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Methodenartikel

In-vitro-Tests zur Bewertung der Migration, Invasion und Proliferation von verewigt menschlichen Ersttrimester-Trophoblast Zelllinien

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DOI:

10.3791/58942

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5. März 2019

 ,  ,  , 
1Department of Obstetrics, Gynecology and Reproductive Sciences, Yale School of Medicine

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Hier präsentieren wir eine hochverfügbare Protokoll für die Bewertung der Zellbewegung in menschlichen Trophoblast Zellen mit drei in-vitro-Tests: der Scratch-Test, Transwell Invasion Assay und der Zelle Verbreitung Assay.

Zusammenfassung

Zelle Bewegung ist eine wichtige Eigenschaft des Trophoblasten während plazentar Entwicklung und frühe Schwangerschaft. Die Bedeutung der richtigen Trophoblast Migration und Invasion zeigt Schwangerschaft Erkrankungen wie der Präeklampsie und intrauteriner Wachstumsretardierung, die mit unzureichenden Trophoblast Einmarsch in das mütterliche Gefäßsystem verbunden sind. Leider, unser Verständnis der Mechanismen, durch die die Plazenta von Migration entwickelt Trophoblasten ist begrenzt. In-vitro-Analyse der Zellwanderung über der Scratch-Test ist ein nützliches Werkzeug bei der Identifizierung von Faktoren, die Trophoblast wandernden Kapazität zu regulieren. Dieser Assay allein definiert jedoch nicht die Zellveränderungen, die veränderte Zelle Migration führen können. Dieses Protokoll beschreibt drei verschiedene in-vitro-Untersuchungen, die gemeinsam verwendet werden, um Trophoblast Zelle Bewegung zu bewerten: der Scratch-Test, die Invasion-Assay und der Verbreitung Assay. Die hier beschriebenen Protokolle können auch für den Einsatz in anderen Zelllinien zur Quantifizierung der Zellbewegung in Reaktion auf Reize geändert werden. Diese Methoden können Forscher, einzelne Faktoren zu identifizieren, die dazu beitragen, die Zellbewegung und bieten eine gründliche Prüfung der möglichen Mechanismen, die offensichtlichen Veränderungen der Zellmigration.

Einleitung

Plazentar Entwicklung ist ein entscheidender Schritt bei der Einrichtung der Schwangerschaft Auswirkungen auf die Gesundheit von Müttern und fetalen. Allerdings ist die mechanistische Grundlage, dieser Vorgang wird, nicht vollständig verstanden. Zellmigration ist ein wichtiger biologischer Prozess, der für die Errichtung und die Funktionen der Plazenta während der Schwangerschaft beiträgt. Nach Implantation der Blastozyste unterscheidet die Trophektoderm in Zotten Trophoblasten, die bedecken die Oberfläche der Chorionzotten und Gas- und Nährstoffaustausch beteiligt sind, und extravillous Trophoblasten (EVTs), die heraus von der Zotten migrieren und dringen in die mütterliche Decidua und Gefäßsystem1. Migration von der EVTs ist essentiell für mütterliche Spirale Arterien Umbau und Einrichtung uteroplazentalen Umlauf um fetale Wachstum2zu unterstützen. Unzureichende Trophoblast Invasion während der Schwangerschaft führt zu abnormalen plazentar Entwicklung und kann dazu beitragen, Komplikationen während der Schwangerschaft wie Präeklampsie, Schwangerschafts-Hypertonie, intrauterine Wachstumsretardierung und Frühgeburt3, 4. Daher ist es wichtig zu bestimmen, die Wege für normale Einpflanzung erforderlich, Verständnis der Faktoren, die Trophoblast Motilität zu beeinflussen.

Trophoblast Migration wird durch ein komplexes Netzwerk von Signalmoleküle, einschließlich angiogenen Faktoren5, Wachstumsfaktoren, Zytokine und Hormone gesteuert. Aufgrund der Einschränkungen des Studiums der Plazenta in-vivo verewigt in-vitro-Untersuchungen mit menschlichen Trophoblast Zellen Linien wurden entscheidend zur Identifizierung von Faktoren, die zu Trophoblast Motilität. Kratzer und Invasion Assays wurden ausgiebig zur quantitativ bewerten die Rolle einzelner Moleküle am Trophoblast Zelle Migration6,7,8. Jedoch während nützlich im Tandem zu untersuchen, wie Änderungen in der Migration durch Änderungen in Zelle Invasivität verursacht werden können, erklären diese beiden Tests nicht zusätzliche Mechanismen, die zu veränderten Zellwanderung beitragen können. Senkung der Rate der Zellproliferation können beispielsweise weniger Zellen zur Migration führen.

