Messung der Knochenumgestaltung und Nachbildung der Tumor-Knochen-Mikroumgebung mit Calvaria-Kokultur und Histomorphometrie

Summary

Die Ex-vivo-Kultur von Knochenexplanten kann ein wertvolles Werkzeug für die Erforschung der Knochenphysiologie und die mögliche Bewertung von Medikamenten bei Knochenremodellierung und Knochenerkrankungen sein. Das vorgestellte Protokoll beschreibt die Vorbereitung und Kultur von Calvarias, die aus neugeborenen Mäuseschädeln isoliert sind, sowie deren Anwendungen.

Abstract

Knochen ist ein Bindegewebe aus Osteoblasten, Osteozyten und Osteoklasten und einer mineralisierten extrazellulären Matrix, die ihm seine Stärke und Flexibilität verleiht und es ihm ermöglicht, seine Funktionen zu erfüllen. Knochen sind kontinuierlich einer Vielzahl von Reizen ausgesetzt, die unter pathologischen Bedingungen den Knochenumbau deregulieren können. Um Knochenbiologie und Krankheiten zu untersuchen und potenzielle therapeutische Wirkstoffe zu bewerten, war es notwendig, In-vitro- und In-vivo-Modelle zu entwickeln.

Dieses Manuskript beschreibt den Sezierensprozess und die Kulturbedingungen von Calvarias, die von neonatalen Mäusen isoliert wurden, um die Knochenbildung und die Mikroumgebung des Knochentumors zu untersuchen. Im Gegensatz zu In-vitro- und In-vivo-Modellen ermöglicht dieses Ex-vivo-Modell die Erhaltung der dreidimensionalen Umgebung des Gewebes sowie der zellulären Vielfalt des Knochens während der Kultivierung unter definierten Bedingungen, um die gewünschte Mikroumgebung zu simulieren. Daher ist es möglich, Knochen-Remodeling und seine Mechanismen zu untersuchen, sowie die Wechselwirkungen mit anderen Zelltypen, wie die Wechselwirkungen zwischen Krebszellen und Knochen.

Die hier berichteten Assays verwenden Calvarien von 5-7 Tage alten BALB/C-Mäusen. Die erhaltenen Hemi-Calvarien werden in Gegenwart von Insulin, Brustkrebszellen (MDA-MB-231) oder konditionierten Medien aus Brustkrebszellkulturen kultiviert. Nach der Analyse wurde festgestellt, dass Insulin eine neue Knochenbildung induzierte, während Krebszellen und ihre konditionierte mittelinduzierte Knochenresorption. Das kalvariale Modell wurde erfolgreich in der Grundlagen- und angewandten Forschung eingesetzt, um knochenentwicklung und krebsinduzierte Knochenerkrankungen zu untersuchen. Insgesamt ist es eine ausgezeichnete Option für einen einfachen, informativen und kostengünstigen Assay.

Introduction

Knochen ist ein dynamisches Bindegewebe, das mehrere Funktionen hat, einschließlich der Unterstützung der Muskeln, Schutz der inneren Organe und Knochenmark, und Speicherung und Freisetzung von Kalzium und Wachstumsfaktoren^1,2. Um seine Integrität und die ordnungsgemäße Funktion zu erhalten, wird Knochengewebe kontinuierlich umgebaut. Im Allgemeinen kann ein Zyklus der Knochenumgestaltung in Knochenresorption und Knochenbildung¹unterteilt werden. Ein Ungleichgewicht zwischen diesen beiden Phasen des Knochenumbaus kann zur Entwicklung von Knochenpathologien führen. Auch Krankheiten wie Brustkrebs beeinflussen oft die Knochenintegrität; etwa 70% der Patienten im fortgeschrittenen Stadium haben oder werden Knochenmetastasen haben. Wenn Brustkrebszellen in die Knochen gelangen, beeinflussen sie den Knochenstoffwechsel, was zu einer übermäßigen Resorption (osteoklastische Läsionen) und/oder Bildung (osteoblastische Läsionen)³führt.

