Methodenartikel

Wangeninjektionsmodell zur gleichzeitigen Messung von Schmerz- und Itch-bezogenen Verhaltensweisen

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DOI:

10.3791/58943

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27. September 2019

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1Thermal Biology Group, Exploratory Research Center on Life and Living Systems (ExCELLS), 2Division of Cell Signaling, National Institute for Physiological Sciences, 3Department of Physiological Sciences, Graduate University for Advanced Studies (SOKENDAI), 4Research Laboratory, Ikedamohando Co., Ltd., 5Department of Molecular Biomedical Sciences, College of Veterinary Medicine, North Carolina State University, 6Institute for Environmental and Gender-Specific Medicine, Juntendo University

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Typischerweise wird das Maushals-Injektionsmodell zur Bewertung von Pruritogen-induziertem Kratzverhalten verwendet. Das Modell liefert jedoch nur Informationen über Dench, nicht über Schmerzen. Hier wird bei Mäusen ein Wangeninjektionsmodell eingeführt, mit dem gleichzeitig Schmerz- und Schübenverhalten gemessen werden kann.

Zusammenfassung

Itch wurde 1941 von Rothman als "eine unangenehme Hautempfindung, die den Wunsch nach Kratzern provoziert" definiert. In Mausmodellen werden Kratzanfälle in der Regel gezählt, um Juckreiz zu bewerten, der durch Pruritogene induziert wird. Jedoch, frühere Berichte haben gezeigt, dass algesische Substanzen auch Kratzverhalten in einem Maushals-Injektionsmodell induzieren, das der häufigste Test für Kratzverhalten ist. Dieser Befund macht es schwierig, Esch uschen bei Mäusen zu studieren.  Im Gegensatz dazu reduzierte Capsaicin, ein häufiges Algogen, kratzverhalten in einigen Nackeninjektionsexperimenten. Daher bleibt die Wirkung von Schmerzen auf kratzenVerhalten unklar. Es ist daher notwendig, eine Methode zu entwickeln, um gleichzeitig Esch und Schmerzempfindung mit Verhaltenstests zu untersuchen. Hier wird ein Wangeninjektionsmodell eingeführt, mit dem gleichzeitig schmerz- und itchbedingte Verhaltensweisen gemessen werden können. In diesem Modell induzieren Pruritogene Kratzverhalten, während algesische Substanzen Wischverhalten induzieren. Mit diesem Modell wird gezeigt, dass Lysophosphatidsäure (LPA), ein Itch-Mediator bei cholestatischen Patienten mit Schreiz, ausschließlich Zitzer, aber keine Schmerzen induziert. Jedoch, in Maus-Modelle, LPA wurde berichtet, dass sowohl ein Pruritogen und ein Algogen. Die Untersuchung der Auswirkungen von LPA in einem Mauswangen-Injektionsmodell zeigte, dass LPA nur Kratzer induzierte, aber nicht Wischverhalten. Dies deutet darauf hin, dass LPA als Pruritogen in ähnlicher Weise bei Mäusen und Menschen wirkt, und zeigt den Nutzen eines Wangen-Injektionsmodells für die Itch-Forschung.

