Der Zweck der hier vorgestellten Methode ist es, zu zeigen, wie Mikroumgebungsmikroarrays (MEMA) hergestellt und verwendet werden können, um die Auswirkungen von Tausenden von einfachen kombinatorischen Mikroumgebungen auf den Phänotyp kultivierter Zellen abzufragen.
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Methodenartikel
Verwendung von Mikroarrays zur Vernehmung von Mikroumweltauswirkungen auf zelluläre Phänotypen bei Krebs
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Das Verständnis der Auswirkungen der Mikroumgebung auf den Phänotyp von Zellen ist aufgrund der komplexen Mischung sowohl aus löslichen Wachstumsfaktoren als auch matrixassoziierten Proteinen in der Mikroumgebung in vivo ein schwieriges Problem. Darüber hinaus verwenden leicht verfügbare Reagenzien für die Modellierung von Mikroumgebungen in vitro in der Regel komplexe Mischungen von Proteinen, die unvollständig definiert sind und unter der Variabilität von Charge zu Charge leiden. Die Microenvironment Microarray (MEMA)-Plattform ermöglicht die Bewertung tausender einfacher Kombinationen von Mikroumweltproteinen für ihre Auswirkungen auf zelluläre Phänotypen in einem einzigen Test. Die MEMAs werden in Brunnenplatten hergestellt, was die Zugabe einzelner Liganden ermöglicht, um Brunnen zu trennen, die arrayierte extrazelluläre Matrixproteine (ECM) enthalten. Die Kombination des löslichen Liganden mit jedem gedruckten ECM bildet eine einzigartige Kombination. Ein typischer MEMA-Assay enthält mehr als 2.500 einzigartige kombinatorische Mikroumgebungen, denen Zellen in einem einzigen Assay ausgesetzt sind. Als Testfall wurde die Brustkrebszelllinie MCF7 auf der MEMA-Plattform plattiert. Die Analyse dieses Assays identifizierte Faktoren, die das Wachstum und die Proliferation dieser Zellen sowohl verbessern als auch hemmen. Die MEMA-Plattform ist hochflexibel und kann für den Einsatz mit anderen biologischen Fragen über die Krebsforschung hinaus erweitert werden.
Einleitung
Die Kultivierung von Krebszelllinien auf Kunststoff in zweidimensionalen (2D) Monolayern bleibt eines der Wichtigsten Arbeitspferde für Krebsforscher. Jedoch, die Mikroumgebung wird zunehmend für seine Fähigkeit, zelluläre Phänotypen zu beeinflussen erkannt. Bei Krebs, die Tumor-Mikroumgebung ist bekannt, mehrere zelluläre Verhaltensweisen beeinflussen, einschließlich Wachstum, Überleben, Invasion, und Reaktion auf Therapie1,2. Herkömmliche monolayer Zellkulturen haben in der Regel keine Mikroumgebungseinflüsse, was zur Entwicklung komplexerer dreidimensionaler (3D) Assays zum Wachsen von Zellen geführt hat, e....
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Protokoll
HINWEIS: Eine Übersicht über den gesamten MEMA-Prozess, einschließlich der geschätzten Zeit, ist im Flussdiagramm in Abbildung 1dargestellt. Dieses Protokoll beschreibt die Herstellung von MEMAs in 8-Well-Platten. Das Protokoll kann für andere Platten oder Dias angepasst werden.
1. Herstellung von Protein-, Verdünnungs- und Färbepuffern
- Ausgleich durch Fläschchen von ECMs, Liganden und Zytokinen auf Raumtemperatur (RT) und kurz Zentrifuge. Fügen Sie das entsprechende Volumen des entsprechenden RT-Puffers hinzu, wie auf dem Produktdatenblatt angegeben. Folgen Sie der Empfehlung des Her....
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Ergebnisse
Um die Auswirkungen der Mikroumwelt auf das Zellwachstum und die Zellproliferation zu vereinfachen und Bedingungen zu identifizieren, die das Zellwachstum und die Zellproliferation förderten oder hemmten, wurde die Brustkrebszelllinie MCF7 auf einer Reihe von acht 8-Well-MEMAs gesät, wie im Protokoll beschrieben. Dieser Assay setzte die Zellen 48 verschiedenen EKMs und 57 verschiedenen Liganden für insgesamt 2736 kombinatorische mikroökologische Bedingungen aus. Nach 71 h in der Kultur wurden Zellen mit EdU gepulst, fixi.......