Um die Biologie von Knochenerkrankungen zu verstehen und neue Behandlungen zu entwickeln, ist es notwendig, die Mechanismen zu verstehen, die mit dem Umbau von Knochen verbunden sind. In der Krebsforschung ist es wichtig, den Knochenmetastasierungsprozess und seine Beziehung zur metastasierenden Mikroumgebung zu untersuchen. Im Jahre 1889 vermutete Stephen Paget, dass Metastasen auftreten, wenn es Kompatibilität zwischen den Tumorzellen und dem Zielgewebe gibt, und schlug vor, dass die metastasierende Stelle von der Affinität des Tumors für die Mikroumgebung abhängt⁴. 1997 führten Mundy und Guise das Konzept des "bösartigen Zyklus von Knochenmetastasen" ein, um zu erklären, wie Tumorzellen die Mikroumgebung des Knochens verändern, um ihr Überleben und Wachstum zu erreichen, und wie die Knochenmikroumgebung ihr Wachstum fördert, indem sie Kalzium und Wachstumsfaktoren^5,6,7zur Verfügung stellt.

Um die Mechanismen der Knochenumgestaltung und Knochenmetastasierung zu charakterisieren und Moleküle mit möglichem therapeutischen Potenzial zu bewerten, war es notwendig, In-vitro- und In-vivo-Modelle zu entwickeln. Diese Modelle stellen jedoch derzeit viele Einschränkungen dar, wie z. B. die vereinfachte Darstellung der Knochenmikroumgebung und deren Kosten^8,9. Die Kultur der Knochenexplantationen ex vivo hat den Vorteil, dass die dreidimensionale Organisation sowie die Vielfalt der Knochenzellen erhalten bleiben. Darüber hinaus können experimentelle Bedingungen kontrolliert werden. Die Explant-Modelle umfassen die Kultur der metatarsalen Knochen, Femoralköpfe, Calvarias und Unterkiefer- oder Trabekulularkerne¹⁰. Die Vorteile der ex vivo-Modelle wurden in verschiedenen Studien nachgewiesen. Im Jahr 2009 berichteten Nordstrand und Mitarbeiter über die Einrichtung eines Cokulturmodells, das auf den Wechselwirkungen zwischen Knochen- und Prostatakrebszellen basiert¹¹. Auch im Jahr 2012 berichteten Curtin und Mitarbeiter über die Entwicklung eines dreidimensionalen Modells mit Ex-vivo-Kokulturen ¹². Der Zweck solcher Ex-vivo-Modelle ist es, die Bedingungen der Knochenmikroumgebung so genau wie möglich neu zu erstellen, um die Mechanismen zu charakterisieren, die bei der normalen oder pathologischen Knochenumgestaltung beteiligt sind, und die Wirksamkeit neuer therapeutischer Wirkstoffe zu bewerten.

Das vorliegende Protokoll basiert auf den von Garrett¹³ und Mohammad et al.¹⁴veröffentlichten Verfahren. Neonatale Maus-Calvaria-Kulturen wurden als experimentelles Modell verwendet, da sie die dreidimensionale Architektur des Knochens in Entwicklung und Knochenzellen beibehalten, einschließlich Zellen in allen Stadien der Differenzierung (d.h. Osteoblasten, Osteoklasten, Osteozyten, Stromalzellen), die zu reifen Osteoklasten und Osteoblasten führen, sowie die mineralisierte Matrix¹⁴. Das ex vivo-Modell stellt den pathologischen Prozess von Knochenerkrankungen nicht vollständig dar. Die Auswirkungen auf den Knochenumbau oder die krebsinduzierte Knochenosteolyse können jedoch genau gemessen werden.

Kurz gesagt, besteht dieses Protokoll aus den folgenden Schritten: die Zerlegung von Calvarias von 5-7 Tage alten Mäusen, Calvaria-Präkultur, Calvaria-Kulturanwendungen (z. B. Kultur in Gegenwart von Insulin, Krebszellen oder konditioniertem Medium, und sogar Wirkstoffe mit therapeutisches Potenzial, entsprechend dem Ziel der Untersuchung), Knochenfixierung und Calvaria-Entkalkung, Gewebeverarbeitung, histologische Analyse und Ergebnisinterpretation.

