Reinigung und Analyse eines monoklonalen Antikörpers aus chinesischen Hamster-Ovarialzellen mit einem automatisierten Mikrobioreaktorsystem

Protein-Therapeutika werden verwendet, um eine wachsende Vielfalt von Erkrankungen zu behandeln, einschließlich Gewebetransplantation Komplikationen, Autoimmunerkrankungen, und Krebs¹. Seit 2004 dokumentiert die United States Food and Drug Administration (USFDA) einen steigenden Anteil an bioologischen Lizenzanträgen (BLAs) aller zulassungen, die vom Center for Drug Evaluation and Research (CDER) reguliert werden, wobei BLAs über 25 % der Zulassungen ausmachen. 2014 und 2015².

Angesichts dieses expandierenden Marktes sind biopharmazeutische Hersteller gefordert, schnell mehr Produkte mit gleichbleibender Qualität zu liefern. Die Bemühungen, die Produktausbeute zu steigern, konzentrierten sich auf CHO-Zelltechnik und Produktionslinien-Screening, obwohl die wichtigsten Verbesserungen auf Fortschritte bei der Optimierung der Medien-/Feed-Strategie und der Umgebungskontrollen für Zellenkulturen zurückzuführen sind^{1, 3 , 4 , 5} während des Herstellungsprozesses.

Da mAbs in einem biologischen System hergestellt werden, kann es eine inhärente Proteinvariabilität geben. Die Antikörperzusammensetzung kann posttranslational verändert werden, z. B. glykosyliert oder durch Abbau oder enzymatische Reaktionen beeinflusst werden. Diese strukturellen Variationen können gefährliche Immunreaktionen hervorrufen oder die Antikörperbindung verändern, was wiederum die beabsichtigte therapeutische Funktion reduzieren oder eliminieren kann⁵. Daher werden kritische Qualitätsattribute (CQAs) monoklonaler Antikörper - N-Glykanprofil, Ladungsvariantenverteilung und der Anteil der Antikörper in monomerer Form - regelmäßig im Rahmen eines Quality by Design (QbD)-Ansatzes während der Herstellungsprozesse^1,6. In einem regulierten Produktionsumfeld müssen therapeutische Proteine die Akzeptanzkriterien erfüllen, um als zugelassenes kommerzielles Arzneimittel zugelassen zu werden⁷. Die hier vorgestellten Methoden wären in der Regel Teil des Qualitätscharakterisierungsprozesses für einen Antikörper^7,8, und jeder Proteinwissenschaftler wird mit ihrer Verwendung vertraut sein.

In früheren Arbeiten⁹wurde die Anwendung und der Betrieb von Mikrobioreaktoren für das Hochdurchsatzscreening von Zellkulturbedingungen in der vorgelagerten Bioverarbeitung beschrieben. Das aus den unterschiedlichen Medienbedingungen gewonnene gereinigte Produkt wird einer N-Glykan-Analyse mit LC-MS unterzogen. Glykosylierungsmuster von therapeutischen Proteinen können mit den LC-MS-Techniken^10,11und Das Vorhandensein verschiedener Glykanarten wurde mit Bioprozessparametern wie Futterstrategie, pH-Wert und Temperatur¹²in Verbindung gebracht. Die Auswirkungen der unterschiedlichen Medienbedingungen auf die Produktqualität, angegeben durch den Prozentsatz des resultierenden IgG in monomerer Form, werden auch mit Größenausschlusschromatographie- Multi-Angle Light Scattering (SEC-MALS)^{13,14 , 15}. Das Ladungsvariantenprofil stellt eine Reihe von Modifikationen¹⁶ dar, die sich auf die Funktion eines Produkts auswirken könnten. Die Mikrokapillarzonenelektrophorese (mCZE) ist eine Technik, die eine wesentlich schnellere Analysezeit im Vergleich zu herkömmlichen Kationenaustausch(CEX)-Chromatographien und kapillaren isoelektrischen Fokussierungsmethoden (cIEF) bietet, die für die Chargenvariantenanalyse verwendet werden^{17 ,18}. Verbrauchte Bioreaktormedien wurden analysiert, um den Aminosäureverbrauch während der Proteinproduktion zu verfolgen, da sie sich auf Veränderungen der identifizierenden Eigenschaften des Antikörpers beziehen^{19,20,21,22 , 23}.

Proteinanalysen ermöglichen es uns, kritische Prozessparameter (CPPs) basierend auf den Beziehungen zwischen Prozesseingaben und Änderungen in CQAs zu identifizieren. Während der Bioprozessentwicklung demonstriert die Identifizierung und Messung von CPPs grundsätzlich die Prozesssteuerung und stellt sicher, dass sich das Produkt nicht verändert hat, was in stark regulierten Fertigungsumgebungen unerlässlich ist. In diesem Beitrag werden Analysetechniken zur Messung einiger biochemischer Eigenschaften des Proteins vorgestellt, das am relevantesten für Produkt-CQAs (N-Glykanprofil, Ladungsvarianten und Größenhomogenität) ist.

1. Reinigung von Antikörpern

HINWEIS: Der Ausgleichspuffer für den hauseigenen Antikörper beträgt 25 mM Tris, 100 mM NaCl, pH 7.5. Der verwendete Elutionspuffer beträgt 0,1 M Essigsäure. Die Puffer und Harze (Protein A) sind abhängig von dem spezifischen antikörper gereinigt. Das Säulenvolumen entspricht der Betthöhe des Harzes. Die Menge der verwendeten mobilen Phase wird anhand des Spaltenvolumens bestimmt.