Einleitung

Juckreiz wurde ursprünglich als ein Gefühl charakterisiert, das Kratzverhalten induziert, um schädliche Materialien von der Hautoberfläche zu entfernen. Jedoch, Itch war der Fokus der Therapien für unangenehme Empfindungen durch viele Krankheiten wie atopische Dermatitis, neurogene Läsionen, und Cholestase1verursacht. In diesen Fällen ist Esch ein ernstes unangenehmes Gefühl ähnlich wie Schmerzen. Daher stellt Itch ein wichtiges Forschungsziel dar. Kratzverhalten ist der primäre Indikator für Juckreiz in Tierversuchen, und Kratzverhalten kann bei Mäusen induziert werden, indem Pruritogene in die Haut am Halsinjizieren 2,3. Jedoch, eine frühere Studie zeigte, dass Capsaicin, ein Algogen, induziert auch Kratzverhalten in einem Hals Injektion Modell4, so dass es schwierig, Juckreiz von Schmerzen in diesem Modell zu unterscheiden.  Im Gegensatz dazu wurde festgestellt, dass Capsaicin das Kratzverhalten in einem Halsinjektionsmodell reduzierte, was darauf hindeutet, dass die Wirkung von Schmerzen auf das Kratzverhalten kompliziert ist und von den experimentellen Bedingungen abhängt.  Daher würden gleichzeitige Messungen von Schmerzen und Itch-bezogenen Verhaltensweisen die genaue Analyse von Pruritogenen und Algogenen ermöglichen. Steven G. Shimada und Robert H. LaMotte gelang es, gleichzeitig Eschmerz- und Itch-bezogene Verhaltensweisen zu messen, indem die Injektionsstelle vom Hals auf dieWange4 geändert wurde. Im Wangeninjektionsmodell induzierte Capsaicin das Wischen, aber nicht Kratzverhalten, während Histamin, ein Pruritogen, nur Kratzverhalten induzierte. Daher ermöglicht dieses Modell die unabhängige Beurteilung von Schreiz und Schmerzen, was die Wangeninjektion zu einem nützlichen Modell für die Itch-Forschung macht. Bei dem Versuch festzustellen, ob es sich bei einer Testsubstanz um ein Pruritogen und/oder ein Algogen handelt, liefert dieses Modell mehr Informationen als das Halsinjektionsmodell. Dieser Artikel beschreibt eine praktische Methode zur Durchführung von Wangeninjektionen und zum Zählen der Anfälle von Kratzen oder Wischen und zeigt den Nutzen dieser Methode zur Bewertung von Kratzverhalten, die durch lysophosphatidische Säure (LPA) induziert werden.

Protokoll

Alle Verfahren im Zusammenhang mit der Pflege und Verwendung von Tieren wurden vom institutionellen Tierpflege- und Verwendungsausschuss des Nationalen Instituts für Naturwissenschaften (16A074) genehmigt und in Übereinstimmung mit den Richtlinien des Nationalen Instituts für Physiologische Wissenschaften.

HINWEIS: Das ursprüngliche Protokoll wurde von Steven G. Shimada und Robert H. LaMotte4berichtet, und der vorliegende Bericht beschreibt diese Methoden mit mehreren Änderungen, einschließlich der Hinzufügung eines Bildschirms, um zu verhindern, dass die Tiere einander sehen, das Fehlen eines die Anzahl der Mäuse pro Aufnahme, Mausdehnung, Käfiggröße und Aufnahmezeit.

1. Cheek Injection Modell

  1. Experimentiervorbereitung
    1. käfig
      1. Legen Sie vier Käfige unter einer Kamera fest, wie in Abbildung 1dargestellt. Stellen Sie einen Bildschirm ein, um zu verhindern, dass die Mäuse einander sehen. Legen Sie jede Maus in jeden Käfig und stellen Sie einen Acryldeckel, um das Entweichen von Mäusen zu verhindern. Beachten Sie, dass Aufnahmen in einer Umgebung durchgeführt werden sollten, in der Temperatur, Luftfeuchtigkeit und Schall gesteuert werden.
        HINWEIS: Verhaltensweisen können auch ohne Deckel aufgezeichnet werden, wenn der Käfig ausreichend hoch ist.
    2. Nadel und Spritze
      1. Verwenden Sie eine 29 G- oder 30-G-Nadel, die an einer 0,5 ml-Spritze befestigt ist, um Prüfsubstanzen zu indien. Wenn die Prüfsubstanzlösung hochviskos ist, sind größere Nadeln erforderlich. Bitte beachten Sie jedoch, dass große Nadeln zusätzliche körperliche Nebenwirkungen darstellen.
        HINWEIS: Es kann eine Nadel verwendet werden, die mit einer Spritze mit einem Polyethylenrohr verbunden ist.
    3. Videokamera
      1. Verwenden Sie eine Videokamera mit ausreichend großen Bildraten (30-60 Frames/s) mit relativ hoher Auflösung für die Messung von Kratzerkämpfen und Wischverhalten.
    4. Software für die Videoanalyse
      1. Verwenden Sie eine Videobearbeitungssoftware für die Videowiedergabe und -analyse. Beachten Sie, dass für eine präzise Analyse ein Schnellvorwärtsmodus und ein Frame-by-Frame-Wiedergabemodus erforderlich sind.