Hier beschreiben wir quantitative in-vitro-Methoden zur Bewertung der Trophoblast Migration mit Scratch, Zellproliferation und Zelle Invasion Assays. In der Scratch-Test eine einheitliche Wunde entsteht in einer Zelle monomolekularen Film, und die Wanderung von Zellen, die Lücke durch automatisierte, Time-Lapse Bildgebung der Wunde Größe und Dichte der Zellen in der Wunde gemessen. Die Zelle Verbreitung Assay basiert auf das Verhältnis von Zellen zu jedem Zeitpunkt im Vergleich zu einer bekannten Ausgangspunkt Menge von Zellen berechnen. In der Zelle Invasion Assay Zellen sind auf eine extrazelluläre Matrix-beschichtete Zelle Kultur einfügen Kammer (z.B. Transwell) gesät, und die Anzahl der Zellen, die durch die extrazelluläre Matrix als Reaktion auf die Chemo-Lockstoff eindringen werden gezählt.

Der Scratch-Test ist ein einfaches und effektives Werkzeug, das verwendet wird, um festzustellen, wie die verschiedenen Umweltbedingungen beeinflussen Zellmigration. Die Proliferation und Invasion Assays können anschließend verwendet werden, um den Beitrag der Zellproliferation und Invasivität zu allgemeinen Änderungen in Zelle Migration zu bestimmen. Zusammen bieten diese Assays robuste Messungen der biologischen Prozesse, die zur Zelle Motilität beitragen können. Zwei verewigt Ersttrimester-Trophoblast Zelllinien wurden im beschriebenen Assays, Swan.71 (Sw.71) und HTR-8/SVneo9,10verwendet. Allerdings können diese Tests auch für den Einsatz in anderen Zelltypen, wichtige Modulatoren der Zelle Migration und Invasion zu identifizieren optimiert werden.

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Protokoll

1. Zelle-Vorbereitung

  1. Zellen in T-75 Flaschen in standard Wachstumsmedien bei 37 ° C, 5 % CO2und 95 % Luftfeuchtigkeit zu erhalten.
    Hinweis: In diesen Experimenten verwendeten Zellen wurden die verewigt Ersttrimester-Trophoblast Zellen Linien Swan.71 (Sw.71) und HTR-8/SVneo9,10. Die Sw.71 Zellen wurden in DMEM/F-12 mit 10 % Hitze-inaktivierten fetalen bovine Serum (FBS), 1,0 mM Natrium Pyruvat, 10 mM HEPES, 0,10 mM MEM nicht-essentiellen Aminosäuren, 100 Einheiten/mL Penicillin und 100 µg/mL Streptomycin ergänzt beibehalten. Die HTR-8/SVneo-Zellen waren gepflegt, ergänzt mit 5 % RPMI-1640 Hitze-inaktivierten FBS.
  2. Lassen Sie die Zellen repliziert bis zum Zusammenfluss von 90-100 % erreichen. Mit einer sterilen Gewebekultur Fluss Kapuze, aspirieren Sie die Medien aus der Flasche und waschen Zellen mit 10 mL von sterilen 1 x Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS).
  3. Aspirieren der PBS und 5 mL 1 x (0,05 %) Trypsin-EDTA in den Kolben, um sicherzustellen, dass Zellen von Trypsin abgedeckt werden. Ort-Kolben im Labor Brutschrank bei 37 ° C, 5 % CO2und 95 % Luftfeuchtigkeit gehalten werden, bis alle Zellen von der Unterseite des Kolbens (ca. 5-10 min) gelöst haben.
  4. Fügen Sie 10 mL vorgewärmten Wachstumsmedien in den Kolben, die Trypsin-EDTA zu deaktivieren.

