Mit In-vitro- und In der Zelle Form zu untersuchen, kleines Molekül induzierte Pre-mRNA Strukturveränderungen

Selektive 2'-Hydroxyl Acylation analysiert durch Primer Extension (Form) ist eine Methode zur Messung der Kinetics von jedem Nukleotid in einer RNA-Sequenz des Interesses und Aufklärung der Sekundärstruktur bei Einzel-Nukleotid-Auflösung¹. Form-Methoden, sowohl im in-vitro-Bedingungen^2,3,4 (gereinigte RNA in einem definierten Puffersystem) und im lebenden Säugetier-Zellen^5,6, wurden entwickelt, um die sekundäre untersuchen Struktur von mittlerer Länge RNA-Sequenzen (in der Regel < 1.000 Nukleotide in der Zelle Form und < 200 Nukleotide für in-vitro-Form). Es ist besonders nützlich, um Strukturveränderungen im Rezeptor RNA nach Bindung an RNA-Interaktion niedermolekularer Metaboliten^2,4,7,8 bewertet und mechanistische Aktionen studieren RNA-targeting Moleküle während Drug Development^9,10.

RNA-targeting Arzneimittelforschung hat vor kurzem Aufmerksamkeit in wissenschaftlichen Labors und der pharmazeutischen Industrie^11,12 über unterschiedliche Ansätze und Strategien^{13,14,15 gezogen ,16}. Jüngste Beispiele für RNA-targeting kleine Moleküle für den klinischen Gebrauch zwei strukturell verschiedene experimentelle Medikamente, LMI-070¹⁷ und RG-7916^18,19, für spinale Muskelatrophie (SMA), der viel versprechende zeigte Ergebnisse in Phase II Studien²⁰. Beide Moleküle wurden gezeigt, die Ziel-Überleben der Motoneuron (SMN) 2 Pre-mRNA und regulieren das Spleißen Verfahren des SMN2 gen^6,17,21. Die Anwendung von in-vitro- und in der Zelle Form in einer Untersuchung der Ziel-RNA strukturellen Veränderungen in der Gegenwart ein Analogon der RG-7916 bekannt als SMN-C2⁶zuvor gezeigt.

Im Prinzip misst Form die 2'-OH Acylation bei jedem Nukleotid eine RNA-Sequenz im Beisein von überschüssigen Mengen an ein selbst abschrecken Acylation Reagenz unvoreingenommen. Das Acylation Reagenz ist nicht stabil im Wasser, mit einer kurzen Halbwertszeit von (z. B. T_1/2 = 17 s 1-Methyl-7-Nitroisatoic-Anhydrid; oder 1 M 7, ~ 20 min für 2-Methylnicotinic Säure Lithiumimidazolid, NAI)²² und Unempfindlichkeit gegen die Identität des die Basen-²³. Dies führt zu einer günstigeren Acylation von 2'-OH-Gruppen der flexiblen Basen, die eine genaue Einschätzung der Dynamik der einzelnen Nukleotid umgewandelt werden können. Insbesondere ist ein Nukleotid in einem Base-paar in der Regel weniger reaktiv als eine ungepaarte man ein 2'-OH modifizierenden Reagenz, wie NAI und 1 M 7.

Mit Blick auf die Quelle der RNA-Vorlage und dem 2'-OH Acylation stattfindet, kann Form in der Regel in Form von in-vitro- und in-Cell kategorisiert werden. In Vitro Form verwendet gereinigtes T7 RNA transkribiert und es fehlt einen zellulären Kontext in experimentellen Designs. In ZELLFORM auftreten die RNA-Vorlage-Transkription und 2'-OH Acylation innerhalb lebender Zellen; Daher können die Ergebnisse der RNA Strukturmodell in einem zellulären Kontext rekapitulieren. In ZELLFORM wird für die Form, die in lebenden Zellen in der Literatur²⁴durchgeführt wie in Vivo Form bezeichnet. Da dieses Experiment nicht in ein Tier durchgeführt wird, können wir dieses Experiment als ZELLFORM für Genauigkeit bezeichnet.

Auch unterscheiden sich die Strategien für die Grundierung Ausbaustufe von in-vitro- und in der Zelle Form. In in-vitro-Form hält reversen Transkription an die 2'-OH Acylation Position im Beisein von Mg^{2 +}. Eine ³²P-beschriftet-Grundierung-Erweiterung erscheint daher als eine Band in der Polyacrylamid-Gelelektrophorese (PAGE) und die Intensität der Band ist proportional zu der Acylation Satz¹. In ZELLFORM, reversen Transkription generiert zufällige Mutationen bei der 2'-OH Addukt Position im Beisein von Mn^{2 +}. Die Mutationszucht bei jedem Nukleotid durch in Tiefe Next Generation Sequencing erfasst werden kann, und die Form Reaktivität bei Einzel-Nukleotid-Auflösung kann dann berechnet werden.

Ein mögliches Problem für ZELLFORM ist die geringe Signal-Rausch-Verhältnis (d. h. ein Großteil der 2'-OH-Gruppen ist unverändert, während die unveränderten Sequenzen die meisten der Read in Next Generation Sequencing besetzen). Vor kurzem, eine Methode, um die 2'-OH anreichern RNA geändert, klicken Sie wie in Vivo Form (IcSHAPE) bezeichnet, entwickelte sich Chang Labor²⁵. Diese Anreicherung-Methode kann bei der Untersuchung schwach kleine Moleküle wie RNA Interaktionen, vor allem in einem Verhör Transkriptom-weite vorteilhaft sein.

(1) in-vitro-Form

Hinweis: Das Protokoll ist von dem veröffentlichten Protokoll Nr.¹geändert.

