Eine einfache Migration/Invasion Workflow mit einer automatisierten Leben-Zelle-Imager

Summary

Das aktuelle Protokoll beschreibt eine integrierte Methode untersucht Krebs Zelle Migration und Invasion auf einer einzigen Plattform in Echtzeit und bietet eine leicht reproduzierbare und zeitsparende Option Zelle Mobilität und Morphologie.

Abstract

Krebs Zelle Mobilität ist entscheidend für die Einleitung von Metastasen. Daher ist der Zellbewegung und -invasive Untersuchung von großer Bedeutung. Migration-Assays bieten grundlegende Einsicht der Zellbewegung 2D Ebene, während Invasion Assays imitiert in-vivo Krebs Zelle Dislodgment von der ursprünglichen Website und Invasion durch die extrazelluläre Matrix mehr physiologisch relevant sind. Das aktuelle Protokoll sieht einen einheitlichen Workflow für Migration und Invasion Assays. Zusammen mit der integrierten automatischen mikroskopische Kamera für HD-Bilder in Echtzeit und integrierte Analyse-Modul gibt es Forscher eine zeitsparende, einfache und reproduzierbare experimentelle Option. Dieses Protokoll enthält auch Ersetzungen für Verbrauchsmaterialien und alternativen Analysemethoden für Benutzer zur Auswahl.

Introduction

Zelle Migration und Invasion sind wichtige biologische Prozesse, die normale Funktionen im menschlichen Körper, wie z. B. Wundverschluss, Invasion der Plazenta in der Gebärmutter und Brustdrüse Morphogenese^1,2,3zu ermöglichen. Der menschliche Körper hat präzise und strenge Kontrolle dieser biologischen Ereignisse; Es gibt jedoch einige Ausnahmen. Bösartige Tumore können zum Beispiel dieses Sicherheitsmerkmal zu entgehen, weisen abnorme Proliferation und dringen in benachbarte Gewebe, die Metastasen genannt wird. Metastasierung ist die Hauptursache von Krebs-in Verbindung stehenden Sterblichkeit⁴.

Brustkrebs ist die am häufigsten diagnostizierte Krebserkrankung bei Frauen, und ist die zweithöchste Todesursache krebsbedingte Todesursache bei Frauen in Industrieländern weltweit⁵. Brustkrebs stammt aus Leitungen oder Läppchen, die aus einer oder mehreren Schichten von epithelialen Zellen bestehen. In der normalen Brust halten Epithelzellen untereinander und der Basalmembran durch Membranproteine wie z. B. E-Cadherin und Integrine⁶. Jedoch invasiven Brustkrebs-Zellen ihre Polarität und Zell-Zell-Adhäsion, verloren haben und klassisch epitheliale mesenchymale Transition (EMT) zu unterziehen und die Fähigkeit erlangen, bewegen. Nach Paravasation diese Zellen bewegen sich über die extrazelluläre Matrix (ECM) und das Blutgefäß oder das lymphatische System, dann folgten Intravasation und metastasiertem Wachstum⁷eingeben. Das Verständnis der Mechanismen, mit denen dies geschieht, ist von großer Bedeutung, da Metastasen die häufigste Ursache von Krebs-in Verbindung stehenden Todesfälle ist und eng mit Krebs verwandt ist Zelle Migration/Invasion. Um die Bewegung von Krebszellen zu visualisieren, sind Migration und Invasion Assays ideale Modelle für 2D und 3D Zellbewegung, bzw. studieren. Migration wird die Bewegung der Zellen direkt beurteilt, Invasion erfordert Interaktion mit der Mikroumgebung und die Fähigkeit, biologische Barrieren abbauen. Die zwei Prozesse sind nicht völlig unabhängig voneinander, wie Migration eine Anforderung der Invasion ist.

