Human periphere Blut Neutrophil Isolation für die Verhör der Parkinson-assoziierten LRRK2 Kinase Weg durch Bewertung Rab10 Phosphorylierung

Ying Fan; Francesca Tonelli; Shalini Padmanabhan; Marco  A.S. Baptista; Lindsey Riley; Danielle Smith; Connie Marras; Andrew Howden; Dario  R. Alessi; Esther Sammler

doi:10.3791/58956

Methodenartikel

Human periphere Blut Neutrophil Isolation für die Verhör der Parkinson-assoziierten LRRK2 Kinase Weg durch Bewertung Rab10 Phosphorylierung

DOI:

10.3791/58956

⸱

21. März 2020

Ying Fan^*¹ , Francesca Tonelli^*¹ , Shalini Padmanabhan² , Marco A.S. Baptista² , Lindsey Riley² , Danielle Smith³ , Connie Marras⁴ , Andrew Howden⁵ , Dario R. Alessi¹ , Esther Sammler¹^,⁶

¹MRC Protein Phosphorylation and Ubiquitylation Unit, School of Life Sciences, University of Dundee, ²The Michael J. Fox Foundation for Parkinson's Research, ³Department of Medical and Molecular Genetics, Indiana University School of Medicine, ⁴Morton and Gloria Shulman Movement Disorders Centre and the Edmond J. Safra Program in Parkinson's Disease, Toronto Western Hospital, University of Toronto, ⁵Division of Cell Signalling and Immunology, School of Life Sciences, University of Dundee, ⁶Division of Molecular and Clinical Medicine, School of Medicine, Ninewells Hospital and Medical School, University of Dundee

^* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Mutationen im Leucin-reichen Repeatkinase-2-Gen (LRRK2) verursachen eine erbliche Parkinson-Krankheit. Wir haben eine einfache und robuste Methode zur Beurteilung der LRRK2-kontrollierten Phosphorylierung von Rab10 bei menschlichen peripheren Blutneutrophilen entwickelt. Dies kann helfen, Personen mit erhöhter LRRK2-Kinase-Signalweg-Aktivität zu identifizieren.

Zusammenfassung

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Die leucinreiche Wiederholungskinase 2 (LRRK2) ist das am häufigsten mutierte Gen bei der erblichen Parkinson-Krankheit (PD) und alle pathogenen LRRK2-Mutationen führen zu einer Hyperaktivierung seiner Kinase-Funktion. Hier beschreiben wir einen einfachen und robusten Test zur Quantifizierung der LRRK2-Kinase-Signalwegaktivität bei menschlichen peripheren Blutneutrophilen, indem wir die LRRK2-kontrollierte Phosphorylierung eines seiner physiologischen Substrate, Rab10 bei Threonin 73, messen. Die beschriebene Immunoblotting-Analyse erfordert einen vollständig selektiven und phosphospezifischen Antikörper, der das von LRRK2 phosphorylierte Rab10 Thr73-Epitop erkennt, wie z. B. den monoklonalen Antikörper MJFF-pRab10 Kaninchen. Es verwendet menschliche periphere Blutneutrophilen, weil peripheres Blut leicht zugänglich ist und Neutrophile ein reichlicher und homogener Bestandteil sind. Wichtig ist, dass Neutrophile relativ hohe Konzentrationen von LRRK2 und Rab10 ausdrücken. Ein potenzieller Nachteil von Neutrophilen ist ihre hohe intrinsische Serinproteaseaktivität, die die Verwendung sehr potenter Proteasehemmer wie dem Organophosphor-Neurotoxin Diisopropylfluorphosphat (DIFP) als Teil des Lysepuffers erfordert. Dennoch sind Neutrophile eine wertvolle Ressource für die Erforschung der LRRK2-Kinase-Signalwegaktivität in vivo und sollten für die Aufnahme in PD-Biorepository-Sammlungen in Betracht gezogen werden.

Einleitung

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Versuche, die Parkinson-Krankheit (PD) zu verlangsamen oder zu stoppen, sind bisher gescheitert. Die Entdeckung hyperaktivierender Mutationen in der leucinreichen Repeatkinase 2 (LRRK2), die das Risiko für PD verursachen und/oder erhöhen, hat zur Entwicklung von LRRK2-Kinase-Inhibitoren¹^,²^,³geführt. Diese sind nun in klinische Studien aufgenommen⁴. Die genaue Funktion von LRRK2 ist unklar, aber ein großer Fortschritt war die Identifizierung einer Teilmenge von Rab GTPase Proteinen, einschließlich Rab10, als die ersten gutgläubigen physiologischen Subst....