1. Vorbereitung der RNA-Vorlage
   Hinweis: Die Vorlage für T7 Transkription wurde bestellt, wie ein synthetisches doppelsträngige DNA (DsDNA) und verstärkt durch entweder Einschieben in einem E. Coli -Vektor, der trägt ein einzigartiges Paar EcoRI/BamHI Einschränkung Endonuklease Websites, wie pET28a oder durch PCR. Das Protokoll für PCR-Amplifikation ist nachfolgend dargestellt.
   1. Mischen Sie das folgende Material: 50 μL der PCR Master mix (siehe Tabelle der Materialien), 2 μL für jede Grundierung in 10 μM (siehe Tabelle 1 für Sequenzen), 200 ng DsDNA-Vorlage 2 μL 3 μL der Dimethyl Sulfoxid (DMSO) und 41 μL H₂O. Aliquot in zwei PCR Rohre (jedes Röhrchen enthält 50 μL Reaktionsgemisch).
   2. Richten Sie den Thermocycler folgendermaßen: Stufe 1) 95 ° C für 30 s; Stufe 2) 95 ° C für 20 s; Stufe 3) 56 ° C für 20 s; Stufe 4) 72 ° C für 20 s; Etappe 5) Schleife zurück zum Schritt 2 für 30 Zyklen; 6. Etappe) 72 ° C für 3 min; und Stufe 7) unendlich bei 4 ° C bis zum folgenden Schritt halten.
   3. Der PCR-Amplifikate durch Extraktion von Gel Scheiben zu reinigen (siehe Tabelle der Materialien und verwenden die Hersteller-Protokoll). Eluieren Produkt DNA mit 35 μl Tris-EDTA (TE) Puffer, mit 10 mM Tris (pH 8,0) und 1 mM EDTA, liefern eine 0,1-0,5 µg/μl Vorlage. Normalisieren Sie die gereinigte DNA Schablone in 0,10 µg/μl.
      Hinweis: Optional kann die Qualität der Vorlage auf einem 1,8 % Agarose-Gelelektrophorese mit 0,10 µg DNA analysiert werden. Ein einzelnes Band der gewünschten Vorlage DNA wird auf dem Gel erwartet.
   4. Richten Sie die T7 Transkription Reaktion (Gesamtvolumen 40 μl) durch das Hinzufügen der folgenden Materialien in ein PCR-Röhrchen: 4 μl 10 x Reaktion Puffer, 4 μL von ATP, 4 μL der CTP-Version 4 μL der GTP, 4 μL der UTP, 4 μL T7 Enzyms (siehe Tabelle der Materialien) , 4 μL der gereinigten PCR Amplifikate aus Schritt 1.1.3 (0,4 μg) und 12 μL Diethyl-Pyrocarbonate (DEPC)-behandeltem Wasser. Mischen Sie, indem Sie nach oben und unten 4 X pipettieren. Bei 37 ° C für 4 – 16 h in einem Thermocycler oder in einem Inkubator 37 ° C inkubieren.
      Hinweis: Beginnen Sie mit Schritt 1.1.6 eingerichtet, während die Reaktion im Schritt 1.1.4 ist im Gange.
   5. 2 μL der DNase hinzufügen, mischen, indem Sie nach oben und unten 4 X pipettieren und Inkubation bei 37 ° C für 15 min. Mix in gleicher Lautstärke 2 x Tris-Borat-EDTA (FSME)-Harnstoff Probenpuffer (siehe Tabelle der Materialien). Erhitzen Sie auf 70 ° C für 3 min, zu inaktivieren.
   6. Mischen Sie in einer RNase-freie Flasche 75 mL 40 % Acrylamid/Bisacrylamide Lösung (29,1, siehe Tabelle der Materialien), 180,2 g Harnstoff, und 50 mL 10 X TBE-Puffer (RNase-frei, siehe Tabelle of Materials). Setzen Sie die Flasche auf einem Orbitalschüttler (250 u/min), bis sich alle Kristalle von Harnstoff aufgelöst haben (kann bis zu 2 Stunden dauern). Stellen Sie die Lautstärke bis 500 mL mit DEPC-behandeltem Wasser. Filtern Sie die Lösung mit einer 0,2 μm-Membran (siehe Tabelle der Materialien).
      Hinweis: In diesem Prozess zu vermeiden mit spiegelnden und rühren-Bar um RNase-Kontamination zu verhindern. Die Lösung kann bis zu 1 Jahr bei 4 ° C aufbewahrt werden.
   7. Reinigen Sie zwei Elektrophorese Glasplatten eine richtige Größe (16,5 x 24 cm) mit entionisiertem Wasser und 70 % EtOH mit einem Stück Papier abwischen. Richten Sie die Platten mit einem Paar von 2,0 mm Spacer (die Platte mit einer silikonisierte Oberfläche steht nach innen) und verschließen Sie der Rand der Platten mit Klebeband. Doppel-Klebeband am Rand der Platte um auslaufen zu verhindern.
   8. Mischen Sie in einem Becherglas 200 mL Acrylamid-Lösung von Schritt 1.1.6, 2,0 mL der 10 % Ammonium Bleichen Lösung und 100 μL der Tetramethylethylenediamine (TEMED) mit einer Pipettenspitze RNase-freie durch Rühren rasch für 30 S. Tilt die Platten auf einem Stück Benchtop-Abdeckung und die Lösung von den Abstand der Platten. Tippen Sie auf die Platte zu heben alle Bläschen und legen Sie die Platte flach auf die Benchtop-Abdeckung. Sofort setzen Sie den Kamm und lassen Sie das Gel mindestens 1 h polymerisieren.
      Hinweis: Wenn das Gel innerhalb des nächsten Tages verwendet werden soll, vertuschen Sie die Spitze des Gels mit einem feuchten Papiertuch und Wrap mit einem größeren Stück Plastikfolie. Legen Sie es flach bei 4 ° c liegen
   9. Entfernen Sie das Klebeband und Klemmen Sie die Platte in eine Elektrophorese-Stand. Entfernen Sie den Kamm zu und fügen Sie angemessene 1 X TBE-Puffer an der Ober- und Unterseite des Stausees. Bereits laufen Sie das Gel für 30 min bei 20 w.
      Hinweis: Optional kann der Inhalt der gewünschten RNA ca. 90 % oder mehr beträgt, eine Mini-Gel als Ersatz eine präparative Gel verwendet werden.
   10. Waschen Sie aller be-Brunnen von oben und unten zweimal mit der Flüssigkeit in das Reservoir pipettieren. Fügen Sie grobe RNA aus Schritt 1.1.5 in die Vertiefungen. Führen Sie das Gel bei 20 W bis Xylol Cyanol FF Farbstoff (hellblau) etwa zwei Drittel des Gels Länge (~ 60 min) geht.
       Hinweis: Sorgen um nicht mehr als ein Drittel der Höhe des Brunnens zu laden (verwenden Sie ggf. mehrere Brunnen).
   11. Tauchen Sie das Gel in 1 X TBE-Puffer mit 1: 10.000 Verdünnung des Safes in einem Behälter groß genug für das Gel färben (siehe Tabelle der Materialien). Stellen Sie die Behälter auf einem Orbitalschüttler für 5 min bei 80 u/min.