Verschiedene Methoden wurden entwickelt, um Migration und Invasion zu studieren. Wie von Kramer Et Al., Migration-Assays wie Wundheilung, überprüft Zaun und Mikro-Träger Assays generieren eine zellfreien Gegend um Zellen bezogen, Bewertung der Änderung des Bereichs zu ermöglichen; in der Erwägung, dass Transwell und Kapillare Assays auf die Anzahl der Zellen basieren, die auf einem Lockstoff⁸zu bewegen. Für Invasion Assays, eine ECM-Umgebung hat zum Beispiel mit ECM Gel oder Kollagen eingerichtet werden, und 3D Bewegung beurteilt werden kann, durch die Überwachung der Invasion Fläche, Distanz und Zelle zählt (z.B. Transwell Assay, Schnabeltiere Assay)⁸. Eine andere Art von Invasion Assay ist die Kombination der invasiven Zellen mit nicht-invasiven Zellen und beurteilen das Verhalten der invasiven Zellen (z. B. Sphäroid assays). Die oben genannten Methoden haben ihre vor und Nachteile und eine Weise, die leicht zugänglich, leicht zu wiederholen, und kombinieren Sie die Migration-Assay und Invasion-Assay in einem ähnlichen Workflow ist bevorzugt im experimentellen Design.

Dieses Protokoll beschreibt die Messung der Zelle Migration und Invasion mit einer live-Cell-Imager. Es ist eine Echtzeit-Zelle Überwachungssystem installiert in einem Inkubator Standardzelle Kultur. High-Definition-Bilder entsprechend den eingestellten Intervalle und Messungen durch die Anwendung geeigneter Masken der Zellen und fluoreszierende Vorgaben Scannen dauert. Das Modul der Migration/Invasion Assay umfasst mit einem 96-poligen Scratch Tool, welches zur Herstellung von homogenerer Kratzer Wunden auf eine Zelle monomolekularen Film in eine 96-Well-Platte eignet. Der Mechanismus basiert auf in-vitro-Wunde heilen Assays, Überwachung 2D Zellbewegung auf einem Kunststoff oder beschichtete Oberfläche. Invasion oder 3D Bewegung über eine zusätzliche ECM innerhalb der Kratzer, die Wunde kann auch beurteilt werden. Ein kurze Workflow ist in Abbildung 1dargestellt.

Protocol

Hinweis: Zwei Zelllinien sollte gesondert behandelt werden. Die folgenden Verfahren sollten auf eine einzelne Zelle Zeile angewendet werden, wenn nicht angegeben.

1. Optimierung der Zelldichte vor Verwundung

1. Adhärente Zellen in T75 cm² Gewebe Kulturflaschen auf ca. 80 % Kultur Zusammenfluss in Phenol-rot frei Dulbecco geändert Eagle Medium (DMEM) mit 10 % fetalen bovine Serum (FBS), 200 mM L-Glutamin und 2 µg/mL Insulin bei 37 ° C mit 5 % CO₂ (ergänzt "Standard Inkubationsbedingungen für die meisten Krebszelllinien, Kultur Formulierungen sind Zelle Zeile-abhängig).
2. Entfernen der Nährmedien pipettieren Sie in einen Abfallbehälter. Pipettieren 2 mL vorgewärmten 0,1 % Trypsin-EDTA kurz Cell Monolayer und Pipettieren abzuspülen. Fügen Sie ein weiteres 2 mL 0,1 % Trypsin-EDTA und legen Sie die Flasche unter standard Inkubationsbedingungen bei 37 ° C für 5 min.
3. Klopfen Sie leicht den Kolben um Loslösung der Zellen zu gewährleisten und dann 10 mL vorgewärmten Kulturmedien, die proteolytische Reaktion zu stoppen.
4. Übertragen Sie die Zellsuspension in eine 15 mL Zentrifugenröhrchen und Spin-down bei 200 X g für 5 min bei Raumtemperatur (RT). Sorgfältig entfernen, des Überstands ohne Rühren die Zelle Pellet und erneut mit einem anderen 10 mL vorgewärmten Nährmedien.