1. Initialisierung des Reinigungssystems
   1. Öffnen Sie die software, die an das Reinigungssystem angeschlossen ist. Mit manuellen Anweisungen die Säule mit dem Ausgleichspuffer mit einer Durchflussrate von 2 ml/min für 40 min ausdemieren. Beenden Sie den manuellen Lauf nach dem Ausgleich.
   2. Im Bruchkollektor 15 ml konische Rohre platzieren, um gereinigte Antikörper eluate und 50 ml konische Rohre zu sammeln, um durchfließend während der hohen Salzwäsche zu sammeln. Stellen Sie sicher, dass der Bruchkollektor auf die Startposition zurückgesetzt wird, indem Sie den Fraktionskollektor vor dem Beginn des Laufs öffnen und schließen. Der Bruchkollektor wird bei 7 °C gehalten.
      HINWEIS: Der Fraktionskollektor kann manuell unter der Registerkarte Bruchsammler in den Einstellungenzurückgesetzt werden, sowohl für 15 ml als auch für 50 ml Rohre.
2. Probeninjektion
   HINWEIS: Die geerntete Zellkulturflüssigkeit, die in den folgenden Verfahren verwendet wird, wurde aus chinesischen Hamster-Ovarialzellen gewonnen, die in automatisierten Mikrobioreaktoren kultiviert wurden⁹.
   1. Fügen Sie die 0,22 m gefilterte Erntezellkulturflüssigkeit zu einer leeren 12 ml Spritze hinzu, deren Düsenende gedeckelt ist.
   2. Halten Sie die Spritze mit der Düse nach unten, legen Sie den Spritzenkolben ein, bis ein kleiner Teil des Kolbens drin ist. Stellen Sie sicher, dass die Flüssigkeit nicht undicht ist, drehen Sie die Spritze mit der Nachoben-Düse und entfernen Sie die Kappe.
   3. Halten Sie die Spritze noch mit der Nachobendüse, drücken Sie den Zylinder, um Luft zu zerstreuen, bis die Zellkulturflüssigkeit an der Spitze der Düse ist. Setzen Sie die Spritzendüse in den manuellen Injektionsanschluss am Reinigungssystem ein und drehen Sie sie zum Anziehen.
   4. Drücken Sie auf den Kolben, bis die gesamte Probe injiziert ist und in der angeschlossenen 10 ml großen Probenschleife sichtbar ist.
   5. Öffnen Sie die gespeicherte Methodendatei. Speichern Sie die Ergebnisdatei am gewünschten Speicherort, und geben Sie den Dateinamen an, wenn Sie dazu aufgefordert werden. Hit-Lauf, nachdem die Probe in die große Volumen-Sample-Schleife injiziert wurde.
3. Ausführen der Reinigungsmethode
   1. Wählen Sie die gespeicherte Methode aus, und klicken Sie auf Ausführen, wenn Sie von der Instrumentensoftware aufgefordert werden (Schritt 1.2.5).
      HINWEIS: Das System ist so eingerichtet, dass die folgenden Schritte ausgeführt werden. Der Benutzer muss nichts tun, während das Gerät läuft.
   2. Ausgleich der Spalte mit drei Spaltenvolumes (CVs) des Ausgleichspuffers mit einer Durchflussrate von 2 ml/min. Sobald die Spalte ausgeglichen ist, injiziert das System die Probe mit einer Durchflussrate von 1 ml/min in die Spalte.
   3. Ein Rückgang des UV-Signals bei 280 nm zeigt an, dass die Probe geladen ist. Waschen Sie die Säule mit Ausgleichspuffer mit einer Durchflussrate von 2 ml/min, bis das UV-Signal unter 25 mAU fällt.
   4. Verwenden Sie vier Lebensläufe mit 25 mM Tris mit 1 M NaCl bei pH 7,5, um eine sekundäre Hochsalzwäsche mit einer Durchflussrate von 2 ml/min durchzuführen. Der Systemfraktionssammler sammelt jedes Protein/DNA, das während der Salzwäsche in 50 ml-Rohren aus der Säule kommt.
   5. Wenden Sie fünf Lebensläufe mit einem Durchfluss von 1 ml/min auf, um den Antikörper aus der Säule zu löschen. Sammeln Sie das Eluat in 15 ml-Röhren auf Basis von UV-Signal; wenn das UV 280-Signal über 35 mAU liegt, beginnt die Sammlung; Sammlung endet, wenn das Signal unter 50 mAU fällt; dies wird Als Peak Cutting bezeichnet.
      ANMERKUNG: Peak Cutting sorgt für eine Normalisierung der Elutionsprofile und um Elutionpeak Tailing zu vermeiden, die Proteinaggregate enthalten können²⁴.
   6. Waschen Sie die Spalte mit drei Lebensläufen des Ausgleichspuffers. Der Lauf endet nach dem Waschschritt.
   7. Nach der Elution neutralisieren Sie das gereinigte Protein sofort mit 1 M Tris-Basis auf einen pH-Wert von 5,5 .. Messen Sie die Proteinkonzentration mit einem Mikrovolumen UV-Vis Spektralphotometer bei 280 nm und 260 nm und lagern Sie bei 4 °C.
   8. Konzentrieren Sie den gereinigten Antikörper mit Zentrifugaleinheiten (Schritt 2). Dann unterziehen Sie den gereinigten Antikörper der Glykan-Analyse mit LC-MS und nach der Aggregationsprofilanalyse mit SEC-MALS (Schritte 3 & 4).
      HINWEIS: Der gereinigte Antikörper sollte nicht ohne weiteren Pufferaustausch eingefroren werden, da häufige Frost-Tau-Zyklen Aggregation und Niederschlag verursachen können.

2. Konzentration von gereinigtem Antikörper

HINWEIS: Der Tris-Acetat-Puffer ist 0,1 M Essigsäure neutralisiert mit 1 M Tris Base auf einen pH-Wert von 5,5 .