   12. Unter UV-Licht das gewünschte RNA-Band zu identifizieren und rasch ein dünnes Band des Gels mit einer sauberen Rasierklinge geschnitten. Legen Sie 1 – 2 Gel Scheiben in eine 1,7 mL-Tube.
   13. Wiederherstellen Sie die RNA von der Gel-Scheibe durch passive Elution. Jedes Rohr ausreichend Elution/Niederschlag Mischung (~0.3 mL pro Scheibe) hinzufügen: 0,3 M NaOAc (pH 5,2), 2,5 M LiCI, 1 mM EDTA 0,1 % Natrium Dodecyl Sulfat (SDS) in DEPC-behandeltem Wasser. Drehen Sie die Röhre, die das Gel Spleißstelle(n) bei 4 ° C für 16 h enthält.
       Hinweis: Eine typische Wiederfindungsrate beträgt ~ 75 % in diesem Schritt. Um den Ertrag zu steigern, zu entfernen Sie und sammeln Sie der Eluent und fügen Sie die gleiche Menge an Elution Puffer, dann wiederholen Sie diesen Schritt.
   14. Der Eluent in einem neuen 1,7 mL Röhrchen zu kombinieren. Fügen Sie 2.5 x eiskalten EtOH hinzu, invertieren Sie die Rohre sechsmal um die Flüssigkeit zu mischen und legen Sie die Rohre bei-80 ° C für mindestens 1 h.
   15. Zentrifuge für 10 min bei 10.000 x g und 4 ° C. Entfernen Sie vorsichtig den Überstand durch pipettieren. Waschen der RNA-Pellet durch Zugabe von 80 % EtOH (1 mL pro Röhrchen), Wirbel für 15 s und Zentrifuge für 10 min bei 10.000 x g und 4 ° C.
   16. Entfernen Sie den Überstand zu und trocknen Sie das RNA-Pellet für 5 min. hinzufügen 50 μL der RNase-freies Wasser und mischen durch Pipettieren nach oben und unten 10 Mal. Die RNA-Konzentration, um 0,10 µg/μl zu normalisieren. Speichern Sie die gereinigte RNA bei-80 ° C.
       Hinweis: Trocken Sie die RNA-Pellet nicht übermäßig.
   17. Optional, um die Qualität der RNA zu analysieren, verdünnen 1 μl (100 ng) RNA aus Schritt 1.1.16 in 5 μL des Wasser zugeben und mit 5 μl 2 X TBE-Harnstoff Probenpuffer. Dann Hitze bei 70 ° C für 3 min und Last auf einem 6 % FSME-Harnstoff Mini-Gel.
       1. Führen Sie dem Gel bei 180 V für 1 h Perform die Färbung wie in Schritt 1.1.11 getan. Visualisieren Sie das Gel mit UV-auf ein bildgebendes System. Ein einzelnes Band dürfte in der gewünschten Länge.
2. Vorbereitung der ³²P-Label Grundierung
   1. Richten Sie die Reaktion durch Mischen der folgenden Materialien: 10 μL der γ -³²P-ATP (~1.5 mCi, ~ 25 μM, siehe Tabelle der Materialien), 2 μL der reversen Transkription (RT) Grundierung (100 μM, Reihenfolge siehe Tabelle 1), 2 μL der 10 x T4 Polynukleotid Kinase (PNK) Reaktion-Puffer, 1 μl T4 PNK (siehe Tabelle der Materialien), und 5 μl RNase-freies Wasser. Inkubation bei 37 ° C für 1 h.
      Vorsicht: Angemessenen Schutz braucht Schritte 1.2-1.5 eine autorisierte Arbeitsplatz für radioaktive Stoffe.
   2. Für 20 min bei 65 ° c Hitze inaktivieren Fügen Sie die Proben auf einer Entsalzung Spalte und Zentrifuge bei 1.000 x g für 1 min. Mischen der Eluent mit 25 μl Probenpuffer 2 X TBE-Harnstoff. .
      Hinweis: Speichern Sie das beschriftete Rohprodukt bei-20 ° C, wenn es nicht sofort gereinigt werden.
   3. Laufen Sie eine 10 % Acrylamid Gel bei 20 W 1 h.
      Vorsicht: Laden Sie ³²P-Label Grundierung von 1.2.1 betreten das Gel und Vermeidung von Blutungen die Radioaktivität in den oberen Behälter. Legen Sie nicht mehr als ein Drittel der Höhe des Brunnens um ein dünnes Band auf dem Gel zu gewährleisten (verwenden Sie ggf. mehrere Brunnen). Die Flüssigkeit in den unteren Behälter kann hoch radioaktiv sein.
   4. Die Glasplatten der Gel-Kassette zu entfernen und das Gel auf ein Stück Frischhaltefolie legen. Falten Sie die Plastikfolie um das Gel zu einem luftdichten Sandwich bedecken. Das Gel-Sandwich ein Kalzium Wolframat Phosphor Bildschirm und ein bildgebendes Instrument aussetzen. Bild das Gel wieder mit normalem Licht zu wissen, wo die Ränder des Gels.
   5. Verwenden Sie ein Bildbearbeitungsprogramm, um die beiden Bilder zu überlagern. Richten Sie das Gel auf dem gedruckten Bild. Verwenden Sie einer frischen Rasierklinge, um die gewünschten Bands aus dem Gel geschnitten. Legen Sie 1 bis 2 Gel Scheiben in eine 1,7 mL-Tube.
      Hinweis: Stellen Sie sicher, dass das gedruckte Bild hat die gleiche Größe wie das eigentliche Gel. Überprüfen Sie die Ausrichtung von imaging das übrig gebliebene Gel wieder nach dem Ausschneiden des Gel-Slices.
   6. Wiederherstellen Sie die ³²P-Label Grundierung durch folgende Schritte 1.1.13, 1.1.16. Eine 0,4 mL-Tube berücksichtigen Sie 1,0 μl Lösung und verdünnen Sie die Grundierung mit 1 X TE-Puffer, die Radioaktivität von 1,0 μL auf ~ 100.000 cpm zu erhalten. Speichern Sie die gereinigten ³²P-Label Grundierung bei-80 ° C bis RNA 2'-OH Modifikation Reaktion aber nicht länger als 4 Wochen.
3. Kleines Molekül binden und RNA-2'-OH-Änderung
   1. Um vier Proben vorzubereiten, Hinzufügen einer 1,7 mL-Tube, Hitze bei 80 ° C für 2 min und Snap-Cool für mindestens 1 min auf Eis 8 Pmol RNA in 32 μL von 0,5 X TE-Puffer.
      Hinweis: Die folgende Gleichung verwenden, um die ungefähre Molekulargewicht von RNA zu berechnen: MW = (Anzahl der Basen) x 340 Da.
   2. Fügen Sie 8 μl 5 x Faltung Mischung mit 500 mM HEPES (pH 8,0), 20 mM MgCl₂und 500 mM NaCl. Aliquoten 9 μl RNA-Mischung in jeder der vier PCR-Röhren und beschriften Sie sie #1-#4. Fügen Sie 1 μl 10 % DMSO in der #1 Röhre 1 μL konzentrierte kleines Molekül-Lösung (10 % DMSO) in #2, 1 μL verdünnt kleines Molekül-Lösung (10 % DMSO) in #3 und 1 μl Wasser in #4.
   3. Inkubieren Sie die PCR-Röhrchen bei 37 ° C in einem Thermocycler für 30 min.