Protocol

Alle Mäuse, die in diesen Assays verwendet wurden, wurden aus BALB/c-Mäusestämmen gewonnen, bei der männliche und weibliche Mäuse wahllos verwendet wurden. Frühere Kulturexperimente wurden auch mit anderen Stämmen durchgeführt, wie FVB, Schweizer Mäuse, CD-1 und CsA Mäuse^11,12,14. Alle Mäuse wurden gemäß den Richtlinien der National Institutes of Health (NIH), Anhang Q, untergebracht. Verfahren, die tierische Themen betreffen, wurden vom Institutional Animals Care and Use Committee (IACUC) am Center for Scientific Research and Higher Education in Ensenada (CICESE) genehmigt.

1. Calvariale Sezierung

1. Sterilisieren Sie Sezierinstrumente (z.B. 1 x 2 Zahngewebezangen, gerade chirurgische Schere, Sezieren schere, feinspitzen Pinzette, feine gekrümmte Spitze sezierenZangen, sezierende Zangen, Skalpell). Steriles destilliertes Wasser kann verwendet werden, um die chirurgischen Werkzeuge zwischen jeder Sezierung zu reinigen, und sterile 1x PBS können für die Reinigung jeder Hämi-Calvaria verwendet werden.
2. Legen Sie die sterilen Sezierinstrumente, Wasser, 1x PBS und die erforderlichen Materialien für die Durchführung des Verfahrens (z. B. Mikropipetten, Niederschlagsgläser, sterile Petrischalen) in eine laminare Durchflusshaube.
   HINWEIS: Führen Sie das gesamte Verfahren unter sterilen Bedingungen durch.
3. 12 ml sterile 1x PBS in zwei 10 cm Petrischalen geben.
4. Wählen Sie die Welpen aus und platzieren Sie sie in der Nähe der Kapuze.
   HINWEIS: Sezieren Sie die Calvarias von 5-7 Tage alten Welpen.
5. Wählen und halten Sie die Maus vorsichtig mit sezierenden Zangen.
6. Enthaupten Sie die Maus mit einer Sezierschere und legen Sie den Kopf in eine Petrischale mit PBS.
   HINWEIS: Die Enthauptung ist nicht für ältere Mäuse geeignet. Wenn das Experiment mit älteren Mäusen durchgeführt werden muss, sollte die Methode der Euthanasie gemäß den Tierversuchsregeln geändert werden.
7. Halten Sie den Kopf fest am Nasenbereich mit 1 x 2 Zähnen Gewebezange und entfernen Sie die Haut über dem Schädel, bis die Calvaria sichtbar ist.
8. Identifizieren Sie die Nähte (d. h. sagittale, koronare und lambdoide) des Schädels auf der exponierten Calvaria.
9. Mit der Spitze der Mikroschere ca. 2 mm hinter der Lambdoid-Naht durchdringen und einen geraden Schnitt daneben machen.
10. Setzen Sie die Spitze der Mikroschere auf der Rückseite des Schädels ein. Machen Sie einen geraden Schnitt entlang der distalen Seite der Lambdoid-Nähte in Richtung der koronaren Naht. Gehen Sie ähnlich wie bei der anderen Lambdoid-Naht vor.
11. Machen Sie einen weiteren Schnitt (in einem 45°-Winkel), um das Ende des Schnitts mit dem Schnitt des vorderen Fontanels zu verbinden.
12. Wiederholen Sie die Schritte 1.10 und 1.11 mit der anderen Lambdoid-Naht.
    HINWEIS: Es ist wichtig, die Nähte zu identifizieren, um geeignete Schnitte vorzunehmen und in der Lage zu sein, eine angemessene Einbettung und Datenanalyse durchzuführen.
13. Verwenden Sie Feinspitzenzange, um die Calvaria zu entfernen und in eine Petrischale zu legen. Mit einem Skalpell, machen Sie einen geraden Schnitt aus dem hinteren Fontanel entlang der sagittalen Naht durch die koronare Naht und endet in der vorderen Fontanel, um zwei hemi-calvarias zu erhalten.
14. Nehmen Sie jede der Hemi-Calvarias mit der feingekippten Pinzette auf und legen Sie sie in eine neue Petrischale mit PBS.