1. 100 kDa-Filter in Zentrifugenrohre einlegen.
2. Waschen Sie die Filter mit 500 l doppeldestilliertem Wasser. Zentrifuge für 10 min bei 14.000 x g bei Raumtemperatur (RT). Wiederholen Sie diesen Schritt zweimal. Filtrat entsorgen.
3. Übertragen Sie die geriderten Filter in frische Zentrifugenrohre und fügen Sie jedem Filter 500 l Probe hinzu. Zentrifuge für 10 min bei 14.000 x g.
4. Invertieren Sie den Filter in ein frisches Spinrohr. Zentrifugieren Sie 2 min bei 1.000 x g, um die konzentrierte Probe zu sammeln.
5. Bestimmen Sie die Probenkonzentrationen mit einem UV-Vis-Spektrophotometer. Leeren Sie das Spektralphotometer mit einer Lösung des Tris-Acetat-Puffers. Verwenden Sie einen Proteinextimtumkoeffizienten von 1,37 ml•(mg•cm)^-1 bei 280 nm für eine 1% (% m/v) IgG-Lösung.
6. Verwenden Sie die konzentrierte Probe, um 12,5 l mit 2 mg/ml Arbeitslösung für die Glykananalyse und 30 l 3,5 mg/ml Arbeitslösung für SEC-MALS vorzubereiten.
   HINWEIS: Das Protokoll kann hier angehalten werden. Die Proben sollten bei 4 °C gekühlt werden. Bei einer Konzentration von 2 mg/ml sollten diese Proben mindestens drei Monate bei 4 °C stabil sein, während höhere Konzentrationen ausfallen könnten.

3. Analyse von N-Glykanen mittels Massenspektroskopie

1. N-Glycan-Etikettierung und Isolierung
   1. Beginnen Sie mit Antikörperkonzentrationen von 2 mg/ml in einem geeigneten Puffer wie neutralem Natriumphosphat, Citrat oder HEPES-Puffer. Bereiten Sie einen intakten mAb-Standard (z. B. NIST mAb) mit 2 mg/ml vor, um neben den experimentellen Proben als Positivkontrolle zu arbeiten.
      HINWEIS: Die Antikörper sollten sich in einem Endpuffer befinden, der keine SDS und weniger als 0,1 mM Nucleoophile (wie Tris, DTT, Glycin oder Histidin) enthält. SDS im Beispielpuffer müssen entfernt werden. Wenn sich Nucleophile im Puffer befinden, verdünnen Sie sie oder führen Sie einen Pufferaustausch durch, da sie das Kit stören. Das allgemeine Protokoll ist mit dem Glykan-Kit versehen.
   2. Verdünnen Sie 7,5 l der Antikörper mit 15,3 l LC-MS-Wasser in 1 ml-Röhrchen, die mit dem Kit geliefert werden, und denaturieren Sie dann mit 6 l l 5%-Lösung eines enzymfreundlichen und MS-freundlichen Tensids bei 90 °C für 3 min.
   3. Kühlen Sie die Proben für 3 min auf Raumtemperatur (RT). Dann 1,2 l PNGase F hinzufügen und 5 min bei 50 °C brüten.
   4. Nach dem Abkühlen von 3 min auf RT die gespalteten N-Glykane mit 12 L fluoreszierendem Tagging-Reagenz in wasserfreiem Dimethylformamid (DMF) abstempeln und 5 min. warten. Verdünnen Sie die markierte N-Glykan-Mischung mit 358 l Acetonitril (ACN).
   5. Legen Sie eine hydrophile Interaktionschromatographie (HILIC) Platte in einen Vakuumkrümmer mit Shims und Abfallschale. Verwenden Sie eine Mehrkanalpipette für eine große Anzahl von Proben.
   6. Konditionieren Sie die Brunnen mit 200 l Wasser, wo das Vakuum so eingestellt wird, dass die Flüssigkeit 15-30 s dauert, um das HILIC-Harz zu passieren. Gleichgewicht mit 200 l 85 % ACN vor dem Laden des ACN-verdünnten glykanierten Glykangemischs (400 l), wobei das Vakuum nach dem Zuführen jeder neuen Flüssigkeit in die Brunnen aufgebracht wird. Waschen Sie das Harz zweimal mit 600 l 1% Ameisensäure (FA)/90% ACN.
   7. Ersetzen Sie die Abfallwanne durch 600 L Sammelrohre. Die beschrifteten N-Glykane mit SPE-Elutionspuffer (3 Eluionen zu je 30 L) in die Sammelröhrchen geben. Verdünnen Sie die gepoolten Eluionen mit 310 l DMF/ACN-Probenverdünnung. Pipette der Proben in Auto Sampler-Fläschchen, um für die Fluoreszenz-MS-Analyse bereit zu sein.
      HINWEIS: Diese Proben sind stabil, wenn sie mindestens 1 Monat bei -80 °C gelagert werden. Bewahren Sie die HILIC-Platte in der Originalverpackung auf, verklebt geschlossen und in einem Trockenschrank für die zukünftige Verwendung.
2. LC-MS-Analyse von markierten N-Glykanen
   1. Analysieren Sie die beschrifteten N-Glykan-Elutionsproben auf einem Ultra Performance Liquid Chromatography (UPLC)-System, das an einen Fluoreszenzdetektor und ein Quadrupol-Massenspektrometer (Q-ToF) gekoppelt ist. Verwenden Sie eine Säule, die für die chromatographische Trennung der beschrifteten Glykane und Wärme auf 60 °C während der Trennungen zugelassen ist.
      HINWEIS: Die Säule muss vor der Verwendung mit 60 %Acetonitril und 40 % H2 O gespült werden: 50 Lebensläufe vor der ersten Verwendung oder 20 Lebensläufe, wenn die Säule zuvor verwendet wurde.
      1. Verwenden Sie 50 mM Ammoniumformat (AmF) (hergestellt mit mobilem Phasenkonzentrat) und 100% LC-MS-Grade ACN für die mobilen Phasen. Das AmF ist empfindlich auf pH-Änderungen und ist 1 Monat nach dem Mischen nutzbar. Stellen Sie den Anfänglichen Durchfluss auf 0,4 ml/min ein, wobei der LC-Gradient während der Elutionsphase eine Erhöhung des AmF bietet.
      2. Stellen Sie den FLR-Detektor auf EX 265/EM 425 nm mit einer Abtastrate von 2 Hz ein. Stellen Sie den Q-ToF auf MS1-Positivionenempfindlichkeitsmodus ein, mit einem Massenbereich von 100-2.000 Daltons (Da), einer Scanzeit von 0,25 Sekunden und einer Kontinuumsdatenerfassung. Verwenden Sie Leucin-Enkephalin (2 ng/l in 50% ACN/0.1% FA) für die interne Massenreferenz im Modus "Korrektur nicht anwenden".
         HINWEIS: Die interne Massenreferenzkorrektur wird später während der Datenverarbeitung angewendet.
      3. Setzen Sie die Dextranleiter sequenziell in 22,5 l h₂O, 25 l DMF und 52,5 l ACN wieder auf. Bereiten Sie 10 L Aliquots für die Lagerung bei -80 °C vor, da die Leiter bei höheren Temperaturen nicht für mehr als 24 h stabil ist (Raumtemperatur, 4 °C). Die Dextranleiter verschlechtert sich nach mehr als einem Frost-Tau-Zyklus.
      4. Legen Sie die Proben in den auf 10 °C eingestellten Auto-Sampler. Laden Sie eine Durchstechflasche mit Dextranleiter zusammen mit Proben, da die Aufbewahrungszeitinformationen der Leiter für Zuweisungen verwendet werden, während die Masseninformationen verwendet werden, um Identifikationen zu validieren. Verwenden Sie 10 L-Injektionen für die Proben und 7,5 L-Injektionen für die Leiter. Injektion von Proben in dreifacher Ausfertigung. Führen Sie die geladene Methode aus.
3. N-Glyglykan-Identifikation für LC-MS-Daten
   1. Führen Sie datenverarbeitung mit einem Programm durch, das für hydrophile Interaktionschromatographie-Fluoreszenz-Massenspektrometriedaten (HILIC-FLR-MS) optimiert ist.
   2. Wenden Sie interne Massenreferenzkorrekturen innerhalb des Programms an. Bestimmen Sie die Dextranleiterinjektionen in den Probeninformationenals "Standard". Legen Sie in der Analysemethodedie Retentionszeiten der Separation Compound auf die der Leiterverbindungen fest, die während des Laufs nachgewiesen wurden.
   3. Um sicherzustellen, dass Fläche % für identifizierte Glykane zurückgegeben wird, ändern Sie die Analysemethode: Klicken Sie unter der Registerkarte Verarbeitung auf Quantitationseinstellungen - Kalibrieren und setzen Sie "Kalibrierungskurvenanpassungstyp" auf "Relative Antwort (%)".

