Hier präsentieren wir eine hochverfügbare Protokoll für die Bewertung der Zellbewegung in menschlichen Trophoblast Zellen mit drei in-vitro-Tests: der Scratch-Test, Transwell Invasion Assay und der Zelle Verbreitung Assay.
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Methodenartikel
In-vitro-Tests zur Bewertung der Migration, Invasion und Proliferation von verewigt menschlichen Ersttrimester-Trophoblast Zelllinien
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Zelle Bewegung ist eine wichtige Eigenschaft des Trophoblasten während plazentar Entwicklung und frühe Schwangerschaft. Die Bedeutung der richtigen Trophoblast Migration und Invasion zeigt Schwangerschaft Erkrankungen wie der Präeklampsie und intrauteriner Wachstumsretardierung, die mit unzureichenden Trophoblast Einmarsch in das mütterliche Gefäßsystem verbunden sind. Leider, unser Verständnis der Mechanismen, durch die die Plazenta von Migration entwickelt Trophoblasten ist begrenzt. In-vitro-Analyse der Zellwanderung über der Scratch-Test ist ein nützliches Werkzeug bei der Identifizierung von Faktoren, die Trophoblast wandernden Kapazität zu regulieren. Dieser Assay allein definiert jedoch nicht die Zellveränderungen, die veränderte Zelle Migration führen können. Dieses Protokoll beschreibt drei verschiedene in-vitro-Untersuchungen, die gemeinsam verwendet werden, um Trophoblast Zelle Bewegung zu bewerten: der Scratch-Test, die Invasion-Assay und der Verbreitung Assay. Die hier beschriebenen Protokolle können auch für den Einsatz in anderen Zelllinien zur Quantifizierung der Zellbewegung in Reaktion auf Reize geändert werden. Diese Methoden können Forscher, einzelne Faktoren zu identifizieren, die dazu beitragen, die Zellbewegung und bieten eine gründliche Prüfung der möglichen Mechanismen, die offensichtlichen Veränderungen der Zellmigration.
Einleitung
Plazentar Entwicklung ist ein entscheidender Schritt bei der Einrichtung der Schwangerschaft Auswirkungen auf die Gesundheit von Müttern und fetalen. Allerdings ist die mechanistische Grundlage, dieser Vorgang wird, nicht vollständig verstanden. Zellmigration ist ein wichtiger biologischer Prozess, der für die Errichtung und die Funktionen der Plazenta während der Schwangerschaft beiträgt. Nach Implantation der Blastozyste unterscheidet die Trophektoderm in Zotten Trophoblasten, die bedecken die Oberfläche der Chorionzotten und Gas- und Nährstoffaustausch beteiligt sind, und extravillous Trophoblasten (EVTs), die heraus von der Zotten migrieren und dringen in die mütt....
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Protokoll
1. Zelle-Vorbereitung
- Zellen in T-75 Flaschen in standard Wachstumsmedien bei 37 ° C, 5 % CO2und 95 % Luftfeuchtigkeit zu erhalten.
Hinweis: In diesen Experimenten verwendeten Zellen wurden die verewigt Ersttrimester-Trophoblast Zellen Linien Swan.71 (Sw.71) und HTR-8/SVneo9,10. Die Sw.71 Zellen wurden in DMEM/F-12 mit 10 % Hitze-inaktivierten fetalen bovine Serum (FBS), 1,0 mM Natrium Pyruvat, 10 mM HEPES, 0,10 mM MEM nicht-essentiellen Aminosäuren, 100 Einheiten/mL Penicillin und 100 µg/mL Streptomycin ergänzt beibehalten. Die HTR-8/SVneo-Zellen waren gepflegt, ergänz....
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Ergebnisse
Verewigt menschlichen Ersttrimester-Trophoblast Zell-Linien Sw.71 und HTR-8/SVneo dienten in diesen Experimenten um die Rolle von Glucocorticoiden in Trophoblast Zelle Migration12zu bestimmen. Glukokortikoide wurden in diesen Experimenten verwendet, als sie vor kurzem gezeigt worden, um Trophoblast Funktionen ändern obwohl alternative Behandlungen verwendeten12sein könnte. Beide Zelllinien wurden behandelt mit Fahrzeug (1 X PBS) oder 100 nM .......
