Method Article

Single-Durchsatz ergänzende hochauflösende Analysetechniken für die Charakterisierung von komplexen natürlichen organischen Substanz Mischungen

DOI:

10.3791/59035

⸱

January 7th, 2019

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Environmental Molecular Sciences Laboratory, Pacific Northwest National Laboratory, 2Department of Soil, Water and Environmental Science, University of Arizona, 3Department of Earth Ocean and Atmospheric Sciences, Florida State University, 4Bruker Daltonics Inc., 5Biological Sciences Division, Pacific Northwest National Laboratory

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dieses Protokoll beschreibt einen einzigen Durchsatz für ergänzende analytische und Omics Techniken, die ihren Höhepunkt in einer voll gepaart Charakterisierung von natürlichen organischen Stoffen und mikrobielle Proteomics in verschiedenen Ökosystemen. Dieser Ansatz ermöglicht die robuste Vergleiche zur Identifizierung von Stoffwechselwegen und Transformationen für Treibhausgasproduktion Beschreibung und Vorhersage Reaktionen auf Veränderungen der Umwelt wichtig.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Natürliche organischer Substanz (NOM) besteht aus eine hochkomplexe Mischung aus Tausenden von organischen Verbindungen, die in der Vergangenheit zur Charakterisierung schwierig erwiesen. Jedoch gekoppelt um die thermodynamischen und kinetischen Steuerelemente auf (Kohlendioxid [CO2] und [CH4] Methan) Treibhausgasproduktion infolge der Zersetzung des NOM zu verstehen, eine Charakterisierung molekularer Ebene mit mikrobiellen Proteom-Analyse ist notwendig. Darüber hinaus sollen Klima- und Umweltveränderungen natürlicher Ökosysteme, potenziell stören komplexe Interaktionen, die Einfluss auf die Versorgung mit organischer Substrate und die Mikroorganismen die Transformationen durchführen, lassen. Eine detaillierte molekulare Charakterisierung der organischen Substanz, mikrobielle Proteomics und die Wege und Transformationen, die durch die organischer Substanz zersetzt ist werden die Richtung und das Ausmaß der Auswirkungen von Veränderungen der Umwelt vorherzusagen. Dieser Artikel beschreibt einen methodischen Durchsatz für umfassende Metabolit Charakterisierung in einer einzigen Probe durch direkte Injektion Fourier Transform Ion Zyklotron Resonanz Massenspektrometrie (FTICR-MS), Gaschromatographie-Massenspektrometrie (GC-MS) Kernresonanzspektroskopie (NMR), Flüssigchromatographie-Massenspektrometrie (LC-MS) und Proteomics Analysen. Das Ergebnis ist ein vollständig gepaart Dataset, das verbessert die statistische Zuverlässigkeit für Wege der Abbau organischer Materie, die sich daraus ergebenden CO2 und CH4 Produktionsraten und ihre Antworten auf ökologische Störung ableiten. Hier präsentieren wir die Ergebnisse der Anwendung dieser Methode auf NOM Proben aus Mooren; das Protokoll ist jedoch für jede NOM-Probe (z. B. Torf, bewaldeten Böden, marinen Sedimenten, etc.).

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Weltweit sind Feuchtgebiete schätzungsweise 529 Pg Kohlenstoff (C), enthalten meist als organischen C in Torf Einlagen1begraben. Derzeit wirken solche Mooren als Netto C Senke, Sequestrierung 29 Tg C y-1 in Nordamerika allein1. Jedoch kann ökologische Störungen wie Entwässerung, Brände, Dürre und wärmeren Temperaturen diese C-Senke durch Erhöhung der Abbau organischer Materie, was zu erhöhten C Verluste über Treibhausgas aufgehoben (Kohlendioxid [CO2] und [CH-4] Methan) Produktion1,2. Klimawandel kann zu C beitragen, wenn....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

(1) sequentielle Extraktion der organischen Substanz aus Boden, Sediment oder Torf