4. Analyse der Antikörperaggregation mit SEC-MALS

1. Probenvorbereitung
   1. Übertragen Sie das 3,5 mg/ml (Schritt 2) verdünnte Protein in eine Durchstechflasche mit einem 150-L-Glaseinsatz. Verwenden Sie eine Gel-Ladespitze, um in die untere Glocke des Einsatzes zu pfeifen, um das Einbringen von Blasen zu vermeiden.
   2. Die Durchstechflasche mit einer Septa-Kappe kappen und sofort analysieren. Bei einer späteren Analyse bei 4 °C lagern.
2. SEC-MALS Konfiguration und Ausgleich
   HINWEIS: Analysieren Sie die Aggregation auf SEC-MALS, die mit einer Ultra-Hochdruck-Flüssigkeitschromatographie (UHPLC) konfiguriert ist, mit einem MALS-Detektor und einem Brechungsindexdetektor, der von der MALS-Software gesteuert wird.
   1. Konfigurieren Sie eine Methodendatei in der UHPLC-Software zur Steuerung des UHPLC-Systems, die Denkrate auf 0,4 ml/min mit einer mobilen Phase von 1x Phosphatgepufferte Saline (PBS) (verdünnt von 10x), das Injektionsvolumen auf 5 l, die Säulentemperatur auf 25 °C und den Dioden-Array-Detektor (DAD) zur Überwachung von 280 nm. Stellen Sie die Laufzeit auf 20 min. Stellen Sie das System mindestens 4 h vor jeder Probenanalyse aus.
   2. Die Schnittstelle zwischen UHPLC- und Multi Angle Light Scattering - Refractive Index (MALS-RI)-Detektoren erfordert die Verwendung des analogen Ausgangs am DAD. Legen Sie die DAD-Dämpfung in der DAD-Methodendatei auf 1.000 mAU und die AU/UV-Einstellung auf 1 (UV-Instrument>Kanäle>Kanal 1) fest.
   3. Schalten Sie die DAD-Lampe 30 min vor Beginn der Analyse ein und stellen Sie die Wellenlänge auf 280 nm ein. Gleichzeitig bereinigen Sie die Referenzzelle Refractive Index (RI) für 15 min oder bis die Baseline stabil ist, und schließen Sie dann die Referenzzelle.
   4. Konfigurieren Sie die SEC-MALS-Softwaresequenz, setzen Sie die Entnahmezeit auf 12 min, das Injektionsvolumen auf 5 l, den dn/dc auf 0,185 mL/g, den A280-Aussterbekoeffizienten, wenn zuvor experimentell bestimmt oder auf 1,37 mL*(mg*cm)^-1, und die Konzentration des probe. Klicken Sie auf Ausführen, und warten Sie, bis das Dialogfeld "Warten auf Injektion" auf dem Bildschirm angezeigt wird.
      HINWEIS: Der A280-Aussterbekoeffizient ist spezifisch für das Protein von Interesse und sollte experimentell bestimmt werden.
   5. Konfigurieren Sie eine Beispielliste in der UHPLC-Software in der gleichen Reihenfolge wie in der MALS-RI-Software und senden Sie sie ab.
      HINWEIS: Es ist wichtig, eine Systemeignungsprüfung vor und nach einem Lauf durchzuführen. Rinderserumalbumin wird in der Regel verwendet, um nach einer Spitzenverbreiterung zu suchen, ein Zeichen dafür, dass die SEC-Säule möglicherweise gereinigt oder ersetzt werden muss. Die gleiche BSA-Standardinjektion kann verwendet werden, um Signalausrichtung, Peak-Broading und Detektornormalisierung zu spezifizieren.
3. Aggregierte Analyse mit MALS Software
   1. Klicken Sie auf die Registerkarte Mitdernzahlen. Geben Sie die erforderliche Mindestanzahl an Entbehrung an. keine ist in der Regel ausreichend.
   2. Stellen Sie sicher, dass die Basislinien korrekt gezeichnet wurden, und passen Sie ggf. für LS1-, LS2-, LS3-, RI- und UV-Kanäle an. Legen Sie den Spitzenbereich fest.
   3. Überprüfen Sie die molekulare Massenverteilung, um zu bestätigen, dass die genannten Spitzen Partikel ähnlicher Größe enthalten.

