux Kapazität eines bestimmten Serum, Plasma oder überstand mit HDL-Partikeln zu ermitteln. Die Methode besteht darin, be-gekennzeichnet Cholesterin in eine Kultur einer standard Makrophagen-Zelllinie und Kontakt mit der Teststichprobe verdünnt in FBS-freie Medien mit den Zellen induzieren. Schließlich sind die fluoreszierenden Werte aus der NBD in den Medien und Zelle lysate gemessen. Um die Messungen zu optimieren, wird das Effluxed Cholesterin aus den Zellen...

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Diskussion

Leuchtstoff-gekennzeichnete Cholesterin ist eine vielversprechende Strategie analysieren und untersuchen die Eigenschaften und den Stoffwechsel von in-vitro-natürliche Cholesterin. Die wichtigsten Vorteile sind, dass es von den Zellen aufgenommen werden kann, ermöglicht die intrazellulären und Membran Reichweitenstudien und können auch auf Cholesterin Efflux-Assays wie in diesem Protokoll (Abbildung 7). Einige Leuchtstofflampen gekennzeichnet Sterole ermöglichen Cholesterin tracking in-vitro...

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Offenlegungen

Möchten die Autoren erklären, dass sie Erfinder der Patentanmeldung (EPA, 18382337.6-1118, 17. Mai 2018) mit dem Titel "Methode für die Bestimmung von Cholesterin Efflux" basiert auf diese Methode.

Danksagungen

Diese Arbeit wurde teilweise von unterstützt die Forschung gewährt FIS (PS12/00866) vom Instituto de Salud Carlos III, Madrid, Spanien; Fondo Europeo Para el Desarrollo Regional (FEDER); Red de Investigación En SIDA (RIS), ISCIII-RETIC (RD16/0025/0002) und CERCA Programm / Generalitat de Catalunya. Die Autoren danken den Retrovirology und virale Immunpathologie Labor des Institut d'Investigacions Biomèdiques August Pi I Sunyer (IDIBAPS). Wir danken T. Escribà, C. Rovira und C. Hurtado für ihre Unterstützung und S. Cufí vom Wissen und der Technologie-Transfer-Büro für ihre Führung in der Erfindung zu schützen.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
96-Well-SammelplatteCorning IncCostar 3912weiße 96-Well-Platte mit undurchsichtigem Boden
96-Well-KulturplatteCorning IncCostar 3610weiße 96-Well-Platte mit flachem
<>Cholesterol Efflux Assay Kit (zellbasiert)Abcamab196985kommerzielles zellbasiertes Hochdurchsatz-Assay-Kit zur Bestimmung der Cholesterinausfluss
farblos RPMI 1640Sigma-AldrichR7509RPMI 1640 ohne Pehnolrot
Gen5 DatenanalysesoftwareBioTekVersion 2.0
GlycinSigma-AldrichG8790-100GGlycin, nicht für Tiere
geeignet LuminometerBiotekSYNERGY HTMulti-Detection Microplate
Reader Lyselösung 1hauseigene50 mM Tris-Puffer, 150 mM NaCl und H2
O Lyselösung 2hauseigene reineEthanol- und Zelllyselösung 1:1 (v:v)
NBD-CholesterinThermo-FisherN114822-(N-(7-Nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4-yl)amino)-23,24-Bisnor-5-cholen-3β-Ol
PBSSigma-AldrichP3813phosphatgepuffert  Kochsalzlösung
PEG 8000Sigma-Aldrich202452-250GPolyethylenglykol
PMASigma-Aldrich79346Phorbol 12-Merystat B-Acetat.
R10hauseigenesRPMI 1640, ergänzt mit 10 % fötalem Rinderserum und 5 % Penicillin/Streptomycin.
RPMI 1640Sigma-AldrichR8758RPMI 1640 mit 2 mM L-Glutamin mit 1,5 g/l Natriumbicarbonat und 4,5 g/l Glukose
THP-1 ZellenSigma-AldrichATCC, #TIB-202Monozyten-ähnliche Linie, die aus der Leukämie eines einjährigen Babys gewonnen
Tween 80Sigma-AldrichP1754
wurde

Referenzen

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