   4. Direkt vor der 2'-OH-Änderung-Reaktion verdünnen Sie 1 μl der Stammlösung NAI (2 M) mit 3 μl DEPC-behandeltem Wasser um eine 0,5 M funktionierende Lösung zu erzielen. Ohne Verzögerung fügen Sie 1 μL des NAI arbeiten Lösung in Röhren #1, #2 und #3 und 1 μl 25 % DMSO in #4 hinzu. Inkubation bei 37 ° C in einem Thermocycler für 15 Minuten.
   5. Fügen Sie 100 μL der Elution/Niederschlag mischen (siehe Schritt 1.1.13 für Rezept), 2 μL von Glykogen (15 mg/mL), und übertragen Sie die Flüssigkeit in jedem PCR-Röhrchen in eine 1,7 mL-Tube. 0,34 mL eiskaltes 200-Nachweis EtOH hinzugeben (3 X Volumen) in jedes Rohr. Mix von vortexen für 5 s und Ort der Rohre in einem-80 ° C Gefrierschrank für mindestens 1 h.
      Hinweis: Beginnen Sie in diesem Zeitraum Einrichten der Sequenzierung Gel in Schritt 1.5.1 verwendet werden.
   6. Zentrifuge für 15 min bei 14.000 x g und 4 ° C. Den Überstand ohne zu stören das RNA-Pellet zu entfernen. Waschen der RNA-Pellet durch Zugabe von 80 % EtOH (0,5 mL pro Röhrchen), Wirbel für 15 s und Zentrifuge für 15 min bei 20.000 x g und 4 ° C. Entfernen Sie den Überstand wieder.
      Hinweis: Optional, verwenden Sie einen Geigerzähler um das radioaktive Pellet Beibehaltung in der Röhre zu gewährleisten.
   7. Trocknen Sie die RNA-Pellet für 5 min. hinzufügen 9 μl RNase-freies Wasser an der Luft und mischen Sie, indem Sie nach oben und unten 10 Mal pipettieren.
      Hinweis: Trocken Sie die RNA-Pellet nicht übermäßig. Alle Niederschlag wird voraussichtlich am Ende dieses Schrittes aufgelöst werden.
4. Marker-Vorbereitung und Primer-Erweiterung
   1. Übertragen Sie die modifizierte RNA in 4 neue PCR-Rohre und beschriften Sie sie #1-#4 als zuvor. 4 zusätzliche PCR-Rohre fügen Sie 2 Pmol Steuerelement RNA in 7 μl DEPC-behandeltem Wasser hinzu und beschriften Sie #5 bis #8. Fügen Sie 2 μL radioaktiven Grundierung (Schritt 1.2.6) in alle acht Rohre. Erhitzen Sie zum Tempern bei 65 ° C für 5 min, dann sofort auf 4 ° C in den Thermocycler kühlen.
   2. Fügen Sie 4 μl 5 x RT Puffer (siehe Tabelle der Materialien), 1 μL Dithiothreitol (DTT, 0,1 M) und 1 μl dNTP-Mix (10 mM) für jedes der acht PCR-Rohre.
   3. #1-#4 Röhren 2 μl DEPC-behandeltem H₂O hinzufügen. Fügen Sie 4 μL der DdATP (5 mM), 4 μL der DdTTP (5 mM) und 4 μL der DdCTP (5 mM) in Röhren #5 – #7, beziehungsweise. Rohr #8 1 μL der DdGTP (5 mM) und 3 μl DEPC-behandeltem Wasser hinzufügen. Pipette viermal um zu mischen.
   4. Bei 52 ° C für 1 min in den Thermocycler erhitzen. Fügen Sie 1 μl Reverse Transkriptase (siehe Tabelle der Materialien), dann mischen, indem Sie nach oben und unten viermal pipettieren. Inkubieren Sie die Reaktion bei 52 ° C für 20 min.
   5. Fügen Sie 1 μl 5 M NaOH in jedes der Rohre, die RNA Hydrolyseneigung. Erhitzen Sie die Röhrchen bei 95 ° C für 5 min.
   6. 5 μL 1 M HCl hinzufügen und wiederholen Sie die Ethanol-Niederschlag (Schritte 1.3.5 und 1.3.6), außer die Glykogen und flüssige Übertragung weglassen.
      Hinweis: 1.4.6 Ergebnissen in einer Unschärfe Region in der Mitte des Gels, bekannt als der "Salz Front" weglassen.
   7. An der Luft trocknen des DNA-Pellets für 5 min. Fügen Sie 10 μL von H₂O und 10 μL von 2 X TBE-Harnstoff probieren Sie laden Puffer und Pipette nach oben und unten 10 Mal zu redissolve. Wärme bei 70 ° C für 5 min. legen die Rohre auf dem Eis vor der Verladung auf das Gel.
5. Seitenanalyse
   1. Um eine 8 % Polyacrylamid-Gel Sequenzierung vorzubereiten, führen Sie die Schritte 1.1.6, 1.1.10 mit folgenden Änderungen: 100 mL 40 % Acrylamid/Bisacrylamide Lösung (29,1) verwenden, um eine 8 % Acrylamid-Lösung vorzubereiten, und verwenden Sie Sequenzierung Gel Glasplatten (z.B.46 x 57 cm) mit einem 0,4 mm Abstandshalter.
   2. Laden Sie 10 μl der Probe aus Schritt 1.4.7. Führen Sie das Gel mit 65 W für 2 h oder bis der unteren Farbstoff 3/4 des Gels erreicht hat.
      Hinweis: Speichern Sie den Rest der Proben bei-80 ° C für die Wiederholung bei Bedarf.
   3. Entfernen Sie die obere silikonisierte Glasplatte durch Entfernen des Abstandhalters und einen Spatel vorsichtig einfügen. Legen Sie ein Stück der großen Filterpapier um das Gel zu decken, und drücken Sie vorsichtig, um das Gel zur Einhaltung des Filterpapiers zu ermöglichen. Am unteren Ende ab, heben Sie das Filterpapier und entfernen Sie das Gel von der Glasplatte zusammen.
   4. Legen Sie das Gel zusammen mit dem Filterpapier auf ein Stück Plastikfolie, die groß genug ist um das ganze Gel (Filterpapier nach oben) zu decken. Übertragen Sie das Filterpapier/Gel/Plastic Wrap-Sandwich mit Filterpapier-Seite nach unten auf ein Gel trockener.
      Vorsicht: Um Material Kontaminationen zu vermeiden, verwenden Sie 3 bis 4 weitere Stücke von großen Filterpapier zwischen dem Gel-Sandwich und gel trockener.
   5. Trocknen Sie das Gel bei 70 ° C für 1 h mit einem Vakuum. Übertragen Sie das Gel-Sandwich auf einer Foto-gebleicht Phosphor Lagerung Bildschirm Kassette. Setzen Sie die Radioaktivität des Gels auf dem Bildschirm für 4 – 16 h.
   6. Legen Sie die Phosphor-Lagerung-Bildschirm auf ein bildgebendes Gerät und Scan mit mittlerer Auflösung (~ 30 min).
      Hinweis: Wenn eine Lächeln-wie Artefakt auf Gelbild vorhanden ist, verwenden Sie Korrektur Software (z.B.SAFA), um das Bild, um eine veröffentlichbare Qualität zu verarbeiten. Denken Sie daran, dass die standard-Marker-Spur 1 Nukleotid länger als die 2'-OH-Änderung-Bahnen ist.