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Abbildung 1:Einrichtung von Videokamera und Käfig. Vier Acrylkäfige mit Acryldeckel, um das Entweichen der Mäuse zu verhindern, und ein Bildschirm zur Verhinderung ansteckender Schreize werden verwendet. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

  1. Injektion und Aufzeichnung
    1. Einen Tag vor dem Experiment, rasieren Sie das Fell auf der Wange der Maus mit Haarclipper (Film 1). Vor der Rasur, halten Sie die Mäuse nicht zurück.
      HINWEIS: CD-1 oder C57BL/6 Mäuse wurden in diesem Modell hauptsächlich verwendet4,5. In diesem Artikel wurden männliche 6-12 Wochen alte C57BL/6N Mäuse verwendet. Beachten Sie, dass die Empfindlichkeit gegenüber den Chemikalien zwischen den verschiedenen Mausstämmen3,6,7sein könnte.
    2. Einen Tag nach der Rasur bewegen Sie die Maus für 1 h in den Aufnahmekäfig, um sie an die Aufnahmebedingungen zu gewöhnen. Wenn eine topische Anwendung verwendet wird, wenden Sie sie während dieser Akklimatisierungszeit an.
      HINWEIS: In diesem Bericht wurde 30 min vor der Aufnahme 10 l von 2% (w/v) Diphenhydraminhydrochloridsalz in Kochsalze topisch aufgetragen.
    3. Stellen Sie eine Videokamera über dem Käfig ein, und starten Sie die Videoaufzeichnung vor der Injektion der Testsubstanz. Injizieren Sie eine 10-L-Lösung der Prüfsubstanz intradermally in die rasierte Wange unter wachen Bedingungen (Film 2). Kehren Sie nach der Injektion die Maus in den Aufnahmekäfig zurück.
      HINWEIS: In diesem Bericht wurden 50 g/10 l Histamin, 40 g/10 L Capsaicin oder ein Fahrzeug (7% tween 80 in Saline) als Prüfsubstanzen verwendet.
    4. Schließen Sie den Deckel des Käfigs und fahren Sie mit der Videoaufzeichnung für 30 min fort.
      HINWEIS: Die Gesamtaufnahmezeit hängt von den experimentellen Bedingungen ab.
  2. Verhaltensanalyse
    1. Zählen Sie Kratzer- bzw. Wischverhalten. Mäuse heben ein Hinterbein in Richtung wange und kratzen mehrmals über eine oder ein paar Sekunden, dann legen Sie ihr Bein nach unten. Diese Reihe von Aktionen wird als ein Kratzer Kampf gezählt. Kratzer in anderen Bereichen sollten nicht gezählt werden. Mäuse verwenden ein einziges Vorderbein zum Wischen und beide Vorderbeine für die Pflege. Diese Maßnahmen sollten unterschieden werden. Nur Wischverhalten werden als schmerzbedingte Verhaltensweisen gezählt.
      HINWEIS: Jede Aktion wird in Abbildung 2, Film 3, Film 4und Film 5angezeigt.

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Abbildung 2:Typische Mausaktivität während der Aufzeichnung. Panels A-C sind Abbildungen, die wischverhalten mit dem rechten Vorderbein (A), Kratzverhalten mit dem rechten Hinterbein (B) und Pflegeverhalten mit beiden Vorderbeinen (C) darstellen. Mäuse heben ein Hinterbein in Richtung der Wange und kratzen mehrmals über eine oder ein paar Sekunden, dann legen Sie das Bein nach unten. Diese Reihe von Aktionen wird als ein Kratzer Kampf gezählt. Kratzer in anderen Bereichen sollten nicht gezählt werden. Mäuse verwenden ein einziges Vorderbein zum Wischen und beide Vorderbeine für die Pflege. Diese Maßnahmen sollten unterschieden werden. Nur Wischverhalten werden als schmerzbedingte Verhaltensweisen gezählt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