5. Chargenvariantenanalyse

1. Probenvorbereitung und Etikettierung
   1. Beginnen Sie mit 80 l einer 3,5 mg/ml Antikörperlösung. Entsalzen Sie die Probe mit einer 0,5 ml Entsalzungssäule (7k MWCO). Bereiten Sie die Säule vor, indem Sie zuerst den unteren Stopfen abfangen, dann den oberen Stopfen lösen und in ein 1,7 ml Mikrozentrifugenrohr legen. Zentrifugieren Sie die Entsalzungssäule für 1 min bei 1.500 x g.
      HINWEIS: Markieren Sie das Äußere der Säule mit einem Punkt, damit es in der ursprünglichen Ausrichtung für die nächsten Schritte platziert werden kann.
   2. Übertragen Sie die Säule in ein neues Mikrozentrifugenrohr. Fügen Sie die 80 l des verdünnten Proteins an den oberen Rand der Säule. Richten Sie die Spalte an der ursprünglichen Ausrichtung aus. Zentrifuge für 2 min bei 1.500 x g. Entfernen Sie die Probe aus der Zentrifuge, verwerfen Sie die Entsalzungssäule und mischen Sie die Probe gut.
      HINWEIS: Eine Entsalzung ist nur erforderlich, wenn die Probenmatrix primäre Aine, Hilfsstoffe, die die Probenelektrophorese stören, oder andere inkompatible Substanzen enthält.
   3. Verdünnen Sie die Probe auf eine Endkonzentration von 2 mg/ml in einem Volumen von 25 l und fügen Sie 5 l des Etikettierpuffers (siehe Tabelle der Materialien: Charge Variant Reagent Kit) in die 96-Well-Platte. Bereiten Sie das Etikettierungsreagenz vor, indem Sie die erforderliche Menge an Etikettierungsreagenz verdünnen (siehe Tabelle der Materialien: Charge Variant Reagent Kit) 1:30 in Dimethylformamid. Inkubieren Sie die Probe für 10 min bei Raumtemperatur weg vom Licht.
      HINWEIS: Es ist wichtig, aufzutauen und dann sofort dieses Reagenz zu verwenden und es innerhalb von 10 min nach dem Mischen mit DMF zu verwenden.
   4. Nach der Inkubation 60 l Reagenzwasser hinzufügen und durch Pipettieren gut vermischen. Bedecken Sie die Platte mit einer Plattendichtung und zentrieren Sie die Platte bei 1.000 x g für 1 min.
2. Vorbereiten des Ladevariantenchips
   1. Bereiten Sie den Charge Variant Chip vor, indem Sie die Aufbewahrungslösung entfernen und die Brunnen 1, 3, 4, 7, 8 und 10 mit Wasser waschen. Ersetzen Sie dann das Wasser durch pH 7.2 Laufpuffer (siehe Tabelle der Materialien: Charge Variant Reagent Kit).
   2. Fügen Sie dem Pufferrohr 750 l pH 7,2-Laufpuffer hinzu und platzieren Sie das Pufferrohr an der angegebenen Stelle in der oberen linken Ecke des Probenfachs. Entfernen Sie nun die Plattendichtung von der 96-Well-Platte, drücken Sie die Entladeplatte auf der Benutzeroberfläche des Geräts und legen Sie die Platte in das GXII-Probenfach ein.
      HINWEIS: für diese Analyse wurden pH-Puffer von 7,2 verwendet. je nach Protein-pI können pH-Puffer von 5,6-7,2 verwendet werden. Bei Verwendung niedrigerer pH-Puffer sind möglicherweise längere Ablaufzeiten erforderlich.
   3. Drücken Sie die Taste Chip entladen auf der Benutzeroberfläche. Stellen Sie sicher, dass die Elektroden frei von Partikeln sind, und, falls nicht, mit einem fusselfreien Tupfer reinigen. Achten Sie beim Einsetzen des Chips darauf, dass das Fenster in der Mitte des Chips frei von Partikeln oder Flecken ist. Bei Bedarf mit einem fusselfreien weichen Tuch reinigen.
      HINWEIS: Entfernen Sie bei der Arbeit mit Kapillarelektrophorese-Chips den Puffer durch Vakuumabsaugung, gefolgt von der sofortigen Zugabe der nächsten Lösung, um das Austrocknen von Brunnen zu verhindern. Um das Einbringen von Blasen zu minimieren, üben Sie Reverse Pipetting-Technik. Achten Sie beim Umgang mit dem Chip auf die zerbrechliche Kapillare, die sich von der Unterseite des Chips ausdehnt, und achten Sie darauf, dass er nicht austrocknet und nicht durch grobe Handhabung bricht.
   4. Schließen Sie den Deckel an der Chipkammer und wählen Sie den HT Protein Charge Variant Assay aus. Klicken Sie auf die Schaltfläche Ausführen. Folgen Sie den Anweisungen, um die Probenbohrungen, den Plattentyp, die Testzeit (68, 90 oder 100 s) und den Dateinamen auszuwählen. Klicken Sie am Ende der Eingabeaufforderungen auf Start.
   5. Die Chipreinigung erfordert das Waschen jedes Brunnens 2x mit Wasser, gefolgt von der Zugabe von Storage Buffer (siehe Tabelle der Materialien: Charge Variant Reagent Kit). Sobald Sie sich im Speicherpuffer befinden, ersetzen Sie den Chip im Gerät und wählen Sie auf Aufforderung den HT Protein Charge Assay aus. Wählen Sie auf dem Hauptbildschirm auf der Benutzeroberfläche die Option Waschen aus. Nach Abschluss des Chips entfernen Sie den Chip, wischen Sie die Elektroden mit Wasser und einem fusselfreien Tupfer ab und lagern Sie den Chip bei 4 °C.
3. Chargenvariantenanalyse
   1. Öffnen Sie die Instrumentenanalysesoftware. Importieren Sie die Ausführung, indem Sie zu Datei>Datendatei importieren... und klicken Sie auf die gewünschte *.gxd-Datei. Nur der Name wird auf Software übertragen, daher ist das Umbenennen der Brunnen vorteilhaft (Tools > Sample Name Editor). Wählen Sie die zu exportierenden Dateien aus, indem Sie die Verschiebung gedrückt halten, während Sie die Dateien auswählen. Klicken Sie auf Datei>Exportieren... und wählen Sie das Feld Rohdaten und dann das Feld AIA Format aus.
   2. Öffnen Sie die Registerkarte Projekte durchsuchen in der Analysesoftware. Klicken Sie auf Datenbank>Daten importieren... und wählen Sie das exportierte *aus. CDF-Dateien.
   3. Nach dem Import navigieren Sie zur Registerkarte Injektionen, wählen Sie die zu analysierenden Dateien aus, klicken Sie mit der rechten Maustaste und gehen Sie zu Prozess... Aktivieren Sie in dem angezeigten Fenster das Kontrollkästchen neben Prozess und das Radiofeld "Angegebene Verarbeitungsmethode verwenden" und die gewünschte Verarbeitungsmethode aus dem Dropdownfeld. Wählen Sie im Dropdown-Feld direkt darunter "How:" die Option Kalibrieren und Quantitieren aus. Navigieren Sie nach der Verarbeitung zur Registerkarte Ergebnisse, und überprüfen Sie die Integration der Chromatogramme.
      HINWEIS: Die Verarbeitungsmethode muss für jede Methode überprüft werden. Als Ausgangspunkt sind die Parameter, die für die aktuelle Verarbeitungsmethode verwendet werden, in der Zusatzdatei enthalten.
      ANMERKUNG: Der Export der Daten kann in Form eines Berichts erfolgen oder nur die Spitzenquantifizierung kann exportiert werden. Diese können zur gleichen Zeit wie die Verarbeitung oder aus dem Ergebnisfenster durchgeführt werden.

