Methodenartikel
Diese Studie beschreibt einen hohen Durchsatz, Imaging-basierte Mikro-Neutralisation Assay der Titer von neutralisierende Antikörper spezifisch für respiratory syncytial Virus (RSV) zu bestimmen. Dieser Assay-Format wurde auf verschiedenen Probenarten getestet.
Respiratory syncytial Virus-spezifischen neutralisierenden Antikörper (RSV NAbs) sind ein wichtiger Marker der Schutz gegen RSV. Eine Reihe von verschiedenen Assay-Formate sind derzeit weltweit im Einsatz so gibt es eine Notwendigkeit für eine präzise und Hochdurchsatz-Methode zur Messung der RSV NAbs. Wir beschreiben hier einen Imaging-basierte Mikro-Neutralisation-Assay, der auf RSV Untergruppe A getestet wurde und kann auch für RSV Untergruppe B und verschiedenen Probentypen angepasst werden. Diese Methode ist sehr reproduzierbar, mit Inter-Assay-Variationen für den Referenz-Antiserum wird weniger als 10 %. Wir glauben, dass dieser Test leicht in vielen Laboren weltweit relativ kostengünstig hergestellt werden kann. Entwicklung einer verbesserten, Hochdurchsatz-Assays, die RSV NAbs misst ist ein bedeutender Schritt nach vorn für die Standardisierung von dieser Methode international als entscheidend für die Bewertung der neuartigen RSV Impfstoffkandidaten in der Zukunft.
Respiratory syncytial Virus (RSV) ist die führende Ursache von Infektionen der unteren Atemwege in der pädiatrischen Population weltweit1. Trotz seiner hohen Belastung gibt es noch keine Impfung oder Behandlung zur Verfügung. Seit 2013 hat die Weltgesundheitsorganisation (WHO) RSV Impfstoffentwicklung vorrangig Großforschungseinrichtungen, mit jährlichen WHO Beratung treffen2,3erklärt. Die WHO hat vereinbart mit RSV neutralisierenden Antikörpern (NAb) Messung Impfstoff Immunogenität, zu überwachen, wie dies als großen serologische Marker für Schutz4erkannt wird. ....
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Hinweis: Alle Schritte müssen in einer BSL2 Haube durchgeführt werden, sofern nicht anders angegeben. Virale Titration ist erforderlich im Vorfeld einer PRN-Test zur Bestimmung der optimalen RSV-Konzentration in der PRN-Assay verwendet. Es empfiehlt sich, aliquoten die Virus-Bestände in einem kleinen Volumen, die einmal aufgetaut und für jede NAb-Assay verwendet werden. Mit der gleichen virale bestand für alle NAb-Assays für alle Proben aus einer Studie durchgeführt wird auch empfohlen. Stellen Sie sicher, Kultur, Medien und Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS) ist bei 37 ° C erwärmt, bevor Sie Zellplatten hinzufügen.
1. ....
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Die Titration einer Virus-Aktie wurde durchgeführt von 01:10, 01:108 Verdünnung der Viruskonzentration Lager vor der PRN-Assay (repräsentative Ergebnisse in Abbildung 5dargestellten) zu bestimmen. Aus Abbildung 5, PFU gezählt werden kann zuverlässig bei Verdünnungen von 01:104 und 01:105. Die durchschnittliche Anzahl der PFU aus dreifacher Brunnen bei der gleichen Verdünnung wurde berechnet. Da di.......
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Wir haben entwickelt und optimiert, einen einfachen und effizienten RSV Mikro-Neutralisation-Assay, der leicht in den meisten Labors angepasst werden kann. Dieser Assay ist in der Lage, Virusinfektion Fähigkeit sowie die Messung der Hemmung der viralen Infektion durch NAb auf zellulärer Ebene mit computerisierten Bild scannen zu messen. Die Verwendung von einer Imaging-basierten Plattform und spezifische Antikörper-basierten Systeme ist die Spezifität und Sensitivität der Spoterkennung im Vergleich zu herkömmlichen Plaqu.......
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Die Autoren haben nichts preisgeben.
Die Autoren danken allen Beteiligten. Wir anerkennen die Staatsregierung betriebliche Infrastruktur Support-Programm. PVL ist ein NHMRC Karriere Entwicklung-Stipendiat.