2. Neck Injection Modell

  1. Injektion und Aufzeichnung
    1. Einen Tag vor dem Experiment rasieren Sie das Fell auf dem Nacken der Maus mit Haarclippern nach ca. 5% Isofluran-Inhalation für 2-3 min.
    2. Einen Tag nach der Rasur bewegen Sie die Maus für 1 h in den Aufnahmekäfig, um sie an die Aufnahmebedingungen zu gewöhnen.
    3. Stellen Sie eine Videokamera über dem Käfig ein (Abbildung 1), und starten Sie die Videoaufzeichnung vor der Injektion der Prüfsubstanz. Intradermalin eine 10-L-Lösung der Prüfsubstanz in den rasierten Hals unter wachen Bedingungen injizieren. Kehren Sie nach der Injektion die Maus in den Aufnahmekäfig zurück.
      HINWEIS: In diesem Artikel wurden 50 g/10 l Histamin, 10 g/10 l oder 40 g/10 L Capsaicin oder ein Fahrzeug (7% in Saline- und Saline- und -tween) als Prüfsubstanzen verwendet.
    4. Schließen Sie den Deckel des Käfigs und fahren Sie mit der Videoaufzeichnung für 30 min fort.
      HINWEIS: Die Gesamtaufnahmezeit hängt von den experimentellen Bedingungen ab.
  2. Verhaltensanalyse
    1. Zählen Sie Kratzkampfverhalten. Mäuse heben ein Hinterbein in Richtung des Halses und kratzen mehrmals über eine oder ein paar Sekunden, dann legen Sie das Bein nach unten. Diese Reihe von Aktionen wird als ein Kratzer Kampf gezählt. Kratzer in anderen Bereichen sollten nicht gezählt werden.
      HINWEIS: Die Wirkung des Kratzens ist ähnlich wie im Wangeninjektionsmodell, mit der Ausnahme, dass die Position des Kratzens auf den Hals verschoben wird.

Ergebnisse

Im Halsinjektionsmodell induzierte Histamin starke Kratzverhalten (Abbildung 3). Fahrzeug (7% Tween 80 in saline) induzierte auch Kratzverhalten. Ein früherer Bericht zeigte, dass Waschmittel Durch Histaminproduktion aus Keratinozyten8Schitreiz induzierte. Tween 80 könnte Juckreiz durch ähnliche Mechanismen induzieren, während Capsaicin fahrzeuginduzierte Kratzverhalten reduziert, im Gegensatz zu einem früheren Bericht4. Es ist möglich, dass Mausdehnungsunterschiede für diese unterschiedlichen Ergebnisse verantwortlich sein könnten. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass die Wirkung von Schmerzen auf Kratzverhalten kompliziert ist. Daher kann die gleichzeitige Messung von Schmerz- und Zahnverhalten die genaue Analyse von Pruritogenen und Algogenen ermöglichen. Im Wangeninjektionsmodell induzierte Capsaicin kein Kratzverhalten und nur induzierte Wischverhalten, von denen angenommen wird, dass sie mit Schmerzen zusammenhängen9,10,11 ( Abbildung4). Capsaicin Injektion erhöhte auch Pflegeverhalten (Daten nicht gezeigt). Nach der Injektion in die Wange, Histamin vor allem induziert kratzen Verhaltensweisen mit schwachen Wischverhalten. Die Anwendung eines Antihistamin-Reagenz, Diphenhydramin, gehemmt Kratzer. Dieses Ergebnis legt nahe, dass Histamin-induzierte Kratzverhalten durch die Wirkung von Histamin auf Histamin-Rezeptoren verursacht werden. Hier werden z.B. die Auswirkungen von LPA im Wangeninjektionsmodell dargestellt (Abbildung 5). LPA ist ein Itch Mediator bei cholestatischen Patienten mit Schreiz. In Mausmodellen wurde LPA jedoch sowohl als Pruritogen als auch als Algogen12,13,14,15berichtet. Daher wurden die Auswirkungen von LPA in einem Wangeninjektionsmodell untersucht und die Ergebnisse zeigten, dass LPA Kratzer induzierte, aber nicht Wischverhalten. Dies deutet darauf hin, dass LPA ein Pruritogen ist, aber kein Algogen, bei Mäusen, ähnlich wie seine Wirkung beim Menschen.