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Diskussion
Die Bedeutung von "Dimensionalität" und Kontext war ein motivierender Faktor bei der Entwicklung von In-vitro-Kultursystemen als Werkzeuge für die Charakterisierung von Krebszellen durch ihre Interaktion mit der Mikroumgebung11und die Fähigkeit von In-vitro-Kultursystemen Kultursysteme, um die in vivo-Umgebung nachzuahmen, sind eine treibende Kraft hinter dem Streben, diese Kultursysteme zu verbessern. In-vitro-Systeme bleiben jedoch wichtige Instrumente der Krebsforschung gerade wegen ihrer Fähig.......
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Offenlegungen
Die Autoren haben nichts zu verraten.
Danksagungen
Diese Arbeit wurde von der NIH Common Fund Library of Network Cellular Signatures (LINCS) gefördert, die HG008100 (J.W.G., L.M.H. und J.E.K.) gewährte.
....Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| Aushon 2470 | Aushon BioSystems | Arrayer-Robotersystem, das im Protokoll Nikon | |
| HCA | verwendet wird Nikon | High Content Imaging System, das um Nikon Eclipse Ti Inverses Mikroskop herum entwickelt | |
| wurde BioTek Precision XS Liquid Handler | BioTek | Liquid Handling | |
| verwendet wird Trizma Hydrochlorid-Pufferlösung | Sigma | T2069 | |
| EDTA | Invitrogen | 15575-038 | |
| Glycerol | Sigma | G5516 | |
| Triton X100 | Sigma | T9284 | |
| Tween 20 | Sigma | P7949 | |
| Kolliphor P338 | BASF | 50424591 | |
| 384-Well-Microarray-Platte, zylindrische Welle | Thermo Fisher | ab1055 | |
| Nunc 8 well dish | Thermo Fisher | 267062 | |
| Paraformaldehyd 16% Lösung | Elektronenmikroskopie Science | 15710 | |
| BSA | Fisher | BP-1600 | |
| Natriumazid | Sigma | S2002 | |
| Zellmaske | Molekulare Sonden | H32713 | |
| Click-iTEdU Alexa Fluor | Molekulare Sonden | C10357 | |
| DAPI | Promo Kine | PK-CA70740043 | |
| ALCAM | R & D Systems | 656-AL | ECM |
| Cadherin-20 (CDH20) | R & R & D Systems | 5604-CA | ECM |
| Cadherin-6 (CDH6) | R & D Systems | 2715-CA | ECM |
| Cadherin-8 (CDH8) | R & R & D Systems | 188-C8 | ECM |
| CD44 | R & D Systems | 3660-CD | ECM |
| CEACAM6 | F&R & D Systems | 3934-CM | |
| ECM Kollagen I | Cultrex | 3442-050-01 | ECM |
| Kollagen Typ II | Millipore | CC052 | ECM |
| Kollagen Typ III | Millipore | CC054 | ECM |
| Kollagen Typ IV | Sigma | C5533 | ECM |
| Kollagen Typ V | Millipore | CC077 | ECM |
| COL23A1 | R & D Systems | 4165-CL | ECM |
| Desmoglein 2 | R & R & D Systems | 947-DM | ECM |
| E-Cadherin (CDH1) | R & D Systems | 648-EC | ECM |
| ECM1 | R & D Systems | 3937-EC | ECM |
| Fibronektin | F & T & D Systems | 1918-FN | ECM |
| GAP43 | Abcam | ab114188 | ECM |
| HyA-500K | R & D Systems | GLR002 | ECM |
| HyA-50K | R & D Systems | GLR001 | ECM |
| ICAM-1 | R & D Systems | 720-IC | ECM |
| Laminin Sigma | L6274 | ECM | |
| Laminin-5 | Abcam | ab42326 | ECM |
| Lumican | R & Ltd D Systems | 2846-LU | ECM |
| M-Cad (CDH15) | R & D Systems | 4096-MC | ECM |
| Nidogen-1 | R & D Systems | 2570-ND | ECM |
| Osteoadherin/OSAD | R & D Systems | 2884-AD | ECM |
| Osteopontin (SPP) | R & R & D Systems | 1433-OP | ECM |
| P-Cadherin (CDH3) | R & D Systems | 861-PC | ECM |
| PECAM1 | R & D Systems | ADP6 | ECM |