  1. Sammeln Sie Boden, Sedimente oder Torf über Kernbohrungen und teilen Sie Kerne nach der Hypothese getestet (z.B. Tiefe). Shop-Proben im Polytetrafluorethylen beschichtet Container und Einfrieren bei-80 ° C Lagerung vor der Analyse.
    Hinweis: Ca. 25 mg C ist für dieses Protokoll benötigt. Für Torf (in der Regel 45 % C) ist 50 mg von getrockneten Torf erforderlich. Größere Probenmengen können für niedrigen organischen Proben erforderlich sein, wie Mineral- oder bewaldete Hochland Böden je nach dem C (bis zu 5 g) Inhalt. Da Extraktion mit organischen Lösungsmi....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wir die beschriebenen ergänzenden Analyse-Protokoll durchgeführt und verglichen Torf mit Tiefe im S1 Moor in der Fichte und Mooren Antwort unter wechselnden Umgebungen (Fichte) Website in Minnesota, USA. Diese Ergebnisse sind im Vergleich zu denen aus dem Permafrost Moor und Fen aus Nordschweden zu zeigen, wie Websites in Metaboliten und Enzym-Aktivitäten variieren können. Wir identifizierten 3.312 Enzyme in der Proteomik-Analyse. Eine Analyse der Aktivitäten der Enzyme mit Tiefe zeigt, dass die Anzahl der Enzyme scharf .......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Der Single-Durchsatz bietet voll-gekoppelte Analyse Bach Metaboliten und das Proteom zu charakterisieren Einblicke in die Wege, durch welche, die c Radfahren in ein komplexes Ökosystem stattfindet. Boden und Torf sind heterogene Matrizen, und daher einer der kritischen Schritte dieser Methode tritt in die ersten Schritte um sicherzustellen, dass der Start Torf oder Bodenmaterial sehr homogen ist. Es empfiehlt sich, die Probe Schleifen sowie Aggregate Extraktionseffizienz reduzieren können. Dies ist ein besonderes Problem.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wir möchten J.P. Chanton, j.e. Kostka und M.M. Kolton danken für Unterstützung mit Torf Proben. Teile dieser Arbeit wurden an den molekularen Wissenschaften Umweltlabor, eine DOE Büro der Wissenschaft Benutzer Einrichtung vom Büro des biologischen und Umweltforschung durchgeführt. Battelle für DOE unter Vertrag DE AC05 76RL01830 PNNL gesteuert. Diese Arbeit wurde vom U.S. Department of Energy, Office of Science und Büro der biologische und ökologische Forschung unterstützt (gewährt: DE-AC05-00OR22725, DE-SC0004632, DESC0010580, DE SC0012088 und DE-SC0014416).

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
MethoxyaminhydrochloridSigma Aldrich226904Ableitungsmittel
5 mm Dreifachresonanz salztolerante KältesondeBrukerInstrumentierung
Kapillare GC-Säule HP-5MS Säule (30 m & mal 0,25 mm - mal 0,25 mm / mu; m)AgilentAG19091S-433Instrumentierung
Umkehrphasengeladene Oberflächen-Hybridsäule (3,0 mm > 150 mm > 1,7 μ m Partikelgröße)ThermoFisherInstrumentierung
2 mL GlasfläschchenVWR International46610-722Probenfläschchen
Autosampler-FläschchenVWR International97055-324; 9467671Probenfläschchen
ChloroformVWR InternationalJT9174-3Lösungsmittel
EthanolVWR InternationalBDH67002.400Lösungsmittel
MethanolVWR InternationalBDH85681.400Lösungsmittel
PyridinVWR InternationalBDH67007.400Lösungsmittel
2,2-Dimethyl-2-silapentan-5-sulfonat-d6Sigma Aldrich178837Standard
C8-C24 FettsäuremethylesterSigma AldrichCRM18918Standard
N-Methyl-N- (trimethylsilyl)trifluoracetamidSigma Aldrich24589-78-4Standard
Suwanee River Fulvo Acid StandardInternational Humic Substances Society2S101FStandard
TrimethylchlorsilanSigma Aldrich89595Standard
Tuning SolutionAgilent
FTICR-MS AnalysesoftwareBrukerCompass DataAnalysis 4.1
Formularity SoftwarePacific Northwest National LaboratoryFormularityzum Download verfügbar unter: https://omics.pnl.gov/software/formularity
GC-MSAgilentAgilent GC 7890A mit MSD 5975C
Sorptionsmittel auf SiliziumdioxidbasisPhenomenex (Torrance, CA)Strata C18-E (PN 8E-S001-DAK)
NMR-RÖHRCHEN 3MM 8 150 CS5VWRInternational KT897820-0008NMR-Röhrchen
Varian 600-MHz NMR-Spektrometer mit DirektantriebVarian InovaNMR-Spektrometermit Direktantrieb 600 MHz
Chenomx NMR Suite 8.3ChenomxChenomx NMR SuiteNMR-Software
Ultra-Performance-FlüssigkeitschromatographGewässerAquity UPLC H Flüssig-Chromatograph 
Velos-ETD Orbitrap Massenspektrometer ThermoFisherThermo Scientific LTQ Orbitrap VelosMassenspektrometer 
Varian

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Bridgham, S. D., Megonigal, P. J., Keller, J. K., Bliss, N. B., Trettin, C. The carbon balance of North American wetlands. Wetlands. 26 (4), 889-916 (2006).
  2. Wilson, R. M., et al. Greenhouse gas balance over thaw-freeze cycles in discontinuous zone per....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Natural Organic MatterFTICR MS AnalysisGC MS AnalysisNMR SpectroscopyLC MS AnalysisProteomics AnalysisSequential ExtractionMPLEx ExtractionMetabolite CharacterizationPeatland Samples

Related Articles