(2) in der Zelle Form

1. Besser gekleideteres design
   Hinweis: Im Gegensatz zu in-vitro-Form muss in Zelle Form keine Expressionskassette entwerfen. Jedoch Fahrgast-/optimale Grundierung sollte verwendet werden und müssen ausgewertet werden, bevor die Form experimentieren.
   1. Erzeugen Sie mindestens drei einzigartige Grundierung Paare durch eine Explosion-based Zündkapsel-Design-Tool (z.B., Primer-BLAST). Um Pre-mRNA in menschlichen Zellen zu studieren, wählen Sie das menschliche Genom (nicht Transkriptom aus) als eine Referenzdatenbank Primer Paar Spezifität überprüft Parameter. Wählen Sie die Größe der Amplifikate im Bereich von 200 – 1.000 Basenpaare (bp).
   2. Extrahieren Sie die genomische DNA aus ~ 10⁶ Zellen mit einem Spin Spalte basierende Methode bei der Behandlung von RNase A und Protease K (siehe Tabelle der Materialien und verwenden die Hersteller-Protokoll). Normalisieren Sie die gereinigten genomischen DNA in 0,1 μg/μl TE-Puffer.
   3. PCR-Test mit dem Protokoll durchgeführt in den Schritten 1.1.1 und 1.1.2.
      Hinweis: Das gewünschte Grundierung Set sollte ein einzelnes Band auf einem 1,8 % Agarosegel ergeben.
2. Handy-Vorbereitung und 2'-OH-Modifikation
   Hinweis: Um die Fülle der Pre-mRNA von Interesse zu erhöhen, ist eine Minigene mit der richtigen Reihenfolge unter Cytomegalovirus (CMV) Projektträger für die konstitutive Expression in die Wirtszellen transfiziert.
   1. Vorwärmen des Kulturmediums mit 10 % fetalen bovine Serum (FBS) und 1 X Antibiotika Mischung in Dulbeccos geändert Eagle Medium (DMEM) bei 37 ° C. 293T Samenzellen bei 50 % Konfluenz 24 h vor der Transfektion in Kulturmedium. Wechseln Sie das Medium in 2 % FBS in DMEM ohne Antibiotika ~ 1 h vor der Transfektion.
   2. Fügen Sie 10 μg Minigene Plasmid in 100 μl reduzierte Serum-Medien (siehe Tabelle der Materialien) in 1 auch von einer 96-Well-Platte. Pipette die Lösung nach oben und unten vier Mal zu mischen.
   3. 40 μl Transfection Reagens hinzufügen (siehe Tabelle der Materialien) in 100 μl reduzierte Serum-Medien in eine weitere Vertiefung der Platte. Pipette oben und unten viermal um zu mischen. In 5 min bei Raumtemperatur inkubieren.
   4. Die Transfektion Reagenz Aussetzung die gesamte Plasmid-Lösung hinzufügen. Pipette oben und unten viermal um zu mischen. Bei Raumtemperatur für 30 min inkubieren.
   5. Fügen Sie die gesamte DNA / Transfection Reagens Mischung tropfenweise auf der Oberfläche des Mediums in die Schüssel. Inkubation bei 37 ° C für 6 – 12 h.
   6. Aspirieren Sie das Medium und waschen Sie vorsichtig einmal mit 5 mL der Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS, pH 7,4, ohne CaCl₂ und MgCl₂, siehe Tabelle of Materials). Trypsinize der Zellen mit 3 mL Trypsin-Lösung. In 5 min bei Raumtemperatur inkubieren.
   7. Klopfen Sie die Schale vorsichtig, um die Zellen von der Unterseite der Schale zu trennen. Trypsin mit 6 mL Kulturmedium zu neutralisieren. 300 X g für 4 min Zentrifugieren Sie und entfernen Sie das Medium.
   8. ~ 10⁶ Zellen für jede Probe in 199 μL des Reaktionsmediums Aufschwemmen (1 % FBS in DMEM) und die Zellsuspension in eine 96-Well-Platte übertragen. Inkubieren Sie die Zellen mit 1 μl des zusammengesetzten funktionierende Lösung oder 1 μL von DMSO in alle drei Steuerelemente für 30 min bei 37 ° c
      Hinweis: Drei Kontrollproben sollten enthalten sein: DMSO-Steuerung mit NAI, denaturierte RNA mit NAI und NAI negative Kontrolle.
   9. Jede Probe, mit Ausnahme der denaturierenden Control (DC) RNA und NAI Negativkontrollen 10 μL von 2 M NAI hinzufügen. Pipette oben und unten viermal um zu mischen. Inkubation bei 37 ° C für 15 min. schütteln die Platten, die Zellen alle 5 min wieder auszusetzen.
   10. Übertragen Sie die Zellen in 1,7 mL Tuben und Zentrifuge bei 400 X g für 2 min ohne Verzögerung. Entfernen des Überstands ohne zu stören die Zelle Pellet.
   11. 0,4 mL Guanidinium-Thiocyanat zugeben (siehe Tabelle der Materialien). Wirbel für 15 s zu homogenisieren. Inkubieren Sie die Proben bei Raumtemperatur für 5 min.
       Hinweis: Die Proben können bei-20 ° C gelagert werden, bis Sie mit dem nächsten Schritt fortfahren.
3. RNA-Extraktion
   1. 0,2 mL Chloroform zu jeder der Guanidinium-Thiocyanat homogenisiert Proben hinzufügen. Vortex für 15 S. Inkubation bei Raumtemperatur 2 min. lang.
   2. Zentrifuge für 5 min bei 12.000 x g und 4 ° C. Die obere farblose wässrige Schicht enthält RNS. Übertragen Sie ~ 380 μL wässrige Lösung in eine neue 1,7 mL Tube.
      Vorsicht: Stören Sie nicht die Interphase um Kontaminationen zu vermeiden.
   3. 1,5 X Volumen von EtOH (~ 570 μL). Wirbel für 15 s zu mischen.
   4. 600 μl RNA-Mischung in eine RNA Isolierung Spin-Spalte zu übertragen (siehe Tabelle der Materialien). Zentrifugieren Sie bei 12.000 X g 15 S. verwerfen der Eluent. Wiederholen Sie diesen Schritt durch alle Flüssigkeit in der gleichen Spalte Spin zustande.
   5. Waschen Sie die Spalte mit 0,35 mL RW1 Puffer (siehe Tabelle der Materialien) durch spinning für 15 S. hinzufügen 80 μL der RNase-freie DNase ich in RDD Puffer (siehe Tabelle der Materialien). Bei Raumtemperatur für 20 min inkubieren.
      Hinweis: Es ist wichtig, alle DNA-Verunreinigungen zu entfernen.
   6. Anschließend waschen Sie die Spalte mit 0,35 mL RW1 Puffer und 0,6 mL 2 X RPE-Puffer (siehe Tabelle der Materialien) durch Spinnen für 15 s bei jedem Schritt. Trocknen Sie die Spalte durch die Spin-Spalte mit einer leeren Sammelrohr bei 12.000 X g für 1 min zentrifugieren.
   7. Die Mitte der Stütze 32 μl RNase-freies Wasser hinzufügen. Inkubieren 1 min. Zentrifuge bei 12.000 X g für 30 s ~ 30 μL gereinigtes RNA-Lösung zu erhalten. Setzen Sie die Proben bei-20 ° C, während der Verarbeitung der denaturierten Probe.
4. Denaturierten RNS-Kontrolle-Vorbereitung
   1. Platz 30 µL RNA Probe für DC in 1,7 mL Kunststoffhülse auf Eis. Fügen Sie 50 μL der Formamid und 15 μl des DC-Puffer mit 300 mM HEPES (pH 8,0) und 25 mM EDTA in die Röhre.
   2. Wärme an die RNA bei 95 ° C für 1 min. schnell denaturieren hinzufügen 5 μL der NAI-Stammlösung (2 M), dann Streifen zweimal zu mischen und legen Sie den Schlauch wieder auf den Heizblock. Bei 95 ° C für eine zusätzliche 1 min inkubieren, dann sofort das Rohr auf Eis gelegt.
   3. 0,4 mL Guanidinium-Thiocyanat hinzugeben. Wiederholen Sie die Schritte 2.3.1–2.3.4.
   4. Waschen Sie die Spalte mit 0,6 mL 2 X RPE-Puffer (siehe Tabelle der Materialien) durch Spinnen für 15 s bei jedem Schritt. Trocknen Sie die Spalte durch die Spin-Spalte mit einer leeren Sammelrohr bei 12.000 X g für 1 min zentrifugieren.
   5. Die Mitte der Stütze 32 μl RNase-freies Wasser hinzufügen. Inkubieren 1 min. Zentrifuge bei 12.000 X g für 30 s ~ 30 μL der wiederhergestellten DC RNA-Lösung zu erhalten.
5. Primer-extension
   1. Normalisieren der RNA-Lösung von 2.3.7 und 2.4.5 in 0,5 μg/μL mit RNase-freies Wasser. Frisch bereiten Sie 30 mM MnCl₂ Lösung aus MnCl₂∙4H₂O Pulver zu.
   2. Übertragen Sie 9 μl RNA-Lösung für jede Probe in ein PCR-Streifen. Fügen Sie 1 μl 10 mM dNTP und 1 μl 2 μm gen-spezifische Primer (APS) in jedem Röhrchen. Pipette oben und unten viermal um zu mischen. Bei 65 ° C für 5 min in einem Thermocycler inkubieren und setzen auf Eis für > 1 min.
      Hinweis: Alternativ kann 1 μl von einer zufälligen Nonamer Ersatz des APS verwendet werden.
   3. In jedem PCR-Röhrchen, fügen Sie eine Mischung aus 2 μl 10 x RT Puffer (siehe Tabelle der Materialien), 4 μL 30 mM MnCl₂und 2 μL von 100 mM DTT. Pipette auf und ab 4 X zu mischen. Bei 42 ° C für 2 min inkubieren.
   4. Fügen Sie 1 μl Reverse Transkriptase (siehe Tabelle der Materialien). Pipette auf und ab 4 X zu mischen. Bei 42 ° C in einem Thermocycler für 3 h inkubieren.
6. Bibliothek-Vorbereitung und Sequenzierung der nächsten generation
   1. Einrichten einer PCR-Reaktion durch Zugabe von 1 μl DNA-Polymerase, 5 μL 10 x DNA-Polymerase-Puffer (siehe Tabelle der Materialien), 2 μL von DMSO, 1,5 μL für jede der Primer (10 μM), 34 μL von H₂O und 5 μl cDNA aus Schritt 2.5.4.
   2. Richten Sie den Thermocycler folgendermaßen: Stufe 1) 95 ° C für 2 min; Stufe 2) 95 ° C für 30 s; Stufe 3) 60 ° C für 30 s; Stufe 4) 68 ° C für 30 s; Etappe 5) Schleife zurück zum Schritt 2 für 30 Zyklen; 6. Etappe) 68 ° C für 3 min; und Stufe 7) unendlich bei 4 ° C bis zum folgenden Schritt halten.
   3. Reinigen Sie die Amplifikate mit 1,8 % Agarose-Gel.
      Hinweis: Die PCR-Band erscheint als ein single-Band auf dem Gel.
   4. Erstellen der Bibliothek mit standard Fragmentierung und Ligation Methoden der Literatur^6,26gegründet.
   5. Reihenfolge auf eine Next Generation Sequencing-Ausrüstung mit 1 x 75 Einend-liest etwa 10 Millionen erzeugen liest pro Probe.
   6. Analysieren Sie die Ergebnisse mit ShapeMapper und SuperFold Software Pakete, die von den Wochen entwickelte Gruppe²⁶.