(2) kratzen Assay

  1. Folgenden Schritt 1.4, Samen die entsprechende Anzahl von Zellen in einer 24-Well-Platte, 100 % Zusammenfluss in 48 h zu erreichen.
    Hinweis: Es ist möglich, den Scratchen Test mit einer Vielzahl von verschiedenen Platte Layouts durchführen. Die maximale Anzahl von Brunnen durch die Wunde-Maker-Tool erlaubt ist ein 96-Well-Format.
  2. Am nächste Tag (Tag vor Kratzer Assay), ändern Sie Medien in Phenol-rot freie Medien ergänzt je nach Bedarf, einschließlich Hitze-inaktivierten, Holzkohle Dextran abgestreift FBS.
    Hinweis: Andere Studien haben die Verwendung von Medien mit geringer Konzentration FBS (z. B. 1 %) empfohlen. Zellproliferation, minimieren die als Alternative in diesem Protokoll11verwendet werden können.
  3. Am Tag der Scratch-Test vorbehandeln Sie Zellen für 30 min indem gewünschte Behandlung zu den Medien in jede Vertiefung. Die beschriebenen Experimente nutzte Fahrzeug (1 X PBS) und 100 nM Dexamethason in 1 X PBS verdünnt.
  4. Um einheitliche Wunden verursachen, setzen Sie sterile 10 µL-Pipettenspitzen an den Pins des Werkzeugs Wunde Maker. Senken Sie die Tipps in der ersten Zeile der Brunnen und verschieben Sie die Platte entlang der Strecke von der Wunde Maker, bis die Pipettenspitzen die andere Seite des Brunnens zu erreichen.
    1. Verschieben Sie die Platte wieder in die Ausgangsposition, so dass die Pipettenspitzen, kontinuierlich die Unterseite der Platte zu gewährleisten eine konstante Wunde über den Durchmesser des Brunnens zu berühren. Entfernen Sie und ersetzen Sie die sterile 10 µL Pipettenspitzen und senken Sie die Tipps in die nächste Zeile der Brunnen.
  5. Wiederholen Sie Schritt 2.4, bis alle Brunnen zerkratzt sind.
    Hinweis: Wenn eine Wunde-Maker-Tool nicht verfügbar ist, können die Wunden durch manuell Schaben der Mitte der Brunnen mit einer 10 µL Pipettenspitze erstellt werden.
  6. Aspirieren Sie Medien sorgfältig und waschen Sie vorsichtig Zellen zweimal mit 1 X PBS. Im Anschluss an eine letzte Wäsche fügen Sie ergänzt Phenol-rot kostenlose, abgespeckte oder Low-FBS Medien mit gewünschten Behandlung oder Fahrzeug (wie in Schritt 2.3 verwiesen hinzu).
    Hinweis: HTR-8/SVneo Zellen sollten mit ergänzten Phenol-Red Media gewaschen werden, da mit 1 X PBS waschen Zellen führt zu lösen.
  7. Legen Sie die 24-Well-Platte mit zerkratzten Brunnen in der automatisierten, Time-Lapse Imager (siehe Tabelle der Materialien) in einem Labor-Inkubator bei 37 ° C, 5 % CO2und 95 % Luftfeuchtigkeit gepflegt untergebracht. Bild-Brunnen in regelmäßigen Abständen nach Bedarf damit Zellen Wundheilung (z. B. alle 2 h 72 h) abzuschließen.
  8. Berechnen Sie die Wunde Dichte und Breite von der Software, die automatisierte, Time-Lapse Imager zugeordnet (siehe Tabelle der Materialien). Berechnen Sie die prozentuale Veränderung in der Wunde Größe im Verhältnis zur Größe der Wunde ab, legen Sie die Breite der Wunde zum Zeitpunkt 0 entspricht 100 %. Teilen Sie die Wunde Größe in jeder nachfolgenden Timepoint durch die Wunde Größe zum Zeitpunkt 0 und multiplizieren mit 100 um den Prozentsatz (Abbildung 1) zu erhalten.