6. Aminosäureanalyse

1. Einrichten der Standardkurve für die absolute Aminosäurequantifizierung durch LC-MS
   1. Bereiten Sie die erweiterte Aminosäure (EAA) Mischung durch Auflösen 59,45 mg Asn, 59,00 mg Hyp, 65,77 mg Gln und 91,95 mg Trp in 25 ml von 0,1 N HCl. Die Endkonzentration jeder Aminosäure im EAA-Gemisch beträgt 18 nmol/l.
   2. Bereiten Sie die interne Standard-Lagerlösung (ISTD) vor, indem Sie 58,58 mg Nva und 44,54 mg Sar in 50 ml HCl auflösen.
   3. Bereiten Sie die kompletten Aminosäurestandards vor, indem Sie die Aminosäure-Stammlösung mit Ala, Asp, Arg, Cys, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr, Val bei je 1 nmol/L mit dem EAA-Gemisch für endgültige Aminosäurekonzentrationen von 900 , 225, 90, 22,5 und 9 pmol/l. Fügen Sie den vorbereiteten ISTD-Bestand zu den Aminosäurestandards für eine Endkonzentration von entweder 90 pmol/l oder 900 pmol/l hinzu, um "niedrige" und "hohe" interne Standards zu schaffen, die als Positivkontrollen für die Methode verwendet werden können.
   4. Legen Sie die Aminosäurekonzentrationen in Probenfläschchen in den Autosampler des UPLC. Generieren Sie in der Gerätesoftware eine Kalibrierkurve (9 bis 900 pmol/l) basierend auf den Aminosäurestandardkonzentrationen unter Verwendung der folgenden Anweisungen.
   5. Verwenden Sie den Q-ToF in der Elektrospray-Ionisation (ESI) positiven Empfindlichkeitsmodus gekoppelt an einen UPLC für intakte Aminosäureanalyse. Verwenden Sie für die chromatographische Trennung eine normale Phasensäule, die für Aminosäuretrennungen hergestellt ist. Bereiten Sie die folgenden Puffer mit Massenspektrometrie-Reagenzien vor: A = Acetonitril + 0,1% Ameisensäure und B = 100 mM Ammoniumformat. Stellen Sie den LC-Durchfluss auf 0,6 ml/min und die Säulentemperatur auf 40 °C ein.
   6. Verwenden Sie die folgenden 15-minütigen Gradientenbedingungen für Aminosäuretrennungen: 14% B (0-3 min), 14-100% B (3-10 min), 100% B (10-13 min), 100-8% B (13-14 min), 8% B (14-15 min).
   7. Verwenden Sie die Spalten "Sample Type" und "Conc A" im MS-Erfassungsprogramm, um eine Kalibrierkurve für die zukünftige Analyse von Rohbioreaktormedien im Quantifizierungsprogramm zu erstellen. Damit diese Spalten im Erfassungsprogramm angezeigt werden, verwenden Sie den Befehl Anzeige anpassen,... wenn Sie mit der rechten Maustaste auf die obere Menüleiste klicken.
   8. Der Probentyp für die Aminosäurestandards wird "Standard" sein, während die Medienproben "Analyt" sein werden. Füllen Sie die Spalte "Conc A" mit den numerischen Konzentrationen der Normen in den erforderlichen Einheiten (z. B. pmol/L) aus.
   9. Führen Sie die vorbereiteten Aminosäurestandardkonzentrationen mindestens zweimal aus. Überprüfen Sie, ob das UPLC-Instrument und das Massenspektrometer ordnungsgemäß funktionieren, indem Sie die ISTD-Spitzen überprüfen.
   10. Verwenden Sie die Option "Methode bearbeiten" in der Quantifizierungsanwendung, um die Quantifizierungsmethode (*.mdb-Datei) zu erstellen. Definieren Sie alle Aminosäuren, die für die Quantifizierungsanwendung von Interesse sind, wie z. B. den zusammengesetzten Namen, den m/z-Wert und die erwartete Retentionszeit. Ändern Sie hier die Integrationsparameter für die Methode.
   11. Verwenden Sie die erstellte Aminosäuremethode auf den Standardproben, um die Kalibrierkurve zu erstellen. Diese Kurve kann zur Verwendung mit den Medienbeispielen mit dem Befehl Exportieren>Kalibrierung... in eine *.cdb-Datei exportiert werden.
   12. Speichern Sie in der Quantifizierungsanwendung das gewünschte Layout in einer *.qlt-Datei, um es mit "Layout unter speichern..." auf zukünftige Datasets anzuwenden. Name (Einspritzname), Area und Conc sind die wichtigsten Ausgabespalten.
2. Aminosäureanalyse von Rohbioreaktormedien durch LC-MS
   1. Zentrifugen-Rohbioreaktormedien bei 1.962 x g für 5 Minuten und durchqueren einen 0,22 m-Filter.
   2. Nacheiner einer Perchlorsäure-Reinigung, um Protein- und Partikel zu entfernen: Mischen Sie die gefilterten Bioreaktormedien mit 0,4 N HClO₄ im Verhältnis 1:1 und Zentrifuge bei 14.700 x g für 5 min bei RT. Sammeln Sie die geklärten Medien in Autosampler-Durchstechflaschen.
      HINWEIS: Passen Sie das Injektionsvolumen nach Bedarf an, damit die Aminosäurekonzentrationen innerhalb des Kalibrierbereichs liegen. Je nach Instrument kann das Einspritzvolumen zwischen 0,1 l und 10 l eingestellt werden.
   3. Führen Sie Medienproben in dreifacher Richtung von LC-MS aus. Verwenden Sie "Prozessproben" unter dem Quantifizierungsprogramm zusammen mit der Methode (*.mdb) und der Kalibrierdatei (*.cdb). Die Methode und die Kalibrierkurve werden automatisch durch die Quantifizierungsanwendung auf die Rohmedienproben angewendet, sobald alle Injektionen abgeschlossen sind.
   4. Um Daten für die Analyse in einem anderen Programm (z. B. einer Kalkulationstabelle) zu exportieren, verwenden Sie den Befehl "Drucken" und erstellen Sie eine *.xps- oder *.pdf-Datei.