2. zählen Zelle mit einem automatisierten Zelle Zähler (oder zählen Methoden)

1. Verdünnte 200 µL resuspendierte Zellsuspension mit 800 µL 1 x Dulbeccos Phosphat gepuffert Kochsalzlösung (DPBS) in einer 1,5 mL Zentrifugenröhrchen.
2. Der Zelle-Zähler beimessen Sie einen 60 µm Zelle Graf Sensor, halten Sie die ein/aus und Zusammenführen Sie die Spitze in der Zellsuspension. Lassen Sie langsam den Knebel bis die Zellsuspension erfolgreich in den Sensor gezogen wird. Zellkonzentration erscheint in Zellen/mL.
3. Berechnen Sie die Anzahl von Zellen in der 10 mL Zellsuspension.

(3) Cell Plating

1. Platte Zellen in einem Bereich von Zelldichten (40.000-90.000 Zellen/Na) in dreifacher Ausfertigung in einer 96-Well-Platte.
2. Legen Sie die Platte in den live-Cell-Imager, und planen Sie scannen alle 2 h für 24 h.
   1. Klicken Sie in der Software auf Zeitplan scannt der Aufgabenliste. Bestimmen Sie im Bereich Schublade Setup die Position der Platte, klicken Sie auf Add Schiff und wählen Sie den Teller. Im Bereich Scannen Setup wählen oder Scanmuster gemäss den experimentellen Platte-Einstellungen bearbeiten und Scan-Typ als Standardfestlegen.
   2. Rechtsklick auf der Zeitachse und wählen Sie Intervalle festgelegt. 2 h bei einem 24-h-Zeitplan Scannt jeden hinzufügen soll. Klicken Sie auf anwenden.

4. bestimmen Sie die optimale Zelle Aussaat Dichte für die Migration-Assay

1. StOp Scannen nach 24 h, Anwenden des Zusammenflusses Verarbeitung Analyse-Tool auf die HD-Phase Kontrast Bilder automatisch erfasste, und erzeugen eine Zelle Verbreitung Kurve gegen die Zeit.
   1. Bestimmen Sie 3-6 repräsentative Bilder und legen Sie sie in eine neue Bildersammlung.
   2. Eine richtige Maske als Verarbeitung Definitionzu bestimmen.
   3. Einen Analyse-Auftrag zu starten.
   4. Optimierte Zelldichte nach Zusammenfluss gegen die Zeit zu bestimmen (ca. 100 % Zusammenfluss innerhalb von 6-18 h je nachdem, wann die Migration-Assay beginnt).
      Hinweis: Zeit, die es braucht, um die Zellen zu Confluence wachsen variiert je nach der Aussaat Verdünnung.

(5) Tage 1 und 2: Vorbereitung auf die Migration und Invasion Assays

1. An Tag1 Mantel der Platte für Invasion-Assay.
   Hinweis: ECM Gel sollte immer behandelt werden, auf Eis und mit Spitzen, die über Nacht in den Kühlschrank gelegt haben.
   1. ECM-Gel mit eiskalten Nährmedien bis 100 µg/mL zu verdünnen und 50 µL verdünnter ECM Gel/Medien in dafür vorgesehenen Vertiefungen hinzufügen.
   2. Ort der Platte am standard Inkubationsbedingungen Übernachtung.
2. Am 2. Tag aspirieren Sie vorsichtig die überschüssige Medien. Zellen mit optimierter Zelldichten in 2 96-Well-Platten für die Migration-Assay (unlackiert) bezeichnet und die Invasion-Assay (beschichtet) in Triplicates nach Ziffern 1-3 am späten Nachmittag (in das aktuelle Protokoll, optimierte seeding dichten für Teller ZR75-1 und MDA-MB-231 waren 90.000/gut und 50.000/gut, beziehungsweise).
3. Legen Sie über Nacht im standard Inkubationsbedingungen Platten.