Wir bewiesen vorher, dass eine RNA-Spleißen Modulator, SMN-C2, interagiert mit AGGAAG Motiv auf Exon 7 des SMN2 Gens Pre-mRNA und Form verwendet, um die RNA strukturelle Änderungen im Beisein von SMN-C26zu beurteilen. Die Bindungsstelle des SMN-C2 unterscheidet sich von der FDA zugelassene antisense Oligonucleotide (ASO) für SMA, Nusinersen, die bindet und blockiert die intronischen Spleißen Schalldämpfer (ISS) Intron 727,28 (Abbildung 1A). Die meisten bekannten Spleißen Regulatoren des SMN2 Exon 7 sind im Bereich ~ 100 Nukleotid von Exon 7 in der Pre-mRNA-29; daher eine 140 und 276 Nukleotid-lange RNA Sequenzen wurden verwendet für in-vitro- und in der Zelle Form, repräsentativ, die umfasst Exon 7 und der angrenzenden Intron-Region (Abb. 1A).

In dieser repräsentativen in-vitro-Form-Analyse ist die RNA-Sequenz von Interesse in einer optimierten Kassette entwickelt durch das Wochen-Labor, das für die meisten RNA-Sequenzen1kompatibel ist eingebettet. Gelegentlich wird die Reihenfolge des Interesses interagiert oder stört diese Kassette. In diesen Fällen kann eine modifizierte Kassette verwendet werden, mit den folgenden drei Eigenschaften: (i) eine 3'-Ende-spezifischen Primer-Bindungsstelle mit effizienter Hybridisierung Affinität für die Grundierung als irgend ein Teil der RNA-Sequenz, (Ii) eine stark strukturierte Haarnadel-Schleife befindet sich unmittelbar vor der Grundierung Bindungsstelle, die zeigen wird, bestimmte reproduzierbare Form Signal (Dies wird als beide eine interne Kontrolle für das Experiment und die Methode, um das Signal von Experiment zu Experiment ausrichten) und Iii) eine 5'-Ende-Haarnadel-Struktur Element, das das Ende des Form-Signals angibt. Die Form-Kassette wird weiter flankiert, mit selbst Spalten Ribozym Sequenzen an beiden 5'- und 3'-enden um eine homogene RNA30zu generieren. Wir fanden, dass Hammerhai und Hepatitis Delta Virus Ribozyme kompatibel zu der Form-Kassette sind und in der Regel hohe Ausbeute an die gewünschte RNA geben. Die daraus resultierende Vorlage RNA hat eine 3'-Ende von 2', 3'-zyklische Phosphat und eine 5'-Ende der Hydroxylgruppe, die mit Primer Extension nicht stören. Eine 140-Nukleosid lange Sequenz für Exon 7 des SMN2 und angrenzenden Gebiet in der Pre-mRNA wurde in Form und Ribozym Kassette synthetisiert, wie in Schema 1dargestellt.

