Isolierung, Reinigung und Differenzierung von Osteoclast-Laufläufern aus der Rattenmarkierung

Zusammenfassung

Osteoklasten sind gewebespezifische Makrophage-Polykaryonen, die aus der monozytenmakrophären Linie hämatopoietischer Stammzellen abgeleitet werden. In diesem Protokoll wird beschrieben, wie Knochenmarkzellen isoliert werden können, so dass große Mengen an Osteoklasten gewonnen werden, während gleichzeitig das Unfallrisiko in traditionellen Methoden reduziert wird.

Zusammenfassung

Osteoklasten sind große, multinuclevere und knochresorbierende Zellen der Monozyten-Mrophage-Linie, die durch die Verschmelzung von Monozyten oder Makrophagen gebildet werden. Exzessiver Knochenabbau ist einer der wichtigsten zellulären Mechanismen, die zu osteolytischen Erkrankungen führen, darunter Osteoporose, Parodontitis und periprothetische Osteolyse. Die wichtigste physiologische Funktion von Osteoklasten besteht darin, sowohl die hydroxyapatite Mineralkomponente als auch die organische Matrix des Knochens zu absorbieren und so das charakteristische Resorptionsbild auf der Knochenoberfläche zu erzeugen. Es gibt relativ wenige Osteoklasten im Vergleich zu anderen Zellen im Körper, vor allem in erwachsenen Knochen. Neuere Studien konzentrierten sich darauf, wie man reifere Osteoklasten in weniger Zeit erhält, was schon immer ein Problem war. In Laboren haben sich mehrere Verbesserungen der Isolations-und Kulturtechniken entwickelt, um reifere Osteoklasten zu erhalten. Hier führen wir eine Methode ein, die das Knochenmark in kürzerer Zeit und mit weniger Aufwand im Vergleich zum herkömmlichen Verfahren isoliert, mit einem speziellen und einfachen Gerät. Durch den Einsatz der Dichte-Gradientenzentrifugation erhalten wir große Mengen voll differenzierter Osteoklasten aus dem Rattenknochenmark, die durch klassische Methoden gekennzeichnet sind.

Einleitung

Knochen-Haffinase ist ein komplexer physiologischer Prozess, der durch knochenförmige Osteoklasten und knochenbildende Osteoblasten 1reguliert wird. Ein Gleichgewicht zwischen osteoblastischer und osteolastischer Aktivität, die durch Osteoblasten bzw. Osteoklasten vermittelt wird, ist für die Erhaltung der Knochengesundheit und der Homöostase von entscheidender Bedeutung, da Störungen in der Knochenhomöose zu Knochenkrankheiten führen können, wie Als abnormales Knochenwachstum oder Verlust der Knochendichte. Als einzigartige Knochenresorptionszellen sind Osteoklasten wichtig bei Krankheiten, die mit abnormer Knochenzerstörung zusammenhängen, darunter Osteoporose, Parodontitis und periprothetische Osteolyse^2,3.

Die Entwicklung einer Osteoclast-Lunst-Kultur ist vor allem in zwei Stufen unterteilt. Die von Boyde et al^{. 4} und Chambers et al^{. 5} errichteten Methoden komponierten die erste Etappe in den 1980er Jahren. Sie erhielten relativ reichlich Osteoklasten aus den Knochen von neugeborenen Tieren, was die schnelle Umbauzeit ist. Osteoklasten werden freigesetzt, indem sie die Knochen in einem speziellen Medium zersplittern und rühren. Die Zellen, die durch diese Methode gewonnen werden, sind jedoch in der Menge und Reinheit niedrig. Die zweite Stufe war die Entwicklung von Langstreckenkulturen der Osteoklute-Bildung, wobei hämatopoetische Abstammungszellenaus dem Knochenmark 6 verwendet wurden. Zytokine, wie 1α, 25-Dihydroxyvitamin D3, Prostaglandin E2 (PGE-2) und Parathyroid-Hormon (PTH), die in das Kulturmedium aufgenommen werden, wirken durch das System von Osteoblasts/Stromzellen, um Osteoklastbildung zu stimulieren^7,8 . Die Reinheit und Menge der durch diese Methode gewonnenen Osteoklasten kann jedoch nicht den Anforderungen der modernen molekularbiologischen Forschung entsprechen. Dann, die Entdeckung der Makrophage Kolonie-stimulierenden Faktor (M-CSF) und Rezeptor-Aktivator für Kernfaktor--B-Ligand (RANKL) machen die Osteoclastogenese einfacher^{9,10,11, und}die Methode der Verwendung M-CSF und RANKL, um die Osteoklute-Formation direkt zu stimulieren, ist auf der ganzen Welt weit verbreitet. Allerdings gibt es noch einige Details in der Methodik, die verbessert werden müssen.