6. Tag 3: Wunde kratzen

1. Sprühen Sie und wischen Sie das Kratzen Werkzeug und 2 Boote mit 70 % Ethanol waschen, bevor diese in die Biosicherheit Schrank platziert. Füllen Sie das Waschen Boot 1 und 2 bzw. mit genau 45 mL steril (autoklaviert) destilliertes Wasser und 70 % Ethanol.
2. Legen Sie für die Sterilisation kratzen Werkzeug Stimmstock (oben) auf Boot 1 und 2 für 5 min waschen.
3. Beginnen Sie mit der Migration-Assay-Platte.
   1. Bewegen Sie die Platte mit Zellen aus dem Inkubator und sicherstellen Sie, dass keine Brunnen trocken zur Beschädigung des Werkzeugs Kratzer zu vermeiden ist. Entfernen Sie die Abdeckung der Platte legen Sie in der Grundplatte Inhaber des Werkzeugs kratzen und legen Sie das Oberteil auf das Unterteil vorsichtig durch die Führung der Dübel. Drücken Sie und halten Sie den schwarzen Hebel, und inzwischen heben Sie vorsichtig den Stimmstock. Lücken in jede Vertiefung sind meist mit bloßem Auge und unter dem Mikroskop sichtbar.
   2. Schnell die Stifte im Wasser einweichen; Dies ist ausreichend zu reinigen das Kratzen Werkzeug vor die Invasion-Assay-Platte zu kratzen, wenn Platte Setup identisch ist. Andernfalls wiederholen Sie den Sterilisation mit sterilem destilliertem Wasser und dann mit 70 % igem Ethanol für 5 Minuten.
4. Waschen Blätter der Platte 1 oder 2 Mal mit vorgewärmten Nährmedien, freistehende Zellen oder Zellen zu vermeiden Wiederanbringen zum Brunnen.
5. Fügen Sie 100 µL der frischen warmen Medien in dafür vorgesehenen Vertiefungen mit oder ohne Behandlung.
6. Zusätzliche Schritte für Invasion Assay.
   1. Platzieren Sie die Invasion-Assay-Platte bei 4 ° C für 5 min zu equilibrate und aspirieren Sie sorgfältig die kalten Medien.
   2. ECM-Gel mit eiskalten Nährmedien bis 5 mg/mL zu verdünnen, 50 µL verdünnter ECM Gel in dafür vorgesehenen Vertiefungen hinzufügen und unter standard Inkubation für 30 min statt.
   3. Fügen Sie 100 µL der erwärmten Medien mit oder ohne Prüfung Verbindungen hinzu.
7. Die Platte in live-Cell-Imager und lassen Sie es für 5 min. Wählen Sie Schiffstyp als Imagelock Platte equilibrate. Scan-Typ als Wunde kratzenfestlegen Sie, wählen Sie oder bearbeiten Sie Scan Pattern nach der experimentellen Platte-Setup (1 Bild/gut und breit-Modus) und planen Sie, 24-h wiederholen scannen alle 1-2 h 72 h bis die Wunden verheilt sind.
8. Um das Kratzen Werkzeug zu reinigen, setzen die oberen Stimmstock in jedem der folgenden Lösungen (45 mL in Wasch-Boote) für 5 min.: 0,5 % Waschmittel 1 (siehe Tabelle der Materialien), 1 % Waschmittel 2 (siehe Tabelle der Materialien), sterilem destilliertem Wasser und 70 % Ethanol. Legen Sie das Kratzen Werkzeug wieder auf die Bodenplatte und Store in einer staubfreien Umgebung.

