Das Hormon der Nebennierenrinde sezerniert ist von entscheidender Bedeutung für die Tiere gegen Stress und Krankheiten. Hier präsentieren wir ein Protokoll zur Kultur der primären Ratte Nebenniere Zellen. Es könnte eine gute in-vitro-Plattform für die Untersuchung der Mechanismen des Reagens des Interesses an Nebennieren Steroidgenese und Lipid-Biosynthese.
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Methodenartikel
Primärkultur von Ratte Nebennierenrindeninsuffizienz Zellen und Assays Steroidogenic Funktionen
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Das Hormon, das die Nebennierenrinde sondert ist von entscheidender Bedeutung für die Tiere gegen Stress und Krankheiten. Die hier beschriebene Methode ist das Verfahren der primären kultivierte Ratte Nebennieren Zellen und damit verbundenen funktionellen Assays (Immunfluoreszenz Färbung des Lipid Droplet Oberfläche Protein sowie Corticosteron Analyse). Im Gegensatz zu einem in-vivo Modell die Variation der Interexperiments in den Nebennieren Monolayer-Kulturen ist weniger und die Versuchsbedingung ist einfach zu steuern. Außerdem ist die Quelle der Ratten auch stabiler als andere Tiere, wie Rinder sind. Es gibt auch mehrere menschliche Nebenniere Zelllinien (NCI-H295, NCI-H295R, SW13, etc.), die in den Nebennieren Studien verwendet werden können. Steroide Produktion dieser Linien wird jedoch noch von zahlreichen Faktoren ab, darunter Serum Lot-Nummer, Passagenanzahl, Mutant/Verlust von unterschiedlichen Genen, etc. beeinflusst werden. Mit Ausnahme 17α-Hydroxylase fehlt, ist die Primärkultur Ratte Nebennierenrindeninsuffizienz Zellen eine bessere und bequemere Technik zur Untersuchung der Nebennieren Physiologie. Zusammenfassend lässt sich sagen könnte primäre Ratte Nebennieren Kulturen eine gute in-vitro-Plattform für Forscher, die Mechanismen des Reagens des Interesses an der Nebenniere System zu untersuchen.
Einleitung
Das endokrine System ist verantwortlich für die Regulierung der physiologischen Aktivitäten und Homöostase1. Nebennieren befindet sich am kranialen Pol der Nieren sind eine der wichtigsten endokrinen Organe die Mineralocorticoids, Glukokortikoide und Androgen2,3absondern. Es gibt zwei Teile der Nebenniere: den Cortex und die Medulla. Die Nebennierenrinde besteht aus drei Schichten: die äußere Glomerulosa, fortgeschrittene Fasciculata und die innere Reticularis3. Zona Glomerulosa ist die ursprüngliche absondert Aldosteron, ein Mineralocorticoid, das hilft bei brachliegender Natrium-Ion und Wasser in den Nieren-3. Die Zona Fasciculata produziert in erster Linie eine basale Ebene von Glukokortikoiden im normalen physiologischen Bedingungen3. Corticosteroide bei Nagetieren und Cortisol in den Menschen handeln, um den Körper im Umgang mit Stress zu unterstützen, durch die Regulierung der Blut-Glukose-3. Zu einem gewissen Grad können sie hemmen Entzündungsreaktionen und regulieren das Immunsystem4,5. Im Gegensatz zu anderen Säugetieren, Mäuse und Ratten haben Sie keine funktionelle Zona Reticularis aufgrund des Fehlens eines 17α-Hydroxylase Ausdrucks in der Nebenniere6,7. Nebennieren von Mäusen und Ratten sind somit frei von der Sekretion der Nebennieren c-19 Steroide (Cortisol und adrenalen Androgene).
Primäre kultivierte Nebennierenrindeninsuffizienz Zellen haben gezeigt, für die Untersuchung von Mechanismen, die Steuerung der Nebennieren Physiologie8nützlich sein. Wie andere steroidogenic Gewebe synthetisiert jeder Nebennieren Zone seine Steroide aus freie Cholesterin9. Nach adrenokortikotropes (ACTH) Hormonstimulation das freie Cholesterin wird aus dem Zusammenbruch Lipid Tröpfchen entlassen und steigert somit, Steroid Produktion in den Fasciculata und Reticularis10.