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Abbildung 3: Auswirkungen von Histamin und Capsaicin im Halsinjektionsmodell. (A) Kratzverhalten, das durch die Injektion des Fahrzeugs induziert wird (7% Tween 80 in Saline, offenes Quadrat), Histamin (50 g/10 l pro Stelle, gefüllte Kreise) oder Capsaicin ( 10 g/10 l pro Standort, offenes Dreieck; 40 g/10 l pro Stelle, gefülltes Dreieck) in den Hals wurden alle 5 min für insgesamt 30 min. (B) Quantitative Analyse des Kratzverhaltens während der 30 min Periode in Panel A. korrektur. Die Daten werden als Mittelwert -SEM (n = 6-8) dargestellt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Abbildung 4: Wirkungen eines Pruritogens und eines Algogens im Wangeninjektionsmodell. Wisch- (A) und Kratzverhalten (B) Verhaltensweisen, die durch Injektion des Fahrzeugs (7% Tween 80 in Kochlinie, offenes Quadrat), Histamin (50 g/10 l pro Stelle, gefüllte Kreise) oder Capsaicin (40 g/10 l pro Stelle, gefülltes Dreieck) in die rechte Wange von Mäusen induziert wurden alle 5 min für insgesamt 30 min bewertet. Die als offene Kreise dargestellte Gruppe wurde mit 10 l (w/v) Diphenhydraminhydrochloridsalz (DHHCL) 30 min vor der Histamininjektion (50 g/10 l pro Stelle) perkutan behandelt. DHHCl wurde in Saline aufgelöst. Quantitative Analyse des Wischverhaltens (C) und des Kratzens (D) während der 30-min-Periode in den Panels A und B; n = 8 Tiere pro Gruppe. P < 0,05,P < 0,01 von ANOVA, gefolgt von Bonferroni-Korrektur. Die Daten werden als Mittelwert -SEM angezeigt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Abbildung 5:LPA induziert Kratzer, aber nicht Wischverhalten im Wangeninjektionsmodell. Kratzen (A) und Wischen (B) Verhaltensweisen, die durch Injektion von Fahrzeug (Saline, offene Quadrate) oder LPA (100 nmol/10 l pro Stelle, gefüllte Kreise) in die rechte Wange von Mäusen induziert wurden, wurden alle 5 min für insgesamt 30 min bewertet. Quantitative Analyse der Kratzen (C) und Wischen (D) Verhaltensweisen während der 30 min Periode in den Panels A und B; n = 17 für Fahrzeug und n = 20 für LPA. P < 0,05, P< 0,01 durch Welch s t-Test. Die Daten werden als Mittelwert für SEM angezeigt. Diese Zahl wurde von Kittaka et al.5geändert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Film 1: Film zeigt, wie man eine Maus Wange rasieren. Bitte klicken Sie hier, um dieses Video zu sehen. (Rechtsklick zum Download.)

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Film 2: Film zeigt die Injektion in eine Mauswange. Bitte klicken Sie hier, um dieses Video zu sehen. (Rechtsklick zum Download.)

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Film 3: Film, der ein typisches Wischverhalten demonstriert. Dieser Film wird mit einer Geschwindigkeit von 25 % gezeigt. Bitte klicken Sie hier, um dieses Video anzuzeigen. (Rechtsklick zum Download.)

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Film 4: Film mit typischem Kratzverhalten. Bitte klicken Sie hier, um dieses Video anzusehen. (Rechtsklick zum Download.)

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Film 5: Film von typischem Pflegeverhalten. Dieser Film wird mit einer Geschwindigkeit von 25 % gezeigt. Bitte klicken Sie hier, um dieses Video anzuzeigen. (Rechtsklick zum Download.)

Diskussion

In diesem Artikel wird ein Wangeninjektionsmodell eingeführt, das sich als nützlich für die Analyse von Schmerz- und Zahnverhalten erwiesen hat.

Ein früherer Bericht zeigte, dass algesische Substanzen Kratzverhalten in einer MausHals-Injektion Modell4induzieren. Im Gegensatz dazu reduzierte Capsaicin das Kratzverhalten in anderen Nackeninjektionsexperimenten (Abbildung 3). Daher bleibt die Wirkung von Schmerzen auf das Kratzverhalten unklar. Es ist daher notwendig, eine Methode zu entwickeln, um gleichzeitig Schmerzen und Schreiz durch Verhaltenstests zu untersuchen. Durch die Verwendung eines Wangeninjektionsmodells kann die Wirkung einer Substanz auf Schmerzen und Schüben bewertet werden.