(3) Invasion Assay

  1. Folgenden Schritt 1.4, Samen die entsprechende Anzahl von Zellen in 6-Well-Platten damit Zellen 90 % Zusammenfluss in 48 h. Maintain Zellen in einem Labor-Inkubator legen Sie auf 37 ° C, 5 % CO2und 95 % Luftfeuchtigkeit zu erreichen.
  2. Ändern Sie am nächsten Tag Medien in Phenol-rot freie Medien ergänzt je nach Bedarf, einschließlich Hitze-inaktivierten, Holzkohle Dextran abgestreift FBS.
    Hinweis: Zellen können zu diesem Zeitpunkt je nach Versuchsanordnung vorbehandelt werden.
  3. Zu diesem Zeitpunkt, legen Sie das Fläschchen der extrazellulären Matrix 10 mg/mL (siehe Tabelle der Materialien) auf Eis, und lassen Sie es über Nacht im Kühlschrank auftauen.
  4. Am nächsten Tag vor kühlen Invasion Assay liefert indem man 24-Well Platten, Zellkultur einfügt, Mikrozentrifugenröhrchen und Pipettenspitzen im Kühlschrank (4 ° C) für mindestens 2 Stunden vor der Arbeit mit der extrazellulären Matrix.
  5. Verdünnen Sie mit gekühlten Lieferungen in der Gewebekultur-Haube, 10 mg/mL extrazelluläre Matrix 1:1 mit Phenol-Rotfrei-, serumfreie Medien, eine Endkonzentration von 5 mg/mL.
    Hinweis: Immer die Lager und verdünnte extrazelluläre Matrix auf Eis. Das Verhältnis der extrazellulären Matrix, Medien kann anhand der Eigenschaften der im Test verwendeten Zelllinie eingestellt werden.
  6. Fügen Sie mithilfe gekühlte Lieferungen in der Gewebekultur Kapuze 100 μL verdünnt extrazelluläre Matrix zu den Einsätzen (siehe Tabelle der Materialien), die in den 24-Well-Platte platziert wurden. Stellen Sie sicher, dass die Matrix blasenfrei ist. Legen Sie die 24-Well-Platte mit Matrix-beschichteten Wendeschneidplatten im Inkubator bei 37 ° C um die Matrix zu Härten zu ermöglichen.
  7. Prep Zellen für Invasion Assay Zellen mit 1 mL 1 X PBS waschen, Aspirieren der PBS und 500 µL 1 X Trypsin-EDTA in jede Vertiefung hinzufügen. Platz 6-Well-Platte im Labor Brutschrank bei 37 ° C, 5 % CO2und 95 % Luftfeuchtigkeit gehalten werden, bis alle Zellen von der Unterseite der Platte gelöst haben.
  8. Sobald Zellen getrennt haben, fügen Sie 500 µL Phenol-Rotfrei-, serumfreie Medien in jede Vertiefung der trypsiniert Zellen.
  9. Transfer von 1.000 µL freistehende Zellen zum Microcentrifuge Schlauch und Spin-down für 5 min bei 400 X g bei 4 ° c
  10. Aspirieren Sie Medien und Aufschwemmen Zellen in Phenol-Rotfrei-, serumfreie Medien (Volumen wird je nach Konzentration der Zellen). Anzahl Zellen mit Hilfe einer automatisierten Zelle entgegenzuwirken (siehe Tabelle der Materialien) und Lautstärke der Zellsuspension für eine Endkonzentration von 5 x 105 Zellen pro mL.
    Hinweis: Ein Hemocytometer und ein Mikroskop können auch verwendet werden, um Zellen zu zählen.
  11. Fügen Sie 600 μL des kompletten Wachstumsmedien in die Vertiefungen der 24-Well-Platte, die für die Invasion Assay verwendet werden.
    Hinweis: Zusätzliche Chemoattractants oder Behandlungen können das komplette Wachstumsmedium im Brunnen (Unterhaus) hinzugefügt werden. Die beschriebenen Experimente hinzugefügt Fahrzeug (1 X PBS) oder 100 nM Dexamethason verdünnt mit 1 X PBS-Puffer für die untere Kammer.
  12. Ort der vorbeschichtete stecken Sie in jedes gut mit vollständigen Wachstumsmedium, die für die Invasion Assay verwendet werden. Dann fügen Sie 200 μL der Zellen auf der Oberseite jedes vorbeschichtete Zelle einfügen (Oberhaus) für eine Gesamtmenge von 1 x 105 Zellen.
    Hinweis: Als Negativkontrolle für dieser Assay kann die obere Kammer ein gleiches Volumen Phenol-Rotfrei-, serumfreie Medien (ohne Zellen) hinzugefügt werden.
  13. Platz 24-Well-Platte im Labor Brutschrank bei 37 ° C, 5 % CO2und 95 % Luftfeuchtigkeit für 24 h gewartet.
    Hinweis: Die 24 h Inkubationszeit wurde optimiert für die verewigt Ersttrimester-Trophoblast Zellen und weitere Tests müssen gegebenenfalls die erforderlichen Inkubationszeit bei anderen Zelllinien zu bestimmen.
  14. Nach Inkubation über Nacht Saug-die restlichen Medien aus der oberen und unteren Kammer ohne zu stören die extrazelluläre Matrix. Dann entfernen Sie vorsichtig die extrazelluläre Matrix und nicht überfallen Zellen aus dem oberen Teil des Einsatzes mit einem Wattestäbchen, wischt so oft wie nötig, um die extrazellulären Matrix zu entfernen.
  15. Jedes waschen legen Sie 3 X mit 1 X PBS, die oberen und unteren Kammern des Brunnens PBS hinzufügen. Aspirieren Sie PBS nach jedem Waschen.
  16. Zellen zu den Einsätzen durch Platzieren von Einsätzen in 100 % eiskaltem Methanol für 30 min bei 4 ° c zu beheben Wash fügt 3 X mit 1 x PBS und entfernen PBS, nachdem das Finale zu waschen. Färben Sie die Zellen auf die Einsätze für 10 min mit 0,2 % Kristallviolett in 20 % Ethanol.
  17. Spülen Sie 3 X mit entionisiertem Wasser und aspirieren Sie deionisiertes Wasser nach dem letzten waschen.
  18. Trocknen Sie Einsätze für 1 h bei Raumtemperatur an der Luft. Mit einer Pinzette und einer Rasierklinge, schneiden Sie vorsichtig die untere Membran des Einsatzes und auf einem Objektträger mit der Unterseite nach oben montieren. Lassen Sie Montage-Medien bei Raumtemperatur trocknen.
  19. Mindestens 4 einzigartige Bilder der angegriffene Zellen pro Probe mit einem Licht Mikroskop mit einem Objektiv 20 X zu erhalten. Zählen Sie die Gesamtzahl der Zellen in jedem Bild und normalisieren Sie die Anzahl der Zellen zu Kontrollproben und plot-Daten (Abbildung 2).