Viele Gruppen haben versucht, stabilen Zelllinien von NNR-Karzinome herzustellen. Jedoch haben einige Bedenken die Verwendung von Nebennierenrindeninsuffizienz Zelllinien in Vitro Modelle8begrenzt. Die Steroiden Antworten der Zell-Linien können zwischen Passagen, die Lot-Nummer von Serum und die Qualität des Serum usw. abweichen. Darüber hinaus absondern kommerzielle Nebennieren Zelllinien (Y1 und SW13) nicht Corticosteron, erschwert die Nebennieren Steroidgenese8zu studieren. Verwendung von Rindern und Pferden Nebennieren als ex Vivo Modelle eine gute Wahl sein können obwohl Gewebe aus diesen Märkten einige unbekannten Risiken verdecken können. Im Vergleich zu ihnen, Geschäftsführer Ratte Nebennieren ist einfacher und die Quelle ist relativ stabiler und Pathogen-freies. Zusammen genommen, das vorliegende Verfahren hier beschriebenen ließe sich den damit verbundenen Mechanismus der Corticosteron Synthese in Ratte Nebennieren Fasciculata Zellen zu untersuchen.
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Protokoll
Alle Verfahren, die unter anderem tierische Themen wurden von institutionellen Animal Care und Nutzung Ausschuss der Kaohsiung Medical University genehmigt.
(1) experimentelle Verfahren
- Die Erwachsenen (8 bis 12 Wochen alten) weiblich/männlich SD Ratten durch CO2 Euthanasie zu opfern.
- 70 % Ethanol und lassen Sie es in die Haut aufgesogen werden, und wischen Sie dann die Haut mit einem Papiertuch.
- Setzen Sie die Ratte auf eine saubere Kunststoffplatte in die Rückenlage.
- Heben Sie die Haut mit "externen" gebogenen Pinzette an der Mittellinie und führen Sie eine stumpfe Dissektion durch die Schaffung einer "Y" Form (von der Höhe der Oberschenkel auf den subcostal Winkel).
- Spülen Sie Schere mit 70 % Ethanol, und dann schneiden Sie die Muskeln, auch die Schaffung einer "Y" Form.
-
Die linke Nebenniere hinter dem Magen zu finden.
Hinweis: der rechten Nebenniere finden Sie tief hinter der Leber.- Verwenden Sie ein paar Zangen, heben Sie die Magen oder Leber und die Nebennieren mit einem anderen gebogenen Pinzette zu isolieren.
- Entfernen Sie nachdem man die Nebennieren in eine sterile Schale vorsichtig die Nebenniere Kapsel mit feinen Pinzette.
- Mit einer feinen Schere, die Nebennieren klein geschnitten mit einem kleinen bisschen serumfreien Dulbecco modifizierten Adlers Medium (DMEM) / F-12 Medium.
-
Bereiten Sie drei verschiedene Pore Größe Pasteur Mehrkanalpipette vor und verwenden Sie die erste Pasteur pipettieren, um die Nebennieren Stücke in ein 50 mL konische Röhrchen mit Medium mit Kollagenase II (~0.5–0.8 mg/mL) abzusaugen.
- Sanft Stück das Gewebe genannte ca. 10 X. Verwenden Sie den Rest der Mehrkanalpipette und wiederholen Sie die obigen Schritte, bis alle Stücke kleiner geworden.
Hinweis: Die verschiedenen Porengrößen von Pasteur Mehrkanalpipette können erstellt werden, durch das Heizen sie mit dem Feuer. Die ersten Pipettieren ist die ursprüngliche Größe (ca. 1 mm), die Porengröße der zweite ist ca. 0,8 mm und die dritte Pasteur Pipettieren ist ca. 0,5 mm. Während der Verdauung werden die Stücke der Nebennieren kleiner geworden. So können über das mechanische Verfahren, die Nebennieren verdaut werden mehr abgeschlossen. Inkubieren Sie das Rohr in einem Wasserbad (bei 37 ° C) und schütteln Sie sie alle 5 min. 4 X insgesamt.
- Sanft Stück das Gewebe genannte ca. 10 X. Verwenden Sie den Rest der Mehrkanalpipette und wiederholen Sie die obigen Schritte, bis alle Stücke kleiner geworden.
- Fügen Sie nach 20 min Inkubation frische und kühle Medium (sechsfache Volumen; z. B. 5 mL Gewebe + 25 mL cool DMEM/F-12 Medium) mit 2,5 % fötalen Rinderserum (FBS) und 5 % Pferd Serum, die Enzym Wirkung zu stoppen.
- Sammeln Sie die Zelle Pellets durch Zentrifugation bei 800 X g für 10 Minuten.
- Fügen Sie einem entsprechenden Volumen des Mediums, die Zellen auszusetzen.