| Tenascin C | R & D Systems | 3358-TC | ECM |
| VCAM1 | R & D Systems | ADP5 | ECM |
| Vitronectin | R & D Systems | 2308-VN | ECM |
| Biglycan | R & ; T & D Systems | 2667-CM | ECM |
| Decorin | R & ; D Systems | 143-DE | ECM |
| Periostin | R & T & D Systems | 3548-F2 | ECM |
| SPARC/Osteonektin | R & D Systems | 941-SP | ECM |
| Thrombospondin-1/2 | R & R & D Systems | 3074-TH | ECM |
| Brevican | R & ; D Systems | 4009-BC | ECM |
| Elastin | BioMatrix | 5052 | ECM |
| Fibrillin | Lynn Sakai Lab OHSU | N/A | ECM |
| ANGPT2 | RnD_Systems_Own | 623-AN-025 | Ligand |
| IL1B | RnD_Systems_Own | 201-LB-005 | Ligand |
| CXCL8 | RnD_Systems_Own | 208-IL-010 | Ligand |
| IGF1 | RnD_Systems_Own | 291-G1-200 | Ligand |
| TNFRSF11B | RnD_Systems_Own | 185-OS | Ligand |
| BMP6 | RnD_Systems_Own | 507-BP-020 | Ligand |
| FLT3LG | RnD_Systems_Own | 308-FK-005 | Ligand |
| CXCL1 | RnD_Systems_Own | 275-GR-010 | Ligand |
| DLL4 | RnD_Systems_Own | 1506-D4-050 | Ligand |
| HGF | RnD_Systems_Own | 294-HGN-005 | Ligand |
| Wnt5a | RnD_Systems_Own | 645-WN-010 | Ligand |
| CTGF | Life_Technologies_Own | PHG0286 | Ligand |
| LEP | RnD_Systems_Own | 398-LP-01M | Ligand |
| FGF2 | Sigma_Aldrich_Own | SRP4037-50UG | Ligand |
| FGF6 | RnD_Systems_Own | 238-F6 | Ligand |
| IL7 | RnD_Systems_Own | 207-IL-005 | Ligand |
| TGFB1 | RnD_Systems_Own | 246-LP-025 | Ligand |
| PDGFB | RnD_Systems_Own | 220-BB-010 | Ligand |
| WNT10A | Genemed_Own | 90009 | Ligand |
| PTN | RnD_Systems_Own | 252-PL-050 | Ligand |
| BMP3 | RnD_Systems_Own | 113-BP-100 | Ligand |
| BMP4 | RnD_Systems_Own | 314-BP-010 | Ligand |
| TNFSF11 | RnD_Systems_Own | 390-TN-010 | Ligand |
| CSF2 | RnD_Systems_Own | 215-GM-010 | Ligand |
| BMP5 | RnD_Systems_Own | 615-BMC-020 | Ligand |
| DLL1 | RnD_Systems_Own | 1818-DL-050 | Ligand |
| NRG1 | RnD_Systems_Own | 296-HR-050 | Ligand |
| KNG1 | RnD_Systems_Own | 1569-PI-010 | Ligand |
| GPNMB | RnD_Systems_Own | 2550-AC-050 | Ligand |
| CXCL12 | RnD_Systems_Own | 350-NS-010 | Ligand |
| IL15 | RnD_Systems_Own | 247-ILB-005 | Ligand |
| TNF | RnD_ Systems_Own | 210-TA-020 | Ligand |
| IGFBP3 | RnD_Systems_Own | 675-B3-025 | Ligand |
| WNT3A | RnD_Systems_Own | 5036-WNP-010 | Ligand |
| PDGFAB | RnD_Systems_Own | 222-AB | Ligand |
| AREG | RnD_Systems_Own | 262-AR-100 | Ligand |
| JAG1 | RnD_Systems_Own | 1277-JG-050 | Ligand |
| BMP7 | RnD_Systems_Own | 354-BP-010 | Ligand |
| TGFB2 | RnD_Systems_Own | 302-B2-010 | Ligand |
| VEGFA | RnD_Systems_Own | 293-VE-010 | Ligand |
| IL6 | RnD_Systems_Own | 206-IL-010 | Ligand |
| CXCL12 | RnD_Systems_Own | 351-FS-010 | Ligand |
| NRG1 | RnD_Systems_Own | 378-SM | Ligand |
| IGFBP2 | RnD_Systems_Own | 674-B2-025 | Ligand |
| SHH | RnD_Systems_Own | 1314-SH-025 | Ligand |
| FASLG | RnD_Systems_Own | 126-FL-010 | Ligand |
Referenzen
- Hanahan, D., Coussens, L. M. Accessories to the crime: functions of cells recruited to the tumor microenvironment. Cancer Cell. 21 (3), 309-322 (2012).
- Quail, D. F., Joyce, J. A. Microenvironmental regulation of tumor progression and metastasis. Nature Med....
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Nachdrucke und Genehmigungen
