Isolierung, Reinigung und Differenzierung von Osteoclast-Laufläufern aus der Rattenmarkierung

Zusammenfassung

Osteoklasten sind gewebespezifische Makrophage-Polykaryonen, die aus der monozytenmakrophären Linie hämatopoietischer Stammzellen abgeleitet werden. In diesem Protokoll wird beschrieben, wie Knochenmarkzellen isoliert werden können, so dass große Mengen an Osteoklasten gewonnen werden, während gleichzeitig das Unfallrisiko in traditionellen Methoden reduziert wird.

Zusammenfassung

Osteoklasten sind große, multinuclevere und knochresorbierende Zellen der Monozyten-Mrophage-Linie, die durch die Verschmelzung von Monozyten oder Makrophagen gebildet werden. Exzessiver Knochenabbau ist einer der wichtigsten zellulären Mechanismen, die zu osteolytischen Erkrankungen führen, darunter Osteoporose, Parodontitis und periprothetische Osteolyse. Die wichtigste physiologische Funktion von Osteoklasten besteht darin, sowohl die hydroxyapatite Mineralkomponente als auch die organische Matrix des Knochens zu absorbieren und so das charakteristische Resorptionsbild auf der Knochenoberfläche zu erzeugen. Es gibt relativ wenige Osteoklasten im Vergleich zu anderen Zellen im Körper, vor allem in erwachsenen Knochen. Neuere Studien konzentrierten sich darauf, wie man reifere Osteoklasten in weniger Zeit erhält, was schon immer ein Problem war. In Laboren haben sich mehrere Verbesserungen der Isolations-und Kulturtechniken entwickelt, um reifere Osteoklasten zu erhalten. Hier führen wir eine Methode ein, die das Knochenmark in kürzerer Zeit und mit weniger Aufwand im Vergleich zum herkömmlichen Verfahren isoliert, mit einem speziellen und einfachen Gerät. Durch den Einsatz der Dichte-Gradientenzentrifugation erhalten wir große Mengen voll differenzierter Osteoklasten aus dem Rattenknochenmark, die durch klassische Methoden gekennzeichnet sind.

Einleitung

Knochen-Haffinase ist ein komplexer physiologischer Prozess, der durch knochenförmige Osteoklasten und knochenbildende Osteoblasten 1reguliert wird. Ein Gleichgewicht zwischen osteoblastischer und osteolastischer Aktivität, die durch Osteoblasten bzw. Osteoklasten vermittelt wird, ist für die Erhaltung der Knochengesundheit und der Homöostase von entscheidender Bedeutung, da Störungen in der Knochenhomöose zu Knochenkrankheiten führen können, wie Als abnormales Knochenwachstum oder Verlust der Knochendichte. Als einzigartige Knochenresorptionszellen sind Osteoklasten wichtig bei Krankheiten, die mit abnormer Knochenzerstörung zusammenhängen, da....

Protokoll

Alle Methoden, die die hier beschriebenen Tiere betreffen, werden vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) der Nanjing University of Chinese Medicine genehmigt.

1. Einrichtung

1. Bereiten Sie mehrere längs geschnittene 1 ML-Pipettenspitzen (1 cm) und mehrere 1,5 ml Mikrozentrifugenröhren vor. Die Pipette-Spitzen und Mikrozentrifugenröhren auf 103 kPa und 121 ° C 20 min anbraten und für ihre sterile Sorte sorgen.
2. Bereiten Sie eine Schachtel mit Eis und mehrere sterile Geschirr, um die isolierten Gewebe während der Isolation zu erhalten.

2. Vorbereitung von Kulturmedium

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Ergebnisse

Der Zweck des Protokolls war es, eine große Anzahl von Osteoklastvorläufern bequem zu isolieren und zu reinigen und Osteoklasten erfolgreich zu induzieren. Ergänzend mit M-CSF und RANKL wurden an den Tagen 5 – 6 riesige Osteoklasten zu sehen sein. Die Bildung von Osteoklasten wurde durch die TRAP-Färbung(Abbildung 1A) erfolgreich identifiziert. Große und violette Zellen galten als TRAP-positive Zellen mit mehreren Kernen (typischerweise drei Kerne). Durch die.......

Diskussion

Die Fähigkeit, Osteoklasten in vitro zu erhalten und zu studieren, ist eine entscheidende und grundlegende Fähigkeit für jeden Forscher, der den Knochenstoffwechsel untersuchen möchte, was helfen kann, die Mechanismen von knochenabsorbierenden Krankheiten zu verstehen und neue therapeutische Wirkstoffe zu entwickeln. Die vorliegende Studie beschrieb ein Protokoll mit einigen Änderungen, die auf früheren Methoden basieren.

Durch den Einsatz von Pipette-Spitzen und Mikrozentrifugenröhren zur Gew.......

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Saure Phosphatase, Lekozyte (TRAP) Kit	Sigma-Aldrich	387A
Automatischer Hartgewebeschneider	Lecia	RM2265
Rinder Femurknochen			Von uns gekauft
Zellinkubator	Heraus	BB16/BB5060
Fötales Rinderserum	Sarana	s-fbs-au-015
Ziege Anti-Kaninchen IgG H& L (Alexa Fluor 488)	Abcam	ab150077
Hartgewebeschleifer	Lecia	SP-2600
Histopaque Kit	TianJing Haoyang	TBD2013DR	Verkieseltes Zentrifugalröhrchen und Zelltrennungslösung
Hochest33342	Sigma-Aldrich	B2261
Inverses Phasenkontrastmikroskop	Olympus	CKX31
Inverses Fluoreszenzmikroskop	Lecia	DMI-3000
MEM, ohne Glutamin	Gibco	11090-081
Penicillin-Streptomycin, flüssig	Gibco	15140122
Kaninchen Anti-Calcitonin-Rezeptor	Bioss	bs-0124R
Rekombinante Ratte M-CSF	PeproTech	400-28
Rekombinanter Ratten-sRANK-Ligand	PeproTech	400-30
Puffer für die Lyse roter Blutkörperchen	Absin	abs47014932
Rasterelektronenmikroskopie	FEI	Quanta 200
Toluidinblau	Sigma-Aldrich	89649