2. Calvaria-Kultur

1. 1 ml hochglukoses DMEM-Medium, ergänzt mit 0,1% Rinderserumalbumin (BSA) und 1% Antimykotikum (d.h. Penicillin und Streptomycin) in die Brunnen einer 24-Well-Platte geben. Mit feiner Spitzenzange jede Hemi-Calvaria aufnehmen und in einen Brunnen geben.
   HINWEIS: Legen Sie die halbkakonkaven Halbgas nach unten.
2. Inkubieren Sie die Hemi-Calvarien für 24 h bei 37 °C mit 5%_CO2.
3. Entfernen Sie das Kulturmedium aus jedem Brunnen und fügen Sie 1 ml frische Medien hinzu, die die Verbindung enthalten, um Medien aus anderen Zellen zu testen oder konditioniert.
   HINWEIS: Verwenden Sie mindestens drei Hemi-Calvarien für jede Behandlungsgruppe und verwenden Sie negative und positive Kontrollen.
4. Inkubieren Sie die Hemi-Calvarias für 7 Tage, die Medien alle 2-3 Tage wechseln.

3. Kultur mit Krebszellen

1. Wählen Sie eine Petrischale mit Krebszellen bei 80-90% Zusammenfluss und versuchen Sie sie. Zum Trypsinisieren die Krebszellen 1x mit PBS (5 ml pro 75 cm² Kolben) waschen, gefolgt von einer Inkubation in einer HBSS-Lösung, die 0,05% Trypsin und 0,53 mM EDTA (2 ml pro 75 cm² Kolben) enthält.
2. Die Zellsuspension in ein 15 ml konisches Rohr und eine Zentrifuge bei 800 x g für 5 min bei Raumtemperatur (RT) übertragen.
3. Entfernen und entsorgen Sie den Überstand.
4. Das Pellet in 2 ml DMEM mit 2% fetalem Rinderserum (FBS) und 1% Antimykotikum(E) wieder aufhängen. Zählen Sie lebende Zellen.
5. Weisen Sie jeder Studiengruppe Hemi-Calvarien zu (d. h. der Negativkontroll- und Kokulturgruppe für RNA- oder Histologie-Analysen).
6. Entfernen Sie die Kulturmedien aus den Hemi-Calvarias und fügen Sie 1 ml DMEM mit 2% FBS und 1% Antimykotik ergänzt oder nicht mit Krebszellen ergänzt.
   HINWEIS: Die Menge der zellen, die hinzugefügt werden sollen, kann sich je nach getesteter Zelllinie ändern. Bei Krebszellen wie MDA-MB-231 oder PC-3 funktionieren 500.000 Zellen pro Brunnen angemessen.
7. 24 h bei 37 °C mit 5%_CO2inkubieren. Übergeben Sie jede Hemi-Calvaria an einen neuen Brunnen, um nur Krebszellen zu behalten, die am Knochengewebe haften.
8. 7 Tage bei 37 °C mit 5%_CO2 inkubieren und alle 2-3 Tage die Medien wechseln.

4. Fixierung

1. Quadrate aus Tissuepapier schneiden, um die Hemi-Calvarias zu wickeln.
   HINWEIS: Biopsieschaumpads oder Stahlkapseln für kleine Biopsien können ebenfalls verwendet werden.
2. Verwenden Sie gerade Feinspitzenzangen, um jede Hämi-Calvaria aus der sagittalen Naht zu holen, auf ein Tissuepapier zu legen und zu wickeln.
3. Legen Sie die umwickelte Hemi-Calvaria in eine beschriftete Einbettkassette.
4. Legen Sie die Kassette in einen Behälter mit 10% Phosphat-gepuffertem Formalin.
5. Fix für 24 h bei 4 °C.

5. Entkalkung

1. Entfernen Sie das Formalin, fügen Sie 1x PBS hinzu, und rühren Sie das Gewebe für 30 min, um die Hemi-Calvarias zu spülen.
2. Entfernen Sie die PBS und fügen Sie 10% EDTA (pH = 8, 0,34 M).
   HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass die Lösung das Gewebe vollständig abdeckt.
3. Entkalken Sie das Gewebe für 48 h bei 4 °C.
4. Entsorgen Sie die EDTA-Lösung und fügen Sie 1x PBS hinzu, um das Gewebe zu spülen.
5. Bewahren Sie die Hemi-Calvarias in 70% Ethanol bis zur Histologie-Verarbeitung auf.