Derzeit ist die am häufigsten verwendete Osteoclast-Kultur-Methode, wie sie von Marino et al. 12 und Pei et al.¹³beschrieben wird, oft die Entfernung des umgebenden Gewebes um den Knochen erfordert und verwendet eine sterilisierte Nadel, um die Markenhöhle mit Abgeschlossene Medien. Es gibt einige Nachteile dieses Prozesses, einschließlich der Tatsache, dass (1) die Entfernung des umgebenden Gewebes um den Knochen erfordert viel Zeit und große chirurgische Technik, (2) die Knochen sind zerbrechlich und kann zu Knochenmarkabfluss führen, (3) die Knochenmarkhöhle könnte Zu klein, um zu spülen, und (4) es besteht die Gefahr einer Nadelstichverletzung. Um diese Probleme zu vermeiden, zentrifugen wir die Rohre, die die Knochen enthalten, für Knochenmark, anstatt das Knochenmark zu spülen. Hier führen wir eine stabile und sichere Methode ein, die das Knochenmark in kürzerer Zeit und mit weniger Aufwand im Vergleich zum herkömmlichen Verfahren isoliert. Zusammen mit der Verwendung von Dichtegradientenzentrifugation erhaltenwir große Mengen voll differenzierter Osteoklasten in vitro.

Protokoll

Alle Methoden, die die hier beschriebenen Tiere betreffen, werden vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) der Nanjing University of Chinese Medicine genehmigt.

1. Einrichtung

1. Bereiten Sie mehrere längs geschnittene 1 ML-Pipettenspitzen (1 cm) und mehrere 1,5 ml Mikrozentrifugenröhren vor. Die Pipette-Spitzen und Mikrozentrifugenröhren auf 103 kPa und 121 ° C 20 min anbraten und für ihre sterile Sorte sorgen.
2. Bereiten Sie eine Schachtel mit Eis und mehrere sterile Geschirr, um die isolierten Gewebe während der Isolation zu erhalten.

2. Vorbereitung von Kulturmedium

1. Bereiten Sie das gesamte Kulturmedium vor. Verwenden Sie ein minimales, essentielles Medium Alpha (α-MEM), das eine endgültige Lösung von 1% des Penicillin/Streptomycin und 10% fetaler Rinderserum (FBS) enthält.
2. Filtern Sie die Medien von Schritt 2.1 mit einem 0,22 μm Filter.
3. Bereiten Sie das Knochenmark-Induktionsmedium vor. Für 50 mL der Lösung, fügen Sie 125 μL von M-CSF bei einer Konzentration von 10.000 ng/mL (Tabelleder Materialien) zu 49.875 mL des kompletten Kultur-Mediums (ab Schritt 2.2) hinzu, um eine endgültige Lösung von 25 ng/mL M-CSF zu machen.
4. Bereiten Sie das Osteoklast Induktionsmedium vor. Für 50 mL der Lösung, fügen Sie 500 μL RANKL bei einer Konzentration von 10.000 ng/mL (Tabelleder Materialien) zu 49,5 mL Knochenmarkinduktionsmedium (ab Schritt 2.3), um eine endgültige Lösung von 25 ng/mL M-CSF und 100 ng/mL RANKL zu machen.