Die geerntete Zellkulturflüssigkeit aus dem automatisierten Mikro-Bioreaktor wird mit hilfe der schnellen Proteinflüssigkeitschromatographie (FPLC) gereinigt, wie in Abbildung 1 zu sehen ist, und die kritischen Qualitätsmerkmale (CQAs) der gereinigten Proteine zeichneten sich durch verschiedene nachgelagerte Analysemethoden. Dies ist ein wesentlicher Vorteil des automatisierten Mikrobioreaktorsystems; Unterschiede in CQAs können schnell über eine Vielzahl von Bedingungen hinweg beurteilt werden. N-Glykandaten von CHO-produzierten mAbs, die durch Massenspektrometrie verarbeitet werden, sollten wie die in Abbildung 2dargestellten Chromatogramme erscheinen. Die Abbildung zeigt einen Vergleich zwischen zwei Chromatogrammen, die zeigen, dass die Mannose 5 Peak (M5) aus einer Probe deutlich niedriger ist. Wenn nur eine laute Basislinie anstelle von Spitzen beobachtet wird, kann dies bedeuten, dass der Chromatographieaufbau fehlerhaft ist oder dass die Prozedur nicht erfolgreich ist. Mithilfe von Steuerelementen kann die Fehlerbehebung vereinfacht werden. Bewerten Sie zunächst die FLR-Spitzen von der Dextran-Leiter aus; diese Spitzen deuten darauf hin, dass das chromatographische System ordnungsgemäß funktioniert. Vergleichen Sie als Nächstes die experimentell erhaltenen Spitzen mit denen eines verarbeiteten intakten mAb-Standards. Wenn Spitzen aus dem Standard sichtbar sind, aber keine Probenspitzen identifiziert werden, wurden die mAb-Proben nicht korrekt verarbeitet. Dies kann auf SDS oder Nucleophil Anwesenheit im Puffer stören n-glykanische Etikettierung und Reinigung sein.

SEC-MALS kann verwendet werden, um zwei weitere CQAs zu bewerten: das Aggregationsprofil und das Molekulargewicht des Antikörpers. Ein repräsentatives SEC-MALS-Chromatogramm ist mit dem in Abbildung 3dargestellten vergleichbar. Die molekulare Massenverteilung und das absolute Molekulargewicht wurden mit der erforderlichen Software mit einem Aussterbekoeffizienten von 1,37 ml*(mg*cm)-1 und einem dn/dc von 0,185 ml/g bestimmt. Da Spitzenaufrufe und festlegen der Baseline in der Software manuell ausgeführt werden, können die Ergebnisse von Benutzer zu Benutzer leicht variieren. Das absolute Molekulargewicht des monomeren IgG1 aus Abbildung 3 beträgt 1,504 x 105 Da bei 0,38 % (blau) und der Komplex höherer Ordnung 7,799 x 105 Da bei 3,0 % (rot). Die Polydispersität der Aggregate ist viel größer als die des Monomers, wie die rote Molmassenverteilung von Peak 1 (Abbildung 3) zeigt. Die geringe Menge an Proben und die Bedeutung der Aggregation als CQA machen diese Technik zu einem sehr wertvollen ergänzenden Analysewerkzeug zum automatisierten Mikrobioreaktorsystem.