6. Gewebeverarbeitung

1. Dehydrieren Sie das Gewebe mit Runden von 96% Ethanol, 60 min (3x), gefolgt von 100% Ethanol, 60 min (3x).
2. Ersetzen Sie das Ethanol durch 100% Xylol, 60 min (3x).
3. Inkubieren Sie die Kassetten in Paraffinwachs, 60 min (2x).

7. Einbetten

1. Öffnen Sie die Kassetten, entfernen Sie vorsichtig das Tissuepapier, und packen Sie die Calvaria aus.
2. Nehmen Sie jede Calvaria sorgfältig auf und stapeln Sie alle Hemi-Calvarias aus derselben Gruppe in der gleichen Ausrichtung.
3. Legen Sie etwas Paraffin in eine Form.
4. Nehmen Sie alle Hemi-Calvarias mit den Zangen auf und legen Sie sie in die Form mit der sagittalen Naht hinunter zur Basis der Form.
   ANMERKUNG: Die Ausrichtung der Hemi-Calvarias in der Form während der Aufnahme ist entscheidend, um konsistente histologische Abschnitte und reproduzierbare Ergebnisse zu erhalten, da diese Ausrichtung die hintere Identifizierung der vorderen und parietalen Knochen aus den Calvarias ermöglicht. und die koronare Naht, die die quantitative Bewertung erleichtert.
5. Lassen Sie die Zange und überprüfen Sie, ob die Hemi-Calvarias an Ort und Stelle bleiben.
6. Legen Sie die beschriftete Kassette auf die Form und füllen Sie sie mit mehr Paraffin, um die Hemi-Calvarias abzudecken.
7. Bewegen Sie die Formen auf die kalte Oberfläche.

8. Schnitt

1. Trim 500-600 m der sagittalen Naht mit dem Mikrotome.
2. Schneiden Sie 4 'm dicke Abschnitte, und sammeln Sie die benötigten Abschnitte.
3. Schneiden Sie weitere 300 m.
4. Schneiden und sammeln Sie weitere sechs 4'm dicke Abschnitte.
5. Schneiden Sie den Block 300 m weiter und sammeln Sie weitere Abschnitte.
6. Montieren Sie die Abschnitte auf Glasmikroskop-Dias.
7. Trocknen Sie die Dias bei RT.

9. Färbung

1. Tauchen Sie die Abschnitte in 100% Xylol für 3 min ein.
2. 1 min in 100% Ethanol untertauchen.
3. In 96% Ethanol für 1 min verschmelzen.
4. Tauchen Sie in 80% Ethanol für 1 min ein.
5. 70% Ethanol für 1 min untertauchen.
6. Spülen Sie in Wasser für 3 min.
7. In Hämatoxylin für 3 min untertauchen.
8. Spülen Sie in Wasser, bis der Abschnitt frei ist.
9. 10 Sek. in einer gesättigten Lithiumcarbonatlösung untertauchen.
10. Spülen Sie in Wasser für 3 min.
11. 96% Ethanol für 1 min untertauchen.
12. In Eosin für 3 min untertauchen.
13. Tauchen Sie in 96% Ethanol für 1 min ein.
14. 1 min in 100% Ethanol untertauchen.
15. In 100% Xylol für 3 min untertauchen.
16. Fügen Sie einige pro Montagemedium auf den Schlitten und schützen Sie es mit einem Deckel.
    HINWEIS: Sie können die Hämatoxylin- und Eosinfärbung (H&E) mit tartratresistenter Säurephosphatase (TRAP) Färbe ergänzen, um Osteoklast und Osteolyse zu bewerten.