7. die Datenanalyse

1. Scannen der dafür vorgesehenen Platte, nachdem die Wunden verheilt sind, indem die experimentelle Platte auf die Schublade Setup auswählen und auf Entfernen Schiffzu stoppen.
2. Sammeln Sie 3 bis 6 repräsentative Bilder umfassen eine Reihe von soliden Prozentsätze, einschließlich Bilder rechts, nachdem die Wunde erfolgter Schließung gewickelt um 10 % und 50 %.
3. Verwenden Sie Segmentierung, Bereinigung und Filter um festzustellen, eine ordnungsgemäße Verarbeitung Definition entsprechenden Scratch Wunde Maske und Confluence Maskeanwenden. Verwenden Sie Vorschau Strom/All , um die Genauigkeit der Masken anzuzeigen.
4. Starten Sie die Analyse-Auftrag.
5. Daten können für weitere Analysen exportiert oder innerhalb der Software analysiert werden. Drei Kennzahlen der Software können verwendet werden, um HD-Phasenbilder bewerten: Wunde Breite (µm), Wunde Zusammenfluss (%) und relative Wunde Dichte (%). Vergleiche werden im folgenden Abschnitt besprochen.

Results

Diese Migration/Invasion Assay basiert auf die heilende Wunde-Assay, wertet die Rate der Zellen in einem zellfreien Bereich durch die Kratzer 96-Pin-Werkzeug erstellt. Der Unterschied zwischen Migration und Invasion Assays sind, dass Migration Maßnahme Zellen verschieben auf die Gewebekultur behandelt Kunststoff Oberfläche und Invasion Maßnahmen Zellen bewegen über ECM Gel Proben.

Die Scratch Tool dient zur konsequenten kratzen ...

Discussion

Migration und Invasion sind wichtige Parameter für die Mobilität von Krebszellen zu beurteilen. Mithilfe von 96-poligen Scratch Tool ist es möglich, Wundheilung Assays in 2D und 3D gleichzeitig durchzuführen. Automatisches Scannen zu erleichtern, bietet eine stabile Zelle Kultur Umgebung mit minimaler Unterbrechung der Scratch Test durchgeführt mit dem 96-poligen Scratch Tool bietet neben konsequenten kratzen Wunden, ermöglicht Experimente, die robuster sind und reproduzierbar sind. 96-Well-Plattenformat bietet zusätzlic...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
0,5 % Trypsin-EDTA-Lösung (10x)	ThermoFisher Scientific	30028-02	Auf 2x verdünnen in DPBS
Countess II FL Automatisierter Zellzähler	ThermoFisher Scientific	AMQAX1000	Automatisierter Zellzähler
Detergent 1 (Alconox)	Sigma-Aldrich	242985	0,5 % Arbeitskonzentration
Detergent 2 (Virkon S)	VetProduct DIRECT		1 % Arbeitstemperatur Konzentration
Dulbecco' s Modifiziertes Eagle Medium, kein Phenolrot	ThermoFisher Scientific	21063-045	Ergänzt mit 10% FBS, 200 mM L-Glutamin, 2 μ g/ml Insulin
ECM Gel (Matrigel)	Sigma-Aldrich	E6909	Wachstumsfaktor-reduziert, phenolrotfrei
Essen ImageLock 96-Well-Platte, flacher Boden	Essen	4379
EVE Objektträger BioTools		EVS-50
Fötales Rinderserum (FBS)	Bovogen Biologicals	SFBS-F-500ml
IncuCyte 96-Well-Scratch-Wundzellinvasion Zubehör	Essen	4444	Inklusive CoolBox, 2x CoolSink
IncuCyte Zellmigrationskit	Essen	4493	Inklusive dem 96-Well-Pin-Block, 2x Waschschiffchen und der Software
IncuCyte ZOOM	Essen		Lebendzellanalysesystem
Insulinlösung human	Sigma-Aldrich	19278-5ML
L-Glutaminlösung (100x)	ThermoFisher Scientific	25030-091
Gewebekulturkolben, 75 cm2 Wachstumsbereich	Greiner Bio-One	658175