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Protokoll

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Gemäß der lokalen britischen Verordnung werden alle Manipulationen und Pipettierungen von menschlichem Blut in einem biologischen Sicherheitsschrank der Kategorie 2 durchgeführt. Alle Verfahren wurden in Übereinstimmung mit dem lokalen Ethik-Überprüfungsausschuss durchgeführt und alle Teilnehmer haben in Kenntnis der Sachlage ihre Zustimmung erteilt.

1. Vorbereitung

Bereiten Sie 0,1 ml EDTA-Lagerlösung 1 mit 100 mM EDTA in phosphatgepufferter Saline (PBS) vor.
Bereiten Sie 60 ml EDTA-Lagerlösung 2 mit 1 mM EDTA in PBS vor.
Vorbereiten von Lysepuffermitenthalten mit 50 mM Tris-HCl (pH = 7,5), 1% (v/v) Triton X-1....

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Ergebnisse

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Unser Assay ermöglicht die Abhörung der PD-assoziierten LRRK2-Kinase bei menschlichen peripheren Blutneutrophilen mit LRRK2-abhängiger Rab10-Phosphorylierung als Auslese. Neutrophile sind eine homogene und reichlich periphere weiße Blutkörperchenpopulation, die hohe Konzentrationen der LRRK2- und Rab10-Proteine ausdrückt (Abbildung 1). Die einzige andere Zellpopulation unter den verbleibenden peripheren mononukleären Blutzellen (PBMCs) mit hoher Kopierzahl beider Proteine sind Monozyten, abe.......

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Diskussion

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Überzeugende klinische, genetische und biochemische Beweise deuten auf eine wichtige Rolle für LRRK2 und insbesondere seine Kinase-Funktion bei der Parkinson-Krankheit^{hin 7}. LRRK2-Kinase-Inhibitoren wurden entwickelt und gehen in klinische Studien²^,⁴^,¹². Daher ist es notwendig, LRRK2 als Biomarker für das Zielengagement sowie die Patientenschichtung zu nutzen. Unser Protokoll beschreibt einen robusten und.......

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Offenlegungen

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Die Autoren haben nichts zu verraten.

Danksagungen

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Wir danken den gesunden Freiwilligen, die freundlicherweise Blut gespendet haben, für die vorliegende Studie. Wir danken der Michael J. Fox Foundation for Parkinson es Research (MJFF) und der Fox BioNet Studienleitung (FBN) für ihre Unterstützung und Ihren Beitrag zum schriftlichen Protokoll und Video. Wir danken Professor Alexander Zimprich von der Universität Wien in Österreich für die Prüfung unseres Protokolls und der Zusammenarbeit. Wir schätzen die Beiträge von Paul Davies zum Projekt (Geschäftsführer der MRC PPU). Wir würdigen auch die hervorragende technische Unterstützung der MRC Protein Phosphorylation and Ubiquitylation Unit (PPU), nämlich Chemical Synthesi....

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
1 mL Pipettenspitzen	Sarstedt	70.762	oder gleichwertig
1,5 mL Mikroröhrchen	Sarstedt	72.690.001	oder gleichwertig
10 mL Pipettenspitzen	Sarstedt	86.1254.025	oder gleichwertig
10 μ L Pipettenspitzen	Sarstedt	70.113	oder gleichwertig
15 mL Falkenröhrchen	Cellstar	188 271	oder gleichwertig
200 μ L Pipettenspitzen	Sarstedt	70.760.002	oder gleichwertig
25 mL Pipettenspitzen	Sarstedt	86.1685.001	oder gleichwertige
50 mL Falkenröhrchen	Cellstar	227 261	oder gleichwertig
BD Vacutainer Hemogard Closure Plastic K2-EDTA Tube	BD	BD 367525	oder gleichwertige
Beckman Coulter Allegra X-15R Zentrifuge	Beckman		oder gleichwertige Zentrifuge mit schwimmendem Schaufelrotator für 15 mL und 50 mL Falcon Röhrchen bei einer Geschwindigkeit von 1000-1200 x g
Biologische Sicherheitswerkbank der Kategorie 2.
cOmplete (EDTA-frei) Proteasehemmer Cocktail	Roche	11836170001
DIFP (Diisopropylfluorphosphat)	Sigma	D0879	0,5 M Stammlösung in Isopropanol unter besonderen Vorsichtsmaßnahmen herstellen
Dimethylsulfoxid	Sigma	6250
Trockeneis oder flüssiger Stickstoff
Dulbecco's phosphatgepufferte Kochsalzlösung	ThermoFisher	14190094	oder gleichwertiger
Easy 50 EasySep Magnet	Stammzelle	18002	zur Aufnahme von 1 x 50 ml konischem Röhrchen
EasySep Direct Human Neutrophil Isolation Kit	Stammzelle	19666	Enthält Lösungen mit der Bezeichnung " Isolations-Cocktail" und " RapidSpheres magnetische Kügelchen
EGTA	Sigma	E3889
Eppendorf Zentrifuge 5417R Zentrifuge	Eppendorf
Ethanol, in Sprühflasche
Ethylendiamintetraessigsäure	Sigma	E6758

