Zelle Fraktionierung von U937 Zellen in der Abwesenheit von High-Speed-Zentrifugation

Zusammenfassung

Hier präsentieren wir ein Protokoll, um die Plasmamembran, Zytoplasma und Mitochondrien von U937 Zellen ohne den Einsatz von High-Speed-Zentrifugation zu isolieren. Diese Technik lässt sich subzelluläre Fraktionen für die anschließende Untersuchung des Proteins Lokalisierung über Immunoblotting zu reinigen.

Zusammenfassung

In diesem Protokoll zeigen wir eine Methode, subzelluläre Bruchteile von U937 Zellen ohne den Einsatz von Ultrazentrifugation oder wahllose Reinigungsmittel zu erhalten. Diese Methode nutzt hypotone Puffer, Digitonin, mechanische lyse und differentielle Zentrifugation, Zytoplasma, Mitochondrien und Plasmamembran zu isolieren. Der Prozess kann skaliert werden, um den Bedürfnissen der Forscher, ist preiswert und unkompliziert. Diese Methode ermöglicht abschätzen, Protein-Lokalisierung in Zellen ohne spezielle Zentrifugen und ohne den Einsatz von kommerziellen Kits, die teuer werden können. Wir haben erfolgreich diese Methode cytosolischen trennen, Plasmamembran und mitochondrialen Proteine in die menschliche Monocyte-Zellinie U937 verwendet.

Einleitung

Zuverlässige Identifikation von Protein-Lokalisierung ist oft notwendig, bei der Prüfung, molekulare Signalwege in eukaryotischen Zellen. Methoden, subzelluläre Brüche zu erhalten sind übernommen werden Forscher zelluläre Komponenten von Interesse näher zu untersuchen.

Die Mehrzahl der bestehenden Zelle Fraktionierung Methoden fällt in der Regel in zwei große Kategorien, Waschmittel-basierte^1,2 und Ultrazentrifugation basierende^3,4,5, die sein kann unterscheiden sich durch Schnelligkeit, Pr....

Protokoll

1. bereiten Sie Puffer und Reagenzien

Hinweis: Siehe Tabelle 1.

1. Lösungen von Puffer A, Lyse Puffer B, Probenpuffer und Digitonin vorzubereiten.
   1. Bereiten Sie Puffer A durch Zugabe von 8,77 g NaCl und 50 mL HEPES (1 M, pH 7,4), 900 mL entionisiertem Wasser, Anpassung Endvolumen bis 1 L mit entionisiertem Wasser.
      Hinweis: Endkonzentrationen sind 150 mM NaCl und 50 mM HEPES.
   2. Bereiten Sie Lyse Puffer B durch Zugabe von 20 mL HEPES (1 M, pH 7,4), 0,75 g KCl, MgCl₂, 2 mL Ethylenediaminetetraacetic Säure (0,5 M EDTA), 0,19 g 2 mL Ethylenglykol-Bis(β-aminoethyl ether)-N, N, N', N'-Tetraacet....

Ergebnisse

Erfolgreiche Fraktionierung der undifferenzierten U937⁸ Zellen in Suspension angebaut wurde durchgeführt unter Verwendung des Protokolls genannten und in Abbildung 1dargestellt. Die Proben, die mit dieser Methode wurden westlichen befleckenden⁹ Nutzung eine nasse Übertragungsmethode auf eine Membran Polyvinylidene Fluorid (PVDF) unterzogen. Die Membran wurde anschließend mit Antikörpern gegen sondiert zytoplasma.......

Diskussion

Die Entwicklung dieses Protokolls entstand aus einer Unfähigkeit, mitochondriale trennen und Membran-Proben, mit handelsüblichen Kits für die Analyse von Protein-Lokalisierung während Necroptosis¹⁴. Die primäre Einschränkungen von vorgefertigten Kits sind ihre Unfähigkeit, auf die Bedürfnisse des einzelnen Forschers angepasst werden die Kosten pro Probe und begrenzte Anzahl von Proben können verarbeitet werden. Die hier vorgestellte Methode kann ohne den Einsatz von teuren Reagenzien und ohne die .......

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Digitonin	TCI Chemicals	D0540	Für die Zytoplasma-Extraktion
D-Mannitol	Sigma-Aldrich	M4125	Für Lysepuffer B
Dounce Homogenisator	VWR	22877-282	Für die Homogenisierung
End-over-End-Rotator	Barnstead	N/A	Für die Zytoplasma-Extraktion
Ethylenglykol-bis(β-aminoethylether)-N,N,N' ,N'-Tetraessigsäure (EGTA)	Alfa Aesar	J61721	Für Lysepuffer B
Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA)	Sigma-Aldrich	E7889	Für Lysepuffer
B GAPDH (14C10)	Cell Signalling Technologies	2118	Für den Nachweis zytoplasmatischer Fraktionen auf Western Blot, Verdünnung: 1:10000
HEPES	VWR	J848	Für Lysepuffer A und B
KCl	Sigma-Aldrich	P9541	Für Lysepuffer B
MgCl2	Alfa Aesar	12315	Für Lysepuffer
B Na, K-ATPase a1 (D4Y7E)	Cell Signalling Technologies	23565	Für den Nachweis von Plasmamembranfraktionen auf Western Blot, Verdünnung: 1:1000
NaCl	Sigma-Aldrich	793566	Für Lysepuffer A
Phenylmethansulfonylfluorid (PMSF)	VWR	M145	Für die Zytoplasmaextraktion und Homogenisierung
Puffersonde Ultraschallgerät	Qsonica	Q125-110	Für Endproben
Proteaseinhibitor Cocktail, Allgemeine Verwendung	VWR	M221-1ML	Für die Zytoplasmaextraktion
gekühlte Zentrifuge	Beckman-Coulter	N/A
Natriumdodecylsulfat (SDS)	VWR	227	Für Probenpuffer
Natriumorthovanadat (SOV)	Sigma-Aldrich	450243	Für Lysepuffer A und B
Saccharose	Sigma-Aldrich	S0389	Für Lysepuffer B
Tris-gepufferte Kochsalzlösung (TBS)	VWR	788	Für Probenpuffer
VDAC (D73D12)	Zellsignaltechnologien	4661	Zum Nachweis mitochondrialer Fraktionen auf Western Blot, Verdünnung: 1:1000