Im Allgemeinen sollte die Reihenfolge des Interesses in der Expressionskassette ligiert lang genug, um den möglichen sekundären oder höheren Auftrag Struktur abzudecken sein. Im Falle von SMN2 Exon 7 enthält eine 140-Nukleotid-Region zwei Stem-Loop Strukturen6,31. Die Struktur der Region von Interesse ist von Fall zu Fall unterschiedlich und sollten durch Versuch und Irrtum ausgewertet werden.

Polyacrylamid-Sequenzierung-Gel mit 32P-Label Grundierung Erweiterungsprodukte wurde gewählt, um die in-vitro- Form-Profil in diesem repräsentativen Experiment zu visualisieren. Eine alternative Visualisierungsmethode soll Kapillarelektrophorese mit einem Eindringmittel beschrifteten DNA-Primer32verwenden. In Polyacrylamid Sequenzierung Gele ~ 20 Nukleoside in der Nähe von 5'-Ende und ~ 10 Nukleotide in der Nähe von 3'-Ende der RNA-Sequenz des Interesses nicht quantitativ visualisiert werden, wegen gelegentlich hält an die Einleitung Schritte der reversen Transkription und intensiv Bands auf Seite Gele für Full-length Protokolle1.

Eine alternative Möglichkeit für präparative Gel Wiederherstellung einer RNA-Vorlage (Schritte 1.1.6 bis 1.1.12) ist eine Mini-Gel zu überladen, wenn der Ertrag der gewünschten RNA-Vorlage ist > 90 %. Es wird empfohlen, die überschüssige NTP aus dem RNA-Produkt entfernen, durch Entsalzung die Spalte und die RNA in 50 µL TE-Puffer eluierenden. Messen der Konzentration der RNA und 5,0 µg in jede Vertiefung zu laden. Während der Reinigung Schritt der T7 RNA-Vorlage transkribiert, die Seite zu stoppen, wenn der Xylol Cyanol FF Farbstoff (hellblau) bestanden zwei Drittel des 6 % denaturiert FSME-Harnstoff-Gel. Das selbst-Spaltung-RNA-Fragment (< 80 Nukleoside) ging durch das Gel, das die gewünschte RNA als einzige große Band in das Gel auf die Färbung (Abbildung 1 b) verlassen.

SMN-C2 (Abbildung 1) wurde gemäß der veröffentlichten Verfahren33 synthetisiert und in 10 mM DMSO Stammlösung gelöst. Die Stammlösung ist weiter verdünnt, in 500 bis 50 µM bei 10 % DMSO-Lösung Endkonzentrationen von 50 und 5 µM bzw. zu erreichen. Snap-gekühlten RNA refolded zu seinem Gleichgewicht Stadium in Anwesenheit von DMSO oder SMN-C2 innerhalb von 30 min bei 37 ° C. Eine längere Inkubationszeit änderte sich nicht das Ergebnis des Experiments. Beiden experimentellen Proben (50 und 5 µM SMN-C2), zwei steuert (DMSO und NAI-Kontrollen) und vier Marker (A, T, G, C) für Grundierung Erweiterung behandelt wurden. Nach Freilegung das Gel zum Phosphor-Lagerung-Bildschirm, ein gelungenes Experiment Form erscheint: (i) eine Einzel- und die meisten intensiven Band am oberen Rand das Gel und (Ii) Bands das Gel bei Einzel-Nukleotid-Auflösung ohne Abstrich (Abbildung 1). Ein häufiges Problem bei PAGE-Analyse ist, dass eine Abstrich-Region bekannt als das "Salz"vorne in der Mitte des Gels (Abbildung 1E) auftreten kann. Dies ist wahrscheinlich aufgrund der hohen Konzentration von Salz, DMSO, oder andere unerwünschte Substanz in den Laden-Probe, die durch Ethanol Niederschlag entfernt werden kann.

In in-vitro-Form, eine reine RNA-Vorlage ist der Schlüssel für ein gelungenes Experiment. Eine unreine RNA-Vorlage ist in der Regel die Ursache für unerwünschte Ergebnisse. Wenn PAGE-Analyse deutlich eine Muster von 2 Sätzen von Markern zeigt, bedeutet dies, dass die RNA-Vorlage nicht homogen ist und braucht um durch präparative repurified FSME-Harnstoff gel.

Für ZELLFORM ist ein Schlüssel für ein gelungenes Experiment, eine optimierte Grundierung Set für Verstärkung zu entwerfen. Mit 0,10 µg genomische DNA-freie cDNA-Vorlage ist ein single-Band innerhalb von 25 PCR-Zyklen im Agarose-Gel-Analyse hinzuweisen. Die sich wiederholende Intron-Sequenzen sollte daher vermieden werden. Zur Untersuchung der strukturellen Auswirkungen des SMN-C2 auf SMN2 Pre-mRNA, drei Grundierung Sets (Tabelle 2) wurde getestet, und alle waren zufrieden stellend (Abbildung 2A).

Eine niedrige Kopienzahl einer Ziel-RNA-Sequenz ist in der Regel ein Problem für ZELLFORM. Die RNA von Interesse zu bereichern, war ein Minigene, der RNA-Sequenz des Interesses unter einen starken CMV-Promotor enthält, in 293T Zellen transfiziert. Weil das Spleißen Muster des SMN2 Minigene der endogenen SMN2 mit oder ohne SMN-C219,34 rekapituliert, wir uns vorstellen, dass die Struktur des SMN-C2 interagierenden RNA in die überexprimieren SMN2 Pre-mRNA wahrscheinlich das gleiche wie war Das endogene Genprodukt. Während die EG-50 des SMN-C3 in das Spleißen Assay ~0.1 µM6,19war, wurde eine Konzentration am oberen Ende (20 µM) verwendet, um die Bindung Zustand des kleines Molekül und Ziel-RNA-Sequenz sicherzustellen.

