Quantifizierung der heterogenen Verteilung der synaptischen Protein im Gehirn Maus mit Immunfluoreszenz

Summary

Hier beschreiben wir einen quantitativen Ansatz zur Bestimmung der Verteilung der synaptischen Protein im Verhältnis zu einer Marker Protein mit Immunfluoreszenz-Färbung, konfokalen Mikroskopie und Computer-basierte Analyse.

Abstract

Die Anwesenheit, Abwesenheit oder Ebenen der spezifischen synaptischen Proteine können synaptische Übertragung stark beeinflussen. Neben der Erläuterung der Funktion eines Proteins, ist es wichtig, auch die Verteilung bestimmen. Hier beschreiben wir ein Protokoll mit Immunfluoreszenz, konfokale Mikroskopie und Computer-basierte Analyse zur Bestimmung der Verteilung der synaptischen Protein Mover (auch TPRGL oder SVAP30 genannt). Wir vergleichen die Verteilung der Mover mit derjenigen der synaptischen Vesikel Protein Synaptophysin, wodurch Bestimmung der Verteilung der Mover in einer quantitativen Weise im Verhältnis zu der Fülle der synaptischen Vesikel. Insbesondere könnte möglicherweise diese Methode implementiert werden, um Vergleich der Verteilung von Proteinen mit verschiedenen Antikörpern oder Mikroskope oder über verschiedene Studien zu ermöglichen. Unsere Methode umgeht die inhärente Variabilität der immunofluorescent Verfärbungen durch nachgeben ein Verhältnis eher als absolute Fluoreszenz Ebenen. Darüber hinaus ermöglicht die Methode, die wir beschreiben die Forscher die Verteilung eines Proteins auf verschiedenen Ebenen zu analysieren: aus ganzen Gehirnscheiben in Gehirnregionen zu verschiedenen Teilregionen in einem Hirnareal, wie die verschiedenen Schichten des Hippocampus oder sensorische Cortex. Mover ist ein Wirbeltier-spezifische Protein, das synaptischen Vesikel zugeordnet ist. Mit dieser Methode zeigen wir, dass Mover Hirnareale mit hohem in der ventralen Troponema, septal Kerne und die Amygdala, und auch innerhalb einzelner Hirnareale, wie die verschiedenen Schichten des Hippocampus heterogen verteilt ist.

Introduction

Kommunikation zwischen den Nervenzellen geschieht an speziellen Kontaktstellen, die Synapsen genannt. Synapsen enthalten eine Vielzahl von verschiedenen Proteinen, die synaptische Übertragung zu orchestrieren. Einige dieser Proteine zeigen eine heterogene Verteilung im gesamten Nervensystem und sind nicht in jeder Synapse-¹. Ein Beispiel für solche ein Protein ist Munc13, die Grundierung der synaptischen Vesikel beteiligt ist. Es gibt verschiedene Isoformen von Munc13, die das Gehirn²heterogen verteilt sind, und das Vorhandensein oder Fehlen von bestimmten Isoformen beeinflussen kann kurzfristige synaptische Plastizität ....

Protocol

Dieses Protokoll beinhaltet keine Experimente an lebenden Tieren. Experimente mit von Tieren Gehirn Proben erhalten euthanizing stimmten mit den lokalen Tierschutz Behörden (Tierschutzkommission der Universitätsmedizin Göttingen) unter der Zulassungsnummer T 10/30.

Hinweis: Für dieses Protokoll wurden 3 Erwachsene männlichen C57BL/6 Mäusen verwendet.

1. die Probenvorbereitung

1. Bereiten Sie Fixiermittel und 0,1 M Phosphatpuffer (PB; siehe Tabelle 1).
2. Befestigen Sie das Tier durch Transcardial Perfusion, wie Gage Et Al. beschrieben ²⁸. Waschen Sie....

Results

Vertreter, die Muster der verschiedenen Markern Färbung ist in Abbildung 1ersichtlich. Das Muster ist abhängig von der Verteilung des Proteins. Beispiele für fünf Rostro-caudale Ebenen sind in Spalten (A)-(E). Eine repräsentative DAPI-Färbung zeigt sich in der ersten Reihe: DAPI hält sich an die DNA einer Zelle und somit Kerne gefärbt sind. Daraus resultiert eine punktförmige Muster. Regionen mit einer hohen Zelldichte sind h.......

Discussion

Hier präsentiert die Methode zielt darauf ab die Verteilung eines Proteins des Interesses im Verhältnis zu der Fülle von einem Marker Protein mit einer bekannten Verteilung zu quantifizieren. Immunfluoreszenz-Färbung zeigen eine hohe Variabilität der Färbung Intensitäten zwischen verschiedenen Scheiben. Die Quantifizierung der hier beschriebene Ansatz umgeht dieses Problem durch das Verhältnis des Proteins des Interesses an den Durchschnitt in der Hemisphäre zu bestimmen. Daher verschiedenen befleckenden Intensitäten übe.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
1,5 mL Reaktionsgefäße	Eppendorf	30120094
50 mL Reaktionsgefäße	Greiner Bio-One	227261
Multiwell 24 Well	Fisher Scientific	087721H
Kunststoffpipette (Einweg)	Sarstedt	861,176
1000 mL Pipette	Rainin
2 ml Pipette	Eppendorf	3123000012
Vortex Genius 3	IKA	3340001
Menzel Objektträger	Fisher Scientific	10144633CF
Stereoskop	Leica
LSM800	Zeiss		Konfokalmikroskop
Einfriermikrotom	Leica
PBS (10X)	Roche
PFA	Sigma	P6148-1kg
NaCl	BioFroxx	1394KG001
Saccharose	neoFroxx	1104KG001
Gewebe Tek	Sakura	4583	OCT
Na2HPO4	BioFroxx	5155KG001
NaH2PO4	Merck	1,063,460,500
normales Ziegenserum	Merck Millipore	S26-100ML
normales Eselserum	Merck	S30-100ML
Triton X-100	Merck	1,086,031,000
Kaninchen Anti-Mover	Synaptic Systems	RRID: AB_10804285
Meerschweinchen Anti-Synaptophysin Synaptische	Systeme	RRID: AB_1210382
Esel Anti-Kaninchen AF647	Jackson ImmunoResearch	RRID: AB_2492288
Ziege Anti-Maus AF488	Jackson ImmunoResearch	RRID: AB_2337438
Mowiol4-88	Calbiochem
ZEN2 blue Software	Zeiss		Mikroskopie-Software
FIJI	ImageJ		Analysesoftware
Microsoft Excel	Microsoft