3. Isolierung von Knochen mMarrow-abgeleiteten Zellen

1. euthanasie
   1. Vier Sprague Dawley-Ratten durch CO₂ -Inhalation, gefolgt von Gebärmutterhalskrebs, und eintauchen in 75% Ethanol für 1 min.
      NOTE: Sorgen Sie dafür, dass Tiere gleichgeschlechtlich und ähnlich alt sind. Es wird empfohlen, dass Tiere, die 2 bis 3 Wochen alt sind, Zwei Ratten sind für die Zentrifugalmethode vorbereitet, die anderen beiden für die traditionelle Methode.
2. Traditionelle Methode
   1. Legen Sie die Tiere auf ein Desinfektionsmittel in eine untere Position. Machen Sie einen kleinen Schnitt (ca. 1 cm) am proximalen Oberschenkel, um die Haut mit steriler Schere zu schälen.
   2. Die Oberschenkel und Tibien zerlegen. Schneiden Sie die bilateralen Anschlussteile um Hüfte, Knie und Knöchelgelenke, um die Tibien und Oberschenkel vorsichtig und sanft zu isolieren. Teile des Gewebes um den Knochen abschneiden; Seien Sie gründlich. Die Tibien und Oberschenkel während des gesamten Prozesses nicht zerbrechen.
   3. Die gereinigten Knochen in ein Gericht mit 5 ml des gesamten Kulturmediums geben. Schneiden Sie den langen Knochen mit einer sterilen Schere ab und verwenden Sie eine 1 mL Spritzennadel, um die Markenhöhle vorsichtig mit 10 ml kompletter Medien zu spülen, bis die Markenhöhle weiß wird.
   4. Die Zellaufhängung von Schritt 3.2.3 auf ein 50 mL-Rohr übertragen und dann mit einem 70 μm-Trost filtern, um das restliche Gewebe zu entfernen.
   5. Fügen Sie 5 ml roten Blutkörperchen Liturnpuffer (Tabelle der Materialien) zur Zellfederung hinzu. Die Zellen 8 Minuten auf Eis einweichen. Dann zentrifugen die Zellen bei 250 x g für 5 Minuten, um das Zellpellet zu erzeugen.
   6. Aspirieren Sie das Medium ab und lassen Sie die Zellen in 10 ml kompletter Medien wieder aufführen. Zählen Sie die Zellen mit einem Hämozytometer und berechnen Sie die Zeit, die auf den Stufen aus diesem Abschnitt verbracht wird (Abschnitt 3.2).
3. Verbesserte Methode
   1. Legen Sie die Tiere auf ein Desinfektionsmittel in eine untere Position. Machen Sie einen kleinen Schnitt (ca. 1 cm) am proximalen Oberschenkel mit steriler Schere, um die Haut zu schälen.
   2. Die Oberschenkel und Tibien zerlegen. Richtig abschneiden Sie den Teil des Gewebes um den Knochen (keine Notwendigkeit, vollständig zu entfernen). Die Tibien und Oberschenkel während des gesamten Prozesses nicht zerbrechen.
   3. Die Tibien und Oberschenkel mit 12 ml Phosphat-gepufferten Saline (PBS) abspülen und halbieren. Die geschnippten Tibien und Oberschenkel in eine 1 mL-Pipette-Spitze (ab Schritt 1.1) legen, die dann in ein mikrozentrifugenarmes Rohr gesteckt wird und bei 4 ° C mit 3x x g zentrifugiert ist.
   4. Nach der Zentrifugation die Pipette-Spitze mit dem Knochen entfernen und das Knochenmark im Rohr lassen. 200 μL kompletter Medien in das Mikrozentrifugenrohr geben und das Pipettieren wiederholen, um das Mark gründlich zu zersetzen.
   5. Die Zellaufhängung von Schritt 3.3.4 auf ein 50 mL-Rohr übertragen und dann mit einem 70 μm-Trost filtern, um das restliche Gewebe zu entfernen.
   6. Zählen Sie die Zellen mit einem Hämozytometer und berechnen Sie die Zeit, die für die Schritte aus diesem Abschnitt verbracht wird (Abschnitt 3.3).