4. Verbreitung Assay

  1. Folgenden Schritt 1.4, trypsiniert Zellen aus der Flasche mit einem automatisierten Zelle Zähler zählen und in 6-Well-Platten bei einer Dichte von 2 x 105 Zellen pro Bohrloch in standard Wachstumsmedien Samen.
  2. Platzieren Sie Zellen in einem Labor-Inkubator bei 37 ° C, 5 % CO2und 95 % Luftfeuchtigkeit für 4 h oder bis Zellen eingehalten haben gehalten.
  3. Änderung zu Phenol-rot freie Medien ergänzt je nach Bedarf, einschließlich Hitze-inaktivierten, Holzkohle Dextran abgestreift FBS Medienund fügen Sie gewünschte Behandlung. Die beschriebenen Experimente hinzugefügt Fahrzeug (1 X PBS) oder 100 nM Dexamethason in 1 X PBS verdünnt. Legen Sie die 6-Well-Platten in einem Labor-Inkubator bei 37 ° C, 5 % CO2und 95 % Luftfeuchtigkeit gehalten.
  4. Entfernen Sie Medien zu und ersetzen Sie durch neue Medien und Behandlung alle 48 h.
  5. Nach 24, 48 oder 72 Stunden Behandlung Zellen mit 1 mL 1 X PBS waschen und 500 µL Trypsin-EDTA in jede Vertiefung hinzufügen. Platz 6-Well-Platte im Inkubator bis Zellen von der Platte gelöst haben.
  6. Sobald Zellen von der Platte getrennt haben, fügen Sie 500 µL ergänzten Phenol-rot freien Medien, Trypsin zu deaktivieren.
  7. 5 µL Trypan blau in einem separaten Rohr 5 µL der trypsiniert Zellen hinzufügen und Mischen von pipettieren.
  8. Zählen Sie Zellen aus jedem Brunnen in zweifacher Ausfertigung mit einem automatisierten Zelle Zähler.
  9. Durchschnittliche Anzahl der Zellen pro Bohrloch an jedem Zeitpunkt und Grundstück als Funktion der Zeit (Abbildung 3).