10. Quantitative Bewertung: Festlegung des Analysebereichs

1. Untersuchen Sie die Abschnitte unter geringer Leistung (d. h. 4x), um die Ausrichtung und die Nähte zu identifizieren.
2. Definieren Sie die koronale Naht und identifizieren Sie die lange Knochenoberfläche auf der einen Seite und die kurze Oberfläche auf der anderen Seite.
3. Identifizieren Sie die koronale Naht unter 40-facher Vergrößerung und bewegen Sie zwei oder drei optische Felder entlang der langen Oberfläche von der Naht weg. Erfassen Sie Bilder dieses Bereichs für die Analyse.
4. Definieren Sie den alten Knochenbereich und den neuen Knochenbereich. Das Eosin Y mit orange G färbt den alten Knochen dunkler und den neuen Knochen heller.
5. Messen Sie die gesamte Knochenfläche des alten und neuen Knochens mit der Image J-Software mit dem Farbschwellenwerkzeug. Geben Sie die Ergebnisse als m²aus.

11. Datenanalyse

1. Analysieren Sie die Ergebnisse mit statistischer Software. Signifikante Unterschiede zwischen den Gruppen können mit geeigneten Tests ermittelt werden (z. B. nichtparametrischer Mann-Whitney U-Test, wie es herel getan wird).

Results

Um die Knochenbildung im kalvarialen Modell zu bewerten, kultivierten wir die Hemi-Calvarien in Medien mit oder ohne 50 g/ml Insulin. Gewebeabschnitte wurden mit H&E vorbereitet und befleckt. Unter diesen Bedingungen zeigte die Histologie, dass die strukturelle Integrität des Kalbknochens erhalten blieb, was die Identifizierung seiner verschiedenen Komponenten ermöglichte (Abbildung 1). Die mit Insulin behandelten Calvarien zeigten eine Zunahme der Knoche...

Discussion

Hier beschreiben wir das Protokoll für ein kalvariales Ex-vivo-Modell zur Bewertung der Knochenbildung oder -resorption und zur Untersuchung der Wechselwirkungen von Krebszellen mit kalvarialen Mausknochen. Die entscheidenden Schritte dieser Technik sind die Zerlegung, Kultur, Einbettung und histomorphometrische Analyse der Calvarias. Während der Zerlegung der Calvarien ist es entscheidend, die Hemi-Calvarien in ein Trapez zu schneiden, da es die Orientierung während der Paraffinaufnahme stark erleichtert. Bei d...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
24-Well-Zellkultur	Corning	CLS3524
24-Well-Nicht-Gewebekultur	Falcon	15705-060
2 mL Kryoflächig	SSI	2341-S0S
Antibiotika-Antimykotikum	Corning	30-004-CI
BSA	Biowest	P6154-100GR
Zentrifugue	Eppendorf	22628188	Zentrifuge 5810R
Deckgläser	Corning	2935-24X50
Cytoseal-Harz	Richard Allen	8310-10
DMSO		D2650-100ML
Dulbecco's Modifikation von Eagles Medium, mit 4,5 g/L Glucose und L-Glutamin, ohne Natriumpyruvat	Corning	10-017-CV
Dulbecco's PBS (10X)	Corning	20-031-CV
Ebedding-Kassetten	Sigma	Z672122-500EA
EDTA	Golden	26400
Embedding Workstation	Thermo Scientific	A81000001
Eosin	Golden	60600
Ethanol absolut	JALMEK	E5325-17P
Fötales Rinderserum	Biowest	BIO-S1650-500
Filter	Corning	CLS431229
Pinzetten und Scheren	LANCETA HG	74165
Formalin gepuffert 10%	Sigma	HT501320
Objektträger 25 x 75 mm	Premiere	9105
Harris's Hämatoxylin	Jalmek	SH025-13
Klingen mit hohem Profil	Thermo Scientific	1001259
Histoquinet	Thermo Scientific	813150	STP 120
Insulin aus der Rinderbauchspeicheldrüse	Sigma	16634
Mikroskop	ZEISS	Axio Scope.A1
Mikrotom	Thermo Scientific	905200	MICROM HM 355S
Mausnahrung, 18% prot, 2018S	Harlan	T.2018S.15
Neubauer	VWR	631-0696
Orange G	Biobasic	OB0674-25G
Paraffin	Paraplast	39601006
Paraffinsektion Flotationsbad	Elektrothermisch	MH8517X1
Petrischale	Corning	CLS430167
Phloxin B	Probiotek	166-02072
Trypan Blau	Sigma	T8154
Trypsin-EDTA	Corning	25-051-CI
Wachsspender	Elektrothermisches	MH8523BX1
Xylol	Golden	534056-500ML