4. Reinigung durch Diversitätstrick-Zentrifugation

1. Stellen Sie die Zellaufhängung von Schritt 3.2.6 oder Schritt 3.3.5 auf 2 mL mit α-MEM ein.
2. Bereiten Sie ein steriles, versteinertes Zentrifugalrohr vor und fügen Sie dem Rohr 8 mlder Zelltrennung (Material-Tabelle) hinzu.
3. Fügen Sie die Zellaufhängung von Schritt 4.1 zur Zelltrennung hinzu. Die Pipette-Spitze an die Innenfläche des Rohres kleben und eine 45 ° an die Innenfläche halten. Nach dem Hinzufügen der Aufhängung wird eine klare Grenze zwischen der Ebene der Zellen und der Trennlösung angezeigt.
   NOTE: Die Operation erfordert große Sorgfalt und muss langsam durchgeführt werden.
4. Zentrifuge die Schichtlösung in einer horizontalen Zentrifuge bei 500 x g für 30 min. Nach der Zentrifugation die wolkige zweite Schicht, die die Zielzellen enthält, von oben nach unten absaugen.
   NOTE: Die Beschleunigung und Verlangsamung der Zentrifuge vor der Zentrifugation abbrechen. Es gibt sechs Schichten nach der Zentrifugation; Die erste Schicht ist die verdünnige Schicht, die zweite Schicht ist die Monozytenschicht, die dritte Schicht ist die Schicht der mononuklaren Zellen, die vierte Schicht ist die transparente Trennflüssigkeit eine Schicht, die fünfte ist die granulare Zellschicht, und die sechste Schicht ist die rote Zelle. Schicht.
5. Übertragen Sie die Zielzellen auf ein neues Rohr. Fügen Sie 5 ml PBS, um die Zellen 3x zu waschen. Nach jedem Waschen Zentrifugen die Zielzellen bei 250 x g für 5 min, um das Zellpellet zu erzeugen.
6. Das Zellpellet mit dem Knochenmark-Induktionsmedium wiederverwenden und die Zellen mit einem Hämozytometer zählen. Fügen Sie 5 – 8 ml Knochenmark-Induktionsmedium ab Schritt 2.3 hinzu, um eine endgültige Zelllösung von 300.000 Cells/mL zu erhalten. Fügen Sie 1 mL zu jedem Brunnen einer 24-Well-Platte hinzu.

5. Kultur und Differenzierung

1. Nach dem Inkubieren der Zellen bei 37 ° C für 24 Stunden sanft absaugen und jedem Brunnen 1 mL des Osteoklute-Induktionsmediums hinzufügen. Die Platte sanft anrichten und bei 37 ° C in einen Inkubator geben.
2. Ändern Sie alle 48 Stunden das Osteoklast Induktionsmedium. Ändern Sie dabei 0,8 mL des Mediums im Brunnen und rütteln Sie die Platte sanft an.
   NOTE: Große, motitile und mulmausspaltige Osteoklasten sollten im Brunnen unter einem umgekehrten Mikroskop beobachtet werden, typischerweise um die Tage 4 – 6.

6. Tartratesistente Säure-Phosphatase Staining

NOTE: Multinucleate Osteoklasten werden nach 4 – 6 Tagen anwesend sein, wenn die Induktion (Abschnitt 5) erfolgreich ist.

1. Bereiten Sie die fixierende Lösung vor, indem Sie 4 mL von 37% Formaldehyd, 32,5 ml Aceton und 12,5 ml Citratlösung kombinieren. Speichern Sie die Fixlösung bei 4 ° C.
2. Bereiten Sie die tartrat-resistente Säure-Phosphatase (TRAP) Fleckenlösung (Tabelle der Materialien) durch Zugabe von 50 μL Natriumnitrit, 50 μL von Fast Garnet GBC Basislösung, 50 μL von Naphthol AS-BI Phosphat-Lösung, 200 μL einer Acetatlösung und 100 μL eines Tartratlösung in 4,55 mL deionisiertes Wasser, das auf 37 ° C vorgewärmt wird. Dann sanft durch Umkehrung für 1 Minute mischen, und 2 min stehen lassen.
3. Nach der erfolgreichen Induktion von Osteoklasten das Medium absaugen und die Brunnen 3x mit PBS sanft waschen.
4. Bringen Sie die fixierende Lösung auf Raumtemperatur (RT). Fügen Sie 2 ml fixierende Lösung zu den Brunnen für 30 s, und lassen Sie die Zellen nicht trocknen.
5. Die fixierende Lösung aufsaugen, 3x vorsichtig mit deionisiertem Wasser waschen, das auf 37 ° C vorgewärmt ist, und dann das Wasser absaugen.
6. 2 mL TRAP-Fleckenlösung für 1 h bei 37 ° C hinzufügen und die Probe im Dunkeln halten.
7. Nach 1 Stunde den Fleck absaugen und die Probe vorsichtig mit deionisiertem Wasser waschen, das auf 37 ° C vorgewärmt ist, und dann das Wasser absaugen.
8. In einer Hämatoxylin-Lösung 1 min für 1 min konverfecken. Nach der Färbung die Hämatoxylinlösung absaugen und die Zellen 3x vorsichtig mit deionisiertem Wasser waschen.
9. Bild-Osteoklasten mit Brightfield-Mikroskopie, und TRAP⁺ -Zellen mit drei oder mehr Kernen erscheinen lila.