Bei der Isolierung der RNA können Gen-spezifischen und zufälligen Primern für Erweiterung verwendet werden. Im Falle von Exon 7 des SMN2 fanden wir, dass SMN2E7-338-RV (Tabelle 2) ergibt sich eine höhere Kopie der gewünschte cDNA als eine zufällige Nonamer, belegt durch eine intensivere Band in die PCR-Amplifikation mit SMN2E7-276 Grundierung (Tabelle 2) nach 25 Zyklen. In der 2'-OH-Änderung-Schritt diente eine 91 µM Endkonzentration NAI einer Inkubationszeit von 15 Minuten. Wenn eine andere Zellentyp oder Medium verwendet wird, muss die Inkubationszeit neu optimiert sein. Wenn die Inkubationszeit zu lang ist, wird Agarose-Gelanalyse der Amplifikate manchmal fehlschlagen, eine Band zu zeigen.

Ein Python-basiertes Programm, ShapeMapper, entwickelt von den Wochen Labor35 verwendet wurde, um von der nächsten Generation Sequenzierung [für Rohdaten des SMN-C2 behandelt in der Zelle Form des SMN2 Exon 7 Pre-mRNA, beziehen sich auf die Sequenz lesen Archiv (SRA) erzeugten Daten zu analysieren Datenbank]. Während der Amplifikate hat die Form Reaktivität nicht wesentlich verändert (> 1), denen zufolge die Sekundärstruktur in Anwesenheit von SMN-C2 (Abbildung 2 b) bleibt. Dies bestätigt auch der Bogen Grundstücke erzeugte SuperFold35. Die Anschlussleitungen zeigen die möglichen Basenpaarung basierend auf Form-Aktivität von jedem Nukleotid. SMN-C2 und DMSO-behandelten RNA Modellierung ist im Wesentlichen die gleichen (Abbildung 2). Differential in Zelle Form Reaktivität wurde für jedes Nukleotid (Abb. 2 b) berechnet, und die meisten Reaktivität Änderung kam im TSL-1 (5'-Ende des Exon 7) aber nicht TSL-2 (3'-Ende des Exon 7). Dieses Ergebnis stimmt mit der in-vitro-Form; Obwohl die Basenpaarung von in-vitro-verlagert analysiert Form RNA-Modellierung in der ZELLFORM (Bild 2D).

Ein häufiges Problem in der Zelle Form ist die geringe Mutationsrate in der Amplifikate. Dies ist normalerweise aufgrund von genomische DNA-Verunreinigung. DNA enthält keine 2'-OH-Gruppe; Daher entsteht kein Acylation Produkt mit NAI. PCR-Amplifikation spiegelt somit lediglich die geringen Mutationsrate der DNA-Polymerase. Isolierung der RNA durch Guanidinium-Thiocyanat gefolgt von auf Spalte DNase Verdauung ist ausreichend, um alle DNA in den meisten Fällen zu entfernen. DNA-Kontaminationen weiterhin besteht, wiederholen Sie Schritt 2.3 zur RNA-Isolierung.

Schema 1: DNA-Sequenz für die Vorlage der RNA-Transkription. Die 12 bp Sequenzfolge innerhalb der Hammerhead Virus Ribozym in rot ist die umgekehrte Ergänzung der ersten 12 bp der 5'-Kassette. Die RNA-Sequenz von Interesse, die enthaltenen ist ein 140 bp Pre-mRNA-Sequenz enthält Exon 7 des menschlichen SMN2 Gens. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Abbildung 1: Versuchsplanung und Ergebnis von in-vitro-Form für SMN2 Exon 7 Pre-mRNA in Anwesenheit von SMN-C2. (A) Überblick über die Reihenfolge des Interesses für in-vitro- und in der Zelle Form Studien des SMN2 Gens. SMN-C2 bindet an das AGGAAG Motiv auf Exon 7, eine unterschiedliche Lage von der Nusinersen-Bindungsstelle. (B) Reinigung des Messguts T7 Transkription. Jede der drei Fahrspuren enthält 5,0 µg Rohöl RNA. Die FSME-Harnstoff-Gel war mit SYBR-Safe (01:10, 000) für 5 min in 1 X TBE Puffer gefärbt. Rotes gestrichelte Feld zeigt den Rand der Exzision für RNA-Erholung. (C) die Struktur des SMN-C2. (D) In-vitro-Form-Experiment mit NAI und einem 140 Nukleotid-lange RNA Vorlage mit Exon 7. 1 = DMSO; 2 = SMN-C2 (50 ΜM); 3 = SMN-C2 (5 ΜM); 4 = Mangel an dem NAI; 5-8 = Leitern durch Zugabe von DdATP, DdTTP, DdCTP und DdGTP während der Grundierung Erweiterung erzeugt. Seite erfolgte, auf einem FSME-Harnstoff Sequenzierung Gel mit 60 W für 3 h rote Sternchen geben erhöhte Band Intensität mit 50 µM SMN-C26. (E) ein Beispiel für eine "Salz Front" Region im gestrichelten roten Feld aus einem separaten Experiment. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Abbildung 2: In der Zelle Form abgeleitet RNA Modellierung für SMN2 Exon 7 Pre-mRNA. (A) PCR-Amplifikation mit allen drei Grundierung-Sets (Tabelle 2) ergab ein einzelnes Band in Agarose-Gel-Analyse. 1 = SMN2E7-338, 2 = SMNE7-276, 3 = SMN2E7-251, 4 = DNA-Leiter. (B) Differential in Zelle Form Reaktivität in SMN2 293T Minigene-transfizierten Zellen für 10 µM SMN-C2 und DMSO in TSL1. Form-Reaktivität bei Einzel-Nukleotid-Auflösung. Die Standardabweichung wurde von ShapeMapper Software35berechnet. Grüne Sternchen geben deutliche Reaktivität Formänderung induziert durch 10 µM SMN-C2. Die Nummerierung der Nukleotide in den 276 bp Amplikons gezeigt auf X-Achse. Fehlerindikatoren wurden durch Form-Mapper Software26geschätzt. (C) Arc Plot von SuperFold35 für die plausibelste RNA Sekundärstruktur Modellierung von SHAPE-Daten in der Zelle erzeugt. (D) In-vitro- und in der Zelle unter der Regie von SHAPE Modellierung von Exon 7 und angrenzenden Regionen. Für in-vitro-RNA Modell sind Form, die Stabilisierung der Kassette (Orange) und Nukleotiden 1-19 (blau) in Skizze dargestellt. Für Modell RNA in der Zelle wird Nukleotid Nummerierung in-vitro-Form Vorlage ausgerichtet. Nukleotide, 1-18 und 120-140 wurden weggelassen. Deutliche Reaktivität Änderungen sind in roten und grünen Sternchen für in-vitro- und in der Zelle Form angegeben. Die Sekundärstrukturen, die zuvor TSL1 und TSL231 genannt wurden sind in blauen Kästchen eingeschlossen. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Tabelle 1: Die Grundierung Sequenzen in der repräsentativen Experiment verwendet.

Tabelle 2: die Grundierung setzt zur Verstärkung der Pre-mRNA-Sequenz von Interesse. Alle drei Grundierung Sets ergeben einen einzigen Amplifikate in einer PCR-Reaktion mit genomischen DNA-freie cDNA-Vorlage.

Die Autoren erklären keinen Interessenskonflikt.