Hinweis: Jede Drüse machen ca. ~ 3 x 105 bis ~ 4 x 105 Zellen. - Platte die Zellen im gewünschten Platten oder Gerichte mit Wachstumsmedium (1:1 [V/V] Mischung aus DMEM und Hams f-12 Medium, ergänzt mit 25 mM HEPES und 1 % Penicillin und Streptomycin) Übernachtung (Tag 0) bei 37 ° C in eine feuchte Umgebung von 95 % Luft und 5 % CO2.
Hinweis: In der Regel Platte wir Zellen in 24-Well-Platten (vier Drüsen/Platte) für die Corticosteron-Assay und in 35 mm Gerichte (eine Drüse/ca. ein bis zwei Gerichte) für Western blot Analyse. - Waschen Sie sorgfältig die Zellen 2 X mit warmen serumfreien DMEM/F-12 Medium (Tag 1). Das neue Wachstumsmedium zu ersetzen.
- Die Zellen bei 37 ° C in eine feuchte Umgebung von 95 % Luft und 5 % CO2 bis 3. Tag beibehalten.
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Ergebnisse
Verwendung des beschriebenen Verfahrens hier, könnte unter dem Phasenkontrast-Mikroskop (Abbildung 1A) primäre kultivierte Nebenniere Zellen unterschieden werden. Zur weiteren Bestätigung, dass die Vesikel innerhalb Zytoplasma Lipid Tröpfchen sind, konnte die Immunfluoreszenz-Färbung des adipösen Differenzierung-related Protein (ADRP) am Tag 3 Kulturen (Abbildung 1 b) durchgeführt werden. Zellen wurden auf der Glasdeckgläser ange...
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Diskussion
Nebennieren spielen eine Schlüsselrolle in umweltgerechte Anpassung3. Das Hormon der Nebennierenrinde, sondert kann regulieren und Einstellen von physiologischen Funktionen und Homöostase3. Die in-vivo Modell spiegelt die realen physiologischen Wirkungen im Körper. Allerdings ist es noch von vielen komplexen Faktoren verursachen instabile Auswirkungen in Experimenten geprägt. Im Gegensatz dazu hat die in-vitro-Zellmodell Vorteile, wodurch es unvergleichlich zu Tiermodell. E...
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Offenlegungen
Die Autoren haben nichts preisgeben.
Danksagungen
Diese Arbeit wurde unterstützt durch einen Zuschuss aus dem National Science Council Taiwan (NSC102-2320-B-037-008-MY3) und eine National Cheng-Kung University Hospital Research Grant (NCKUH-10102045).
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| Weibliche/männliche, SD/Wistar-Ratten (8-12 Wochen) | weibliche BioLASCO-Ratten | eignen sich für Experimente. Die Nebennieren der Weibchen sind größer als die der männlichen Ratten, jedoch besitzen die weiblichen Ratten die Östruszyklen, die die Experimente beeinflussen können | |
| Kollagenase, Typ II | Sigma | C-6885 | Isolierung von Nebennierenzellen |
| DMEM | ThermoFisher | 12800-017 | Pulvermedium für Nebennierenzellen |
| Ham's F12 | ThermoFisher | 21700-075 | Pulvermedium für Nebennierenzellen |
| HEPES | JT.baker | 4018 | Puffer (Pulver) |
| NaHCO3 | JT.baker | 3506-1 | |
| Pferdeserum | Hyklon | 16050014 | |
| fötales Rinderserum | SAFC | 12103C | |
| Penicillin (10.000 U)-Streptomycin (10.000 μg/ml) | Corning | 30-002-Cl | Antibiotika |
| Gebogene Pinzette | BRAUN | BD343R | |
| Pinzette | BRAUN | BD331R | |
| Schere | BRAUN | BC224R | Schnitt Rattenhaut und -muskulatur |
| Zarte Schere | BRAUN | BC101R | Schnitt Nebennieren |
| Fettdifferenzierungsbezogenes Protein | Abcam | ab108323 | Antikörper für Lipidtröpfchen-assoziiertes Protein |
| Corticosteron ELISA Kit | Cayman | 500655 | Assay für die Corticosteronsynthese |
| Inverslichtmikroskopie | Leica | ||
| Fluoreszenzmikroskop | Nikon | ||
| Triton X-100 | JT.baker | X198-07 | für die Immunfluoreszenzfärbung |
| Ziege Anti-Kaninchen-IgG Alexa 488 Fluor-Sekundärantikörper | ThermoFisher | A-11034 | für die Immunfluoreszenzfärbung |
| Anti-ADFP | Abcam | 108323 | für die Immunfluoreszenzfärbung |
| ProLong Gold Antifading-Eindeckmittel | ThermoFisher | P36935 | für die Immunfluoreszenzfärbung |
Referenzen
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