7. Knochenresorption wird mit Toluidine Blue Staining durchgeführt

1. Vorbehandlung der Knochenscheiben
   1. Schneiden Sie die frische Rinder-Oberschenkelknochenkortex in 2 cm dicke Scheiben entlang der Längsachse mit mikroelektrischer Säge. Anschließend die Scheiben mit Hartgewebsschleifern in 80 μm schneiden und mahlen.
   2. Die Scheiben in einem Becher mit deionisiertem Wasser und 100 Hz Ultraschall für 1 Stunde waschen und 3x wiederholen.
   3. Die Scheiben 2 Stunden lang in 75% Alkohol eintauchen. Dann saugen Sie den Alkohol ab und setzen Sie jede Seite der Scheiben ultraviolettem Licht für 1 h auf einer sauberen Plattform aus.
   4. Bevor Sie die Zellen pflanzen, tauchen Sie die Scheiben mindestens 2 Stunden in das Kulturmedium ein.
2. Toluidine blaue Färbung
   1. Die vorbehandelten Knochenscheiben in die 24-Well-Platte geben. Pflanzen Sie die Zellen, wie in Schritt 4.6 erwähnt, und induzieren Sie die Zellen, wie in Abschnitt 5 erwähnt.
   2. Nach dem Auftreten von Osteoklasten (nach 4 – 6 Tagen), waschen Sie die Scheiben mit 1 ml von 0,25 M Ammoniumhydroxid, und klanglieren sie 3x für je 5 Minuten, um die lebenden Zellen zu entfernen, um die Analyse der Resorptions-Gruben auf den Knochenscheiben zu ermöglichen. Dann das Ammoniumhydroxid entfernen und die Scheiben mit 1 ml von 1% (wt/vol) Toluidin-blaue Lösung pro Scheibe für 2 min verfärben.
   3. Die Scheiben mit PBS waschen. Wählen Sie nach dem Zufallsprinzip fünf Ansichten aus und führen Sie eine semiquantitative Analyse des Resorptionsbereichs mit Hilfe einer Bildanalyse-Software durch.

8. Rasterelektronenmikroskopie

1. Die Knochenscheiben von Schritt 7.2.1 mit 1 mL von 2,5% Glutaraldehyd pro Scheibe für 2 Stunden bei RT vorbereiten und dann die Scheiben 3x für 3 min mit je 1 M Ammoniumhydroxid sondieren, um die Zellen zu entfernen und das Ammoniumhydroxid zu entfernen.
2. Die Knochenscheiben 3x für je 12 min mit PBS waschen.
3. Fixieren Sie die Knochenscheiben mit 1% Osminsäure für 2 Stunden bei RT.
4. Die Ethanol-Gradientenzufuhr mit 50%, 70%, 80%, 90% und 95% Ethanol für 15 Minuten für jeden Farbverlauf durchführen und dann das Ethanol 15 Minuten lang durch Isoamylacetat ersetzen.
5. Die Scheiben mit Gold-Palladium bedecken und dann durch das Scannen der Elektronenmikroskopie analysieren.