(wasserfreie Qualität)	Sigma	278475
Lysepuffer (50 mM Tris-HCl pH 7,5, 1%(v/v) Triton X-100, 1 mM EGTA, 1 mM Na3VO4, 50 mM NaF, 10 mM β-Glycerophosphat, 5 mM Natriumpyrophosphat, 0,27 M Saccharose, 0,1% (v/v) β-Mercaptoethanol, 1x cOmplete(EDTA-frei) Proteaseinhibitor-Cocktail (Roche), 1 μ g/ml Microcystin-LR, 0,5 mM Diisopropylfluorphosphat (DIFP).			alternativ gefrorener Lysepuffer in Aliquoten ohne Microcystin-LR, DIFP erhältlich von MRC-PPU Reagenzien (http://mrcppureagents.dundee.ac.uk/)
Merck LRRK2-Inhibitor II (MLi-2)	Merck	438194-10MG	oder gleichwertig (potenter und selektiver LRRK2-Inhinitor)
Microcystin-LR	Enzo Life Sciences	ALX-350-012-M001	1 mg/ml in DMSO vorrätig und bei -80 oC lagern.
Na3VO4	Aldrich	450243
NaF	Sigma	S7920
Odyssey CLx Scan Western Blot Bildgebungssystem	Odyssey
Permanent Marker Stift
Persönliche Schutzausrüstung
RPMI 1640 Medium	ThermoFisher	21875034	oder
gleichwertiges Natriumpyrophosphat	Sigma	S22
Saccharose	Sigma	S0389
β-Glycerophosphat	Sigma	50020
β-Mercaptoethanol	Sigma	M3148
strong>Empfohlene Antikörper für Western Blotting
Anti-RAB10 (phospho T73) Antikörper [MJF-R21]	abcam	ab230261
Anti-Α-Tubulin	Cell Signaling Technologies	5174	verwendet in 1:2000 Verdünnung
Ziege Anti-Maus IRDye 680LT	LI-COR	926-68020	verwendet in 1:10.000 Verdünnung
Ziege Anti-Maus IRDye 800CW	LI-COR	926-32210	verwendet in 1:10.000 Verdünnung
Ziegen-Anti-Kaninchen-IRDie 800CW	LI-COR	926-32211	verwendet in 1:10.000 Verdünnung
MJFF-Gesamt-Rab10-Maus-Antikörper	erzeugt von nanoTools (nanotools.de)	nicht anwendbar*	verwendet bei 2 & mu; g/ml Endkonzentration; * Der mit nanoTools (www.nanotools.de) [11] erzeugte MJFF-Gesamt-Rab10-Antikörper wird 2018 von der Michael J Fox Foundation vermarktet
Maus-Anti-LRRK2-C-Terminus-Antikörper	Antikörper Incorporated	75-253	verwendet bei 1 μ g/ml Endkonzentration
pS935-LRRK2	MRC PPU Reagenzien und Dienstleistungen	UDD2	bei 1 μ g/ml Endkonzentration

Eis-Isopropanol , <, .

Referenzen

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Paisan-Ruiz, C., et al. Cloning of the gene containing mutations that cause PARK8-linked Parkinson's disease. Neuron. 44 (4), 595-600 (2004).
Fell, M. J., et al.

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Neutrophile Granulozyten aus humanem peripherem Blut Immunoblot Analyse Protease Inhibitor DIFP MLi 2 Inhibitor Parkinson Krankheit Assay periphere Blut Neutrophile Rab10 Thr73

Human periphere Blut Neutrophil Isolation für die Verhör der Parkinson-assoziierten LRRK2 Kinase Weg durch Bewertung Rab10 Phosphorylierung

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