Anwendungen der räumlich-zeitliche Zuordnung und Partikel-Analyse-Techniken zu quantifizieren, intrazellulären Ca2 + Signalisierung In Situ

Bernard T. Drumm; Grant W. Hennig; Salah A. Baker; Kenton M. Sanders

doi:10.3791/58989

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Methodenartikel

Anwendungen der räumlich-zeitliche Zuordnung und Partikel-Analyse-Techniken zu quantifizieren, intrazellulären Ca^{2 +} Signalisierung In Situ

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DOI:

10.3791/58989

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7. Januar 2019

Bernard T. Drumm¹ , Grant W. Hennig² , Salah A. Baker¹ , Kenton M. Sanders¹

¹Department of Physiology and Cell Biology, University of Nevada Reno School of Medicine, ²Department of Pharmacology, The Robert Larner, M.D. College of Medicine, University of Vermont

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Genetisch codierte Ca^{2 +} Indikatoren (GECIs) haben sich radikal verändert wie in-situ Ca^{2 +} Bildgebung durchgeführt wird. Um die Wiederherstellung von Daten aus solchen Aufnahmen zu maximieren, ist die entsprechende Analysen von Ca^{2 +} Signale erforderlich. Die Protokolle in diesem Papier erleichtern die Quantifizierung von Ca^{2 +} Signale an Ort und Stelle mit räumlich-zeitliche Zuordnung und partikelbasierten Analyse aufgezeichnet.

Zusammenfassung

Ca^{2 +} Bildgebung von isolierten Zellen oder bestimmte Arten von Zellen im intakten Gewebe oft offenbart komplexe Muster von Ca^{2 +} -Signalisierung. Diese Tätigkeit erfordert eine sorgfältige und eingehende Analysen und Quantifizierung, so viele Informationen über die zugrunde liegenden Ereignisse wie möglich zu erfassen. Räumliche, zeitliche und Intensität Parameter untrennbar mit Ca^{2 +} Signale wie Dauer, Ausbreitung, Geschwindigkeit, Frequenz und Amplitude können einige biologische Informationen zur intrazellulären Signalgebung erforderlich. Hochauflösende Ca^{2 +} imaging in der Regel Ergebnisse bei der Akquisition von großen Dateien, die in Bezug auf die Bildinformationen in quantifizierbare Daten zu übersetzen, und dieser Prozess zeitaufwendig sind werden anfällig für menschliche Fehler und Vorurteile. Analyse von Ca^{2 +} Signale von Zellen in-situ stützt sich in der Regel auf einfache Intensität Messungen aus willkürlich ausgewählten Regionen von Interesse (ROI) in ein Sichtfeld (FOV). Dieser Ansatz ignoriert viel wichtiger Signalisierung Informationen in das Blickfeld. Somit ist zur Wiederherstellung von Informationen aus solchen hochauflösende Aufnahmen mit Ca^{2 +}Farbstoffe oder optogenetische Ca^{2 +}erhalten Maximierung Bildgebung, angemessene räumliche und zeitliche Analyse der Ca^{2 +} Signale erforderlich. Die Protokolle, die in diesem Dokument beschriebenen werden beschrieben, wie ein hohes Volumen an Daten von Ca^{2 +} bildgebenden Aufnahmen ermöglichen umfassendere Analyse und Quantifizierung von Ca^{2 +} Signale aufgezeichnet von Zellen mit einer Kombination aus abgerufen werden kann räumlich-zeitliche Karte (STM)-Basis und Partikel-basierte Analyse. Die Protokolle beschreiben auch wie verschiedene Muster von Ca^{2 +} signalisieren beobachteten in andere Zelle, die Bevölkerung vor Ort angemessen analysiert werden können. Zur Veranschaulichung wird die Methode Ca^{2 +} Signalisierung in eine spezialisierte Population von Zellen im Dünndarm, interstitiellen Zellen von Cajal (ICC), mit GECIs prüfen.

Einleitung

Ca^{2 +} ist eine allgegenwärtige intrazellulären Messenger steuert eine Vielzahl von zellulären Prozessen, z. B. Muskel Kontraktion¹^,², Stoffwechsel³, Zelle Verbreitung³^,⁴^, ⁵, Stimulation der Freisetzung von Neurotransmittern im Nerv Klemmen⁶^,⁷und Aktivierung der Transkription Faktoren im Zellkern. ⁷ intrazellulären Ca^{2 +} Signale oft nehmen die Form von vorübergehenden Erhöhungen im cytosolisc....