9. Immunfluoreszenz-Staining des Rektors von Calcitonin

NOTE: Multinucleate Osteoklasten werden nach 4 – 6 Tagen anwesend sein, wenn die Induktion erfolgreich ist (Abschnitt 5).

1. Das Medium abspülen und den Brunnen 3x mit PBS vorsichtig waschen.
2. Fixieren Sie die Zellen 10 min mit 4% Paraformaldehyd, das auf 4 ° C vorgekühlt ist.
3. 1 mL PBS mit 0,3% nonionischem Tensid pro Brunnen für 30 Minuten auf Eis hinzufügen. Dann die PBS mit 0,3% nonionischem Tensid absaugen und 1 mL PBS mit 5% FBS pro Brunnen für 30 Minuten auf Eis hinzufügen.
4. Die PBS abspülen und die Membranen mit Anti-Kalcitonin-Rezeptor (Anti-CTR) bei einer 1:100-Verdünnung in PBS bei 4 ° C über Nacht inkubieren.
5. Aspirieren Sie von der Lösung ab und inkubieren Sie die Membranen mit Alexa-488-konjugierten Anti-Kaninchen-IgG-Antikörpern bei einer 1:1000-Verdünnung in PBS für 1 h bei RT.
6. Aspirieren Sie die Lösung ab und waschen Sie die Zellen 3x mit PBS sanft. Gegenüber der Kerne mit Hoechst 33342 Fleck für 3 min bei RT.
7. Aspirieren Sie die Lösung ab und waschen Sie die Zellen 3x mit PBS. Beobachten Sie die Intensität von CTR durch Fluoreszenzmikroskopie.

Ergebnisse

Der Zweck des Protokolls war es, eine große Anzahl von Osteoklastvorläufern bequem zu isolieren und zu reinigen und Osteoklasten erfolgreich zu induzieren. Ergänzend mit M-CSF und RANKL wurden an den Tagen 5 – 6 riesige Osteoklasten zu sehen sein. Die Bildung von Osteoklasten wurde durch die TRAP-Färbung(Abbildung 1A) erfolgreich identifiziert. Große und violette Zellen galten als TRAP-positive Zellen mit mehreren Kernen (typischerweise drei Kerne). Durch die...

Diskussion

Die Fähigkeit, Osteoklasten in vitro zu erhalten und zu studieren, ist eine entscheidende und grundlegende Fähigkeit für jeden Forscher, der den Knochenstoffwechsel untersuchen möchte, was helfen kann, die Mechanismen von knochenabsorbierenden Krankheiten zu verstehen und neue therapeutische Wirkstoffe zu entwickeln. Die vorliegende Studie beschrieb ein Protokoll mit einigen Änderungen, die auf früheren Methoden basieren.

Durch den Einsatz von Pipette-Spitzen und Mikrozentrifugenröhren zur Gew...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Saure Phosphatase, Lekozyte (TRAP) Kit	Sigma-Aldrich	387A
Automatischer Hartgewebeschneider	Lecia	RM2265
Rinder Femurknochen			Von uns gekauft
Zellinkubator	Heraus	BB16/BB5060
Fötales Rinderserum	Sarana	s-fbs-au-015
Ziege Anti-Kaninchen IgG H& L (Alexa Fluor 488)	Abcam	ab150077
Hartgewebeschleifer	Lecia	SP-2600
Histopaque Kit	TianJing Haoyang	TBD2013DR	Verkieseltes Zentrifugalröhrchen und Zelltrennungslösung
Hochest33342	Sigma-Aldrich	B2261
Inverses Phasenkontrastmikroskop	Olympus	CKX31
Inverses Fluoreszenzmikroskop	Lecia	DMI-3000
MEM, ohne Glutamin	Gibco	11090-081
Penicillin-Streptomycin, flüssig	Gibco	15140122
Kaninchen Anti-Calcitonin-Rezeptor	Bioss	bs-0124R
Rekombinante Ratte M-CSF	PeproTech	400-28
Rekombinanter Ratten-sRANK-Ligand	PeproTech	400-30
Puffer für die Lyse roter Blutkörperchen	Absin	abs47014932
Rasterelektronenmikroskopie	FEI	Quanta 200
Toluidinblau	Sigma-Aldrich	89649