Das Ergebnis von mCZE ist ein Elektropherogramm, wie in Abbildung 4, das das Ladungsvariantenprofil für einen monoklonalen Antikörper zeigt. Das Profil ist eine einzigartige Signatur für das untersuchte Protein und ist hochempfindlich gegenüber dem betriebsbereiten pH-Wert. Ebenfalls sichtbar ist eine Freifärbungsspitze links vom Ladungsvariantenprofil. Bei der Festlegung eines Betriebs-pH-Werts gibt es für den Bediener einen gewissen Ermessensspielraum, um Auflösung und Signal auszugleichen; Darüber hinaus muss der Bediener eine gute Trennung von der Freifärbungsspitze gewährleisten, die bei 30 s wandert. Die Probe kann nach der Kennzeichnung entsalzt werden, um diesen Peak zu entfernen, obwohl dies zu einem erheblichen Signalverlust führt. Sobald ein Betriebs-pH-Wert festgestellt ist, können die Probenprofile verglichen werden. Obwohl im Allgemeinen konsistent, können Änderungen der Etikettierungseffizienz oder Unterschiede in den Hilfsstoffen zu geringfügigen Unterschieden bei der Migration einer Probe und dem Ladungsvariantenprofil führen, was elektropherogramme schwer direkt vergleichen lässt. Stattdessen basiert die Vergleichsmethode in der Regel auf den Prozentsätzen der Basis-, Haupt- und Saurierarten. In diesem Fall können mit mCZE relative Unterschiede von nur 1-2% identifiziert werden.

Der Aminosäureverbrauch kann überwacht werden, um festzustellen, ob die Erschöpfung Veränderungen der CQAs verursacht. Mit Chromatogrammauslesungen aus dem Massenspektrometer kann die erfolgreiche Erstellung einer Kalibrierkurve zur absoluten Quantifizierung von Aminosäuren in Rohbioreaktor-Medienproben ausgewertet werden. Abbildung 5 zeigt zwei Gesamtionenchromatogramme (TIC) und ein extrahiertes Ionenchromatogramm (XIC) als repräsentative Ergebnisse während dieses Prozesses. In Abbildung 5Azeigt das gezeigte TIC das Hintergrundsignal aus dem Puffersystem, da nur ein Wasserrohling injiziert wurde. Abbildung 5 B zeigt einen repräsentativen TIC des Aminosäurestandards, bei dem im Vergleich zum Wasserrohling kleine Spitzen beobachtet werden können, die den einzelnen Aminosäurearten entsprechen (z. B. Lysin bei 7,96 Minuten). Um den Peak zu integrieren und die Quantifizierung der Peak-Fläche (und damit der Konzentration) zu erleichtern, wird das XIC verwendet, wo nur das Signal aus einem definierten "Chromatogramm-Massenfenster" angezeigt wird. Je nach Empfindlichkeit des Instruments und Qualität der chromatographischen Trennung muss das optimale Massenfenster vom Anwender bestimmt werden. In diesem Beispiel (Abbildung 5C) wird der XIC von Lysin (m/z = 147.1144) mit einem Massenfenster von 10 ppm gezeigt, wo Lysin im Aminosäurestandard bei 8,03 Minuten aus der Säule ausgeht.

Abbildung 1 . Repräsentatives Chromatogramm des Reinigungsschemas mit der Fast Protein Liquid Chromatography (FPLC) Technik. Reinigungsmethodenphasen, die dem Volumen (mL) entsprechen, werden entlang der x-Achse beschriftet. Die UV-Absorption bei 280 nm (mAU y-Achse, volumenförmige Linie) wird während des gesamten Reinigungszyklus überwacht. Nicht spezifisch gebundene Verunreinigungen werden durch erhöhung der Leitfähigkeit (mS/cm y-Achse, gestrichelte Linie) während der Hochsalzwäsche verdrängt. Antikörper werden aus Protein-A-Säule mit der Einführung eines Elutionspuffers (Conc B, gepunktete Linie) eluiert, wenn der pH-Wert auf 4 (nicht angezeigt). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 2. Ein repräsentatives Fluoreszenzchromatogramm, das aus getaggten Glykanen gewonnen wird, die massenverifiziert sind. Die x-Achse ist die Haltezeit (Minuten), während die y-Achse die Signalintensität ist. Der Peak bei 14,94 min stellt das Mannose 5 (M5) Glycan dar, wobei ein großer Unterschied zwischen der M5-Signalstärke zwischen den beiden überlagerten Proben beobachtet werden kann. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 3. Molekulargewichtsverteilung von IgG1 monoklonalen Antikörpern. Chromatogramm eines intakten monoklonalen IgG1-Antikörpers, getrennt durch Größenausschlusschromatographie in 1x PBS (pH7.4). Die Absorption wird bei 280 nm (schwarz; linke Achse) überwacht und Lichtstreuungs- und Brechungsindexdetektoren wurden verwendet, um das absolute Molekulargewicht jedes Peaks (rot und blau; rechte Achse) zu berechnen. Hochmolekulare Arten werden mit der Spitze mit der Bezeichnung "HMW" angezeigt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 4 . Chargenvariantenprofil eines monoklonalen IgG1-Antikörpers. Dieses Elektropherogramm wird auf einer mCZE-Plattform erzeugt. Ein Freifärbespitzenwanderwert wandert bei 30 s und ist gut vom IgG1 getrennt. Für die Quantifizierung wurden die Spitzen mithilfe von Instrumentendatenanalysesoftware in Basis-, Haupt- und saure Arten aufgeteilt. Die rote Linie umreißt die integrierten Spitzenbereiche. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 5. Repräsentative Ergebnisse der Ionenchromatogramme für die Massenspektrometrie-basierte Aminosäureanalyse von Rohbioreaktormedien. Die x-Achse ist Zeit (Minuten), während die y-Achse Signalintensität ist (A) Ein Wasserrohling dient als Negativkontrolle und zeigt das Hintergrundsignal an, das im Laufe des Flüssigchromatographie-Gradienten beobachtet wird (B) Die 225 pmol/L-Aminosäure Standard wird hier als Positivkontrolle verwendet, da die einzelnen Spitzen, die in diesem Gesamtionenchromatogramm beobachtet werden, die verschiedenen Aminosäuren des Standardmixes darstellen, der chromatographisch aufgelöst wird (C) Ein repräsentativ extrahiertes Ionenchromatogramm für m /z 147.1144, das ist Lysin. Der 7,96 min Spitzenwert in B entspricht dem 8,03-Spitzenwert in C von Lysin. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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