Einzelne Liposomen Messungen für das Studium der Protonen-Pumpen Membran Enzyme mit Elektrochemie und Fluoreszenz-Mikroskopie

Ievgen Mazurenko; Nikos S. Hatzakis; Lars J.C. Jeuken

doi:10.3791/58896

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Methodenartikel

Einzelne Liposomen Messungen für das Studium der Protonen-Pumpen Membran Enzyme mit Elektrochemie und Fluoreszenz-Mikroskopie

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DOI:

10.3791/58896

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21. Februar 2019

Ievgen Mazurenko¹ , Nikos S. Hatzakis² , Lars J.C. Jeuken¹

¹School of Biomedical Sciences & the Astbury Centre for Structural Molecular Biology, University of Leeds, ²Department of Chemistry and Nano-Science Center, University of Copenhagen

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Hier präsentieren wir ein Protokoll, um den molekularen Mechanismus der Protonen-Translokation über Lipidmembranen der einzelnen Liposomen, studieren mit Cytochrom Bo₃ als Beispiel. Kombination von Elektrochemie und Fluoreszenz-Mikroskopie, pH-Änderungen in das Lumen der einzelne Vesikel, mit einzelnen oder mehreren Enzym können individuell erkannt und analysiert werden.

Zusammenfassung

Protonen-Pumpen Enzyme des Elektrons übertragen Ketten paar Redoxreaktionen an Protonen-Translokation durch die Membran, erstellen eine Proton-treibende Kraft für die ATP-Produktion verwendet. Der amphiphilen Charakter der Membranproteine erfordert besonderes Augenmerk auf deren Handhabung und Rekonstitution in die natürliche Lipid-Umwelt ist unverzichtbar, wenn Transport Membranverfahren wie Protonen-Translokation zu studieren. Hier zeigen wir eine Methode, die für die Untersuchung des Protonen-Pumpen-Mechanismus der Membran Redox Enzyme verwendet worden ist, Cytochrom Bo₃ aus Escherichia coli als Vorbild nehmen. Eine Kombination der Elektrochemie und Fluoreszenz-Mikroskopie dient zur Steuerung der Redox-Status des Quinone Pool und Monitor pH-Wert ändert sich in das Lumen. Durch die räumliche Auflösung der Fluoreszenz-Mikroskopie können Hunderte von Liposomen gleichzeitig gemessen werden, während die Enzym-Inhalt auf ein einziges Enzym oder Transporter pro Liposomen verkleinert werden kann. Die jeweiligen einziges Enzym Analyse kann Muster in der Enzym-funktionale Dynamik zeigen, die sonst durch das Verhalten der gesamten Bevölkerung verborgen sein könnte. Wir fügen Sie eine Beschreibung eines Skripts zur automatischen Bildanalyse.

Einleitung

Informationen über Enzym Mechanismen und Kinetik ist in der Regel auf das Ensemble oder makroskopischen Ebene mit Enzym Bevölkerung in die Tausende bis Millionen von Molekülen, erhalten wo Messungen einen statistischen Durchschnitt darstellen. Es ist jedoch bekannt, dass komplexe Makromoleküle wie Enzyme Heterogenität in ihrem Verhalten zeigen können und molekulare Mechanismen beobachtet auf der Ensemble-Ebene nicht unbedingt für jedes Molekül gelten. Solche Abweichungen der einzelnen Molekül-Skala wurden weitgehend durch Studien der einzelnen Enzyme mit einer Vielzahl von Methoden, die in den letzten zwei Jahrzehnten¹bestätigt. Vor allem, wurd....