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Ergebnisse

Verewigt menschlichen Ersttrimester-Trophoblast Zell-Linien Sw.71 und HTR-8/SVneo dienten in diesen Experimenten um die Rolle von Glucocorticoiden in Trophoblast Zelle Migration12zu bestimmen. Glukokortikoide wurden in diesen Experimenten verwendet, als sie vor kurzem gezeigt worden, um Trophoblast Funktionen ändern obwohl alternative Behandlungen verwendeten12sein könnte. Beide Zelllinien wurden behandelt mit Fahrzeug (1 X PBS) oder 100 nM ...

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Diskussion

Dieses Verfahren stützt sich auf die Verwendung von Migration und Invasion Assays um die Rate der Zellproliferation als möglicher Beitrag zum gemessenen Unterschiede in der Trophoblast Zellbewegung erweitert. Diese in-vitro-Untersuchungen sind zusammen verwendet werden, einfache und effektive Methoden, die verwendet werden können, um die zelluläre Signalwege zu identifizieren, die Trophoblast Migration zu regulieren. Wie oben beschrieben, können Trophoblast Zellen Hormone, Zytokine, Wachstumsfaktoren oder andere Moleküle...

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Offenlegungen

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Danksagungen

Die Autoren danken Dr. Gil Mor für die Bereitstellung der Sw.71 Zellen. Diese Forschung wurde durch eine Albert McKern Scholar Award, S.W unterstützt.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
0,4 % Trypanblau FleckThermo Fisher Scientific15250-061
0,5 % Trypsin-EDTALife Technologies15400-054
1,0 M HEPESAmericanBioAB06021-00100
10 mM MEM nicht-essentielle AminosäurenLife Technologies11140-050
100 mM NatriumpyruvatLife Technologies11360-070
24-Well-Platten-Transwell-EinsätzeCorning3422Enthält Polycarbonat-Filter mit einem 8 μ m Porengröße
Aktivkohle dextran-gestreift FBSGemini Bio-Products100-119
Countess II Automatisierter ZellzählerThermo Fisher ScientificAMQAX1000
Crystal VioletSigma AldrichC0775
Cytoseal 60Thermo Fisher Scientific8310-4
Dexamethason (Dex; 1, 4-Pregnadien-9α-fluor-16α-methyl-11β, 17, 21-triol-3,20-dion; ≥ 98% TLC)SteraloideP0500-000
DMEM/Ham" s F12Life Technologies11330-032
Fötales RinderserumSigma AldrichF2442
IncuCyte 24-Well-ImageLock-PlattenEssen BioScience4365Wenn Sie das IncuCyte Zoom-Bildgebungssystem verwenden, säen Sie Zellen auf IncuCyte ImageLock-Platten. Diese Platten haben Passermarken an der Unterseite der Platte, die als Referenz für die wiederholte Bildgebung in einem konstanten Sichtfeld verwendet werden.
IncuCyte SoftwareEssen BioScience2010A Rev2
IncuCyte ZOOM SystemEssen BioScienceN/AScratch Assay-Bilder wurden mit dem Preset " Kratzwunde" Parameter auf dem IncuCyte ZOOM-System. Es können auch andere Zeitraffermikroskope verwendet werden.
Matrigel Membran MatrixBecton Dickinson356231Wachstumsfaktor reduziert, phenol-rot frei
Mikro-ObjektträgerVWR International, LLC48311-7003
Mikroskop-DeckglasFisher Scientific12-545-E
Olympus IX71 inversesMikroskop OlympusIX71
Penicillin (10.000 Einheiten/ml)/Streptomycin (10.000 & Mikro; g/mL)Life Technologies151-40-122
Phenolrotfreies DMEM/Ham's F12Life Technologies11039-021
Halbautomatisches WundmacherwerkzeugEssen BioScienceN/A

Referenzen

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TrophoblastmigrationScratch AssayInvasionsassayProliferationsassayZellinvasionZellproliferationWundheilungextrazellul re MatrixZellz hlerLichtmikroskopie
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