Es wurde bereits berichtet, dass intrazelluläreLPA DIREKT TRPV1 und TRPA1 als Mechanismus von LPA-induziertem Itch5aktiviert. Dementsprechend könnte LPA-induzierter Zitck histaminunabhängig sein. Eine frühere Studie zeigte auch, dass ein Wangeninjektionsmodell für die Bewertung von Histamin-unabhängiger Tauch artitheitiert16verwendet werden kann. Daher kann dieses Modell sowohl für histaminabhängigen als auch für -unabhängigen Schüben verwendet werden.

Einer der entscheidenden Schritte in diesem Experiment ist die Injektion. Da es sich um einen akuten Verhaltenstest handelt, kann die Anästhesie im Injektionsschritt nicht verwendet werden, da sie sich auf diese Verhaltensweisen auswirken könnte. Daher muss die Maus sicher gehalten werden, um eine präzise Injektion durchzuführen. Wenn der Halt auf dem Tier nicht sicher ist, vor allem bei der Injektion von starken Algogenen, können die Mäuse kämpfen, was zu einem ungenauen Injektionsvolumen und Tiefe führt, gefolgt von Schwierigkeiten bei der Interpretation der Ergebnisse. Wenn Sie mit einer Maus umgehen, ziehen Sie die Haut auf dem Nacken zwischen Daumen und Zeigefinger, um die Bewegung der Maus zu hemmen.

Ein weiterer kritischer Schritt ist die Verhaltensanalyse. Da das Kratzen sehr schnell ist, muss das Video sorgfältig angesehen werden. Darüber hinaus kann das Wischen schwierig von der Pflege zu unterscheiden sein. Daher wird die Verwendung von Positivkontrollchemikalien wie Capsaicin während des ersten Experiments empfohlen. Aufnahme- und Wiedergabebedingungen können sich auch auf die Zählung beider Verhaltensweisen auswirken. Wenn es schwierig ist, das Verhalten klar zu beobachten, können Spiegel um die Käfige verwendet werden, um die Betrachtungswinkel zu verbessern4.

Es sollte beachtet werden, dass das Wangeninjektionsmodell eine reduzierte quantitative Genauigkeit für die getesteten Chemikalien aufweisen kann als im Halsinjektionsmodell. Wie in Abbildung 3 und Abbildung 4dargestellt, induzierte die gleiche Menge an Histamin mehr Kratzverhalten im Halsmodell als im Wangenmodell und zeigte eine geringere Variation im Halsinjektionsmodell. Sobald sich bei einer getesteten Substanz ein Pruritogen mit niedriger algetischer Wirkung mit dem Wangeninjektionsmodell gezeigt hat, wird das Halsinjektionsmodell für eine zusätzliche quantitative Analyse empfohlen. Auch bei diesen Einschränkungen ist das Wangeninjektionsmodell für die genaue Bewertung von Prüfsubstanzen, insbesondere im Bereich der Itch-Forschung, nützlich.

Offenlegungen

Die Autoren haben nichts zu verraten.

Danksagungen

Wir danken Drs. Steven G. Shimada und Robert H. LaMotte (Yale University School of Medicine, Connecticut), deren Methoden (Referenz 4) diese Technik angepasst wurde. Wir danken auch Herrn Kentaro Miyahara für die Erstellung der Maus-Illustrationen. Diese Studie wurde durch ein Grant-in-Aid for Scientific Research des Ministeriums für Bildung, Kultur, Sport, Wissenschaft und Technologie in Japan (Nr. 15H02501 und 15H05928 bis M.T., und Nr. 16K21691 an H.K.) und Uehara Memorial Foundation (an H.K.) unterstützt. Wir schätzen die Einführung der Wangeninjektionsmethode durch Prof. LaMotte in der Yale University.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
CapsaicinSigmaM2028
DiphenhydraminhydrochloridWako044-19772
HistaminSigmaH7125
iMovieApfel
LysophosphatidsäureAvanti Polare Lipide325465-93-8
MyjektorTerumoss-05M2913
Tween-80SigmaP4780
VideokameraPanasonicVX985M

Referenzen

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