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Diskussion
Dieses Verfahren stützt sich auf die Verwendung von Migration und Invasion Assays um die Rate der Zellproliferation als möglicher Beitrag zum gemessenen Unterschiede in der Trophoblast Zellbewegung erweitert. Diese in-vitro-Untersuchungen sind zusammen verwendet werden, einfache und effektive Methoden, die verwendet werden können, um die zelluläre Signalwege zu identifizieren, die Trophoblast Migration zu regulieren. Wie oben beschrieben, können Trophoblast Zellen Hormone, Zytokine, Wachstumsfaktoren oder andere Moleküle.......
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Offenlegungen
Die Autoren haben nichts preisgeben.
Danksagungen
Die Autoren danken Dr. Gil Mor für die Bereitstellung der Sw.71 Zellen. Diese Forschung wurde durch eine Albert McKern Scholar Award, S.W unterstützt.
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| 0,4 % Trypanblau Fleck | Thermo Fisher Scientific | 15250-061 | |
| 0,5 % Trypsin-EDTA | Life Technologies | 15400-054 | |
| 1,0 M HEPES | AmericanBio | AB06021-00100 | |
| 10 mM MEM nicht-essentielle Aminosäuren | Life Technologies | 11140-050 | |
| 100 mM Natriumpyruvat | Life Technologies | 11360-070 | |
| 24-Well-Platten-Transwell-Einsätze | Corning | 3422 | Enthält Polycarbonat-Filter mit einem 8 μ m Porengröße |
| Aktivkohle dextran-gestreift FBS | Gemini Bio-Products | 100-119 | |
| Countess II Automatisierter Zellzähler | Thermo Fisher Scientific | AMQAX1000 | |
| Crystal Violet | Sigma Aldrich | C0775 | |
| Cytoseal 60 | Thermo Fisher Scientific | 8310-4 | |
| Dexamethason (Dex; 1, 4-Pregnadien-9α-fluor-16α-methyl-11β, 17, 21-triol-3,20-dion; ≥ 98% TLC) | Steraloide | P0500-000 | |
| DMEM/Ham" s F12 | Life Technologies | 11330-032 | |
| Fötales Rinderserum | Sigma Aldrich | F2442 | |
| IncuCyte 24-Well-ImageLock-Platten | Essen BioScience | 4365 | Wenn Sie das IncuCyte Zoom-Bildgebungssystem verwenden, säen Sie Zellen auf IncuCyte ImageLock-Platten. Diese Platten haben Passermarken an der Unterseite der Platte, die als Referenz für die wiederholte Bildgebung in einem konstanten Sichtfeld verwendet werden. |
| IncuCyte Software | Essen BioScience | 2010A Rev2 | |
| IncuCyte ZOOM System | Essen BioScience | N/A | Scratch Assay-Bilder wurden mit dem Preset " Kratzwunde" Parameter auf dem IncuCyte ZOOM-System. Es können auch andere Zeitraffermikroskope verwendet werden. |
| Matrigel Membran Matrix | Becton Dickinson | 356231 | Wachstumsfaktor reduziert, phenol-rot frei |
| Mikro-Objektträger | VWR International, LLC | 48311-7003 | |
| Mikroskop-Deckglas | Fisher Scientific | 12-545-E | |
| Olympus IX71 inverses | Mikroskop Olympus | IX71 | |
| Penicillin (10.000 Einheiten/ml)/Streptomycin (10.000 & Mikro; g/mL) | Life Technologies | 151-40-122 | |
| Phenolrotfreies DMEM/Ham's F12 | Life Technologies | 11039-021 | |
| Halbautomatisches Wundmacherwerkzeug | Essen BioScience | N/A |
Referenzen
- Ji, L., et al. Placental trophoblast cell differentiation: Physiological regulation and pathological relevance to preeclampsia. Molecular Aspects of Medicine. 34 (5), 981-1023 (2013).
- Caniggia, I., Winter, J., Lye, S., Post, M.
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Nachdrucke und Genehmigungen