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| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| Cell line | |||
| A549 | ATCC | CCL-185 | zur Verfügung gestellt von Dr. Keith Chappell, University of Queensland |
| Viral strains | |||
| RSV A2 | ATCC | VR-1540 | Chargennummer 60430286 |
| Reagents | |||
| Aceton | Merck | 1000142511 | |
| Alexa-Fluor Esel Anti-Ziegen-IgG (gelagert bei 4 ° C) | Life Technologies | A11055 | |
| CMC Natriumsalzpulver | Sigma-Aldrich | C5678-500G | |
| DMEM (kein Serum, 3,7 g/L NaHC, P/S) (gelagert bei 4 &/de; C) | Wissenschaftliche Dienstleistungen – Gewebekultur | MCRI in der Hausversorgung | |
| Fötales Kälberserum (gelagert in 50 mL Aliquoten bei -20 &de; C) | Interpath | SFBS-F | |
| Goat X RSV Antikörper | Merck | AB1128 | |
| humanes polyklonales Antiserum gegen das Respiratorische Synzytial-Virus (RSV) (gelagert in 45 & micro; L aliquotiert bei -20 ° C) | BEI Resources | NR-4022 | Kostenlose Bestellung über BEI Resources bei der Registrierung. Dieses Serum gehört zu einer Reihe von humanen Antiserum und Immunglobulin gegen RSV (NR-32832) |
| M199 Pulver | Life Technologies | 31100035 | |
| Milchverdünnungsblockierungslösung (gelagert bei 4 & Grad; C) | Australian Biosearch | 50-82-01 | |
| Penicillin/Streptomycin (gelagert in 6 ml-Aliquoten bei -20 ° C) | Life Technologies | 15140122 | |
| s.d.H2O aus Milli-Q Dispenser | Merck | Eigene Abgabe | |
| Steril 1x PBS für Kultur (gelagert bei 4 > C) | Wissenschaftliche Dienstleistungen – Gewebekultur | MCRI in Hausversorgung | |
| Tween 20 Polysorbat | Sigma-Aldrich | 9005-64-5 | |
| Allgemeine Verbrauchsmaterialien | |||
| (50 mL) | Invitro Technologies | FAL352070 | |
| Filtereinheit 0,22 μ m (500 mL) | Thermo Fisher | NAL5660020 | |
| Sterile Eppendorf-Röhrchen (1,5 mL) | Australia PL | AM12400 | |
| Sterile Platten mit flachem Boden (96 Well mit Deckel) | Interpath | 655180 | |
| Sterile Platten mit U-Boden (96 Well mit Deckel) | Interpath | 650180 | |
| Serologische 5-ml-Pipette | Sigma-Aldrich | CLS4487-200EA | |
| 10 mL serologische Pipette | Interpath | 607180 | |
| 25 mL serologische Pipette | Sigma-Aldrich | CLS4251-200EA | |
| Spitze Pipette 1-200 µ L Clear Maxymum Recovery Racked Vorsterilisiert 10RACKS x 96TIPS PKG960 | Fisher Biotec | TF-200-L-R-S | |
| Spitze Pipette 5-20 µ L Clear Maxymum Recovery Racked Vorsterilisiert 10RACKS x 96TIPS PKG960 | Fisher Biotec | TF-20-L-R-S | |
| Spitze Pipette 100-1.000 µ LClear Maxymum Recovery Racked Vorsterilisiert 10RACKS x 100TIPS PKG1000 | Fisher Biotec | TF-1000-L-R-S | |
| Spitzenpipette 1-10 & micro; L Clear Maxymum Recovery Racked Vorsterilisiert 10RACKS x 100TIPS PKG1001 | Fisher Biotec | TXLF-10-L-R-S | |
| Ausrüstungen und SoftwaresELISpot | |||
| Lesesystem | AID iSpot, Autoimmun Diagnostika GmbH, Strasburg, Deutschland | ||
| AID ELISpot Software Version 5.0 | AID iSpot, Autoimmun Diagnostika GmbH, Strasburg, Deutschland | ||
| Microsoft Excel 2007 |
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