Die hier vorgestellte Protokoll ermöglicht Charakterisierung von homing Lungenkapazität von primären menschlichen Lymphozyten unter in-vivo entzündlichen Erkrankungen. Pulmonale Infiltration der adoptively übertragenen menschlichen Immunzellen in einem Mausmodell der allergische Entzündung kann abgebildet und durch Licht-Blatt Fluoreszenzmikroskopie von chemisch ausgeglichenen Lungengewebe quantifiziert werden.
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Methodenartikel
Erweiterte Bildgebung der Lunge Homing menschlichen Lymphozyten in einem experimentellen In Vivo Modell der allergische Entzündung basierend auf Licht-Blatt Mikroskopie
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Überwältigend Gewebe Ansammlung von hoch aktivierten Immunzellen ist ein Markenzeichen der verschiedenen chronischen Entzündungskrankheiten und erwies sich als ein attraktives therapeutische Ziel in die klinische Behandlung der betroffenen Patienten. Um Strategien zur therapeutischen Regulierung der pathologisch unausgewogen Gewebe eindringen von Pro-inflammatorischen Immunzellen weiter zu optimieren, wird es von besonderer Bedeutung für bessere Einblicke in Krankheit und organspezifischen zu erreichen sein. Homing Eigenschaften des peripheren Lymphozyten. Die hier beschriebenen experimentelle Protokoll ermöglicht, um Lunge Anhäufung von Eindringmittel beschriftet und adoptively übertragenen menschlichen Lymphozyten im Zusammenhang mit Papain-induzierten Lungenentzündung zu überwachen. Die jetzt eingeführte in-vivo-Einstellung berücksichtigt im Gegensatz zum standard in-vitro-Untersuchungen häufig verwendet für die Analyse der Immunzelle Migration und Chemotaxis Lunge-spezifische Aspekte der Gewebe-Organisation und der Einfluss des Komplexes entzündliche Szenario in murinen Lebewesen stattfindet. Darüber hinaus dreidimensionale Cross-sectional Licht-Blatt Fluoreszenz mikroskopische Bildgebung bietet nicht nur quantitative Daten an Immunzellen zu infiltrieren, sondern zeigt auch das Muster der Immunzelle Lokalisierung innerhalb der entzündeten Lunge. Insgesamt sind wir in der Lage, eine innovative Technik von hohem Wert für die immunologische Forschung auf dem Gebiet der chronisch entzündlichen Lungenerkrankungen, einzuführen, die leicht anhand der zur Verfügung gestellten schrittweise Protokoll angewendet werden können.
Einleitung
Klassische entzündliche Erkrankungen der Lunge, wie allergisches Asthma und chronisch obstruktive Lungenerkrankung (COPD) sind bekannt durch eine verstärkte Rekrutierung von aktivierten Lymphozyten in der pulmonalen Gewebe1,2getrieben werden. Lymphozyten freigegeben Zytokine (z.B. IL-4, IL-5, IL-9, IL-13, IFN-γ und TNF-α) fördern Chemotaxis von angeborenen und der adaptiven Immunzellen, induzieren fibrotische Atemwege Umbau oder direkt schädigen die Lunge Parenchym2. Bisher sind verantwortlich für die pathologische Ansammlung von Lymphozyten im Lungengewebe zugrunde liegenden Mechanisme....
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Protokoll
Experimente mit Tieren wurden gemäß Protokollen genehmigt von den zuständigen örtlichen Behörden in Erlangen (Regierung von Unterfranken, Würzburg, Deutschland) durchgeführt. Mäuse wurden unter bestimmten Pathogen-freies Bedingungen untergebracht. Die Sammlung von menschlichem Blut wurde durch die lokale Ethikkommission und der institutionellen Review Board der Universität Erlangen-Nürnberg genehmigt. Jeder Patient hat schriftliche Einwilligungserklärung.
1. allergische Lungenentzündung bei Mäusen zu induzieren.
Hinweis: Wie in früheren Studien27beschrieben, das folgende exp....
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Ergebnisse
Die vorgestellte Protokoll beschreibt einen experimentellen Mausmodell, die Überwachung und Quantifizierung der Ansammlung von adoptively übertragenen menschlichen T-Lymphozyten in der Lunge über Licht-Blatt Fluoreszenz-Mikroskopie ermöglicht. Abbildung 1 A stellt eine schematische Übersicht über die in-vivo Schritte des experimentellen Zeitplans. Um zuverlässige Ergebnisse zu garantieren, es ist von wesentlicher Bedeutung, um eine gute Qualität von der isolierten und Gewebe.......
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Diskussion
Die hier beschriebenen experimentellen Einstellung bietet die Möglichkeit, homing Lungenkapazität von primären menschlichen Immunzellen unter in-vivo entzündlichen Erkrankungen und damit einschlägig ergänzt klassisch überwachen in-vitro-Adhäsion und Chemotaxis durchgeführt Assays. Um die Berücksichtigung der spezifischen anatomischen Organ Merkmale der Lunge zu berücksichtigen, haben wir wichtige Aspekte der Immunzelle homing (einschließlich Chemotaxis und Zelle Verteilung in das Zielorgan) s.......
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Offenlegungen
M.f. Neurath diente als Berater für Pentax, Giuliani, MSD, Abbvie, Janssen, Takeda und Boehringer. Die übrigen Autoren geben keinen Konflikt.
Danksagungen
Die Autoren erkennen dankbar, Förderung durch die DFG Collaborative Research Centers SFB 1181 und TRR 241. Die Optical Imaging Zentrum Erlangen (Hauptsitz) und in bestimmten Ralf Palmisano, Philipp Tripal und Tina Fraaß (Projekt Z2 der DFG SFB 1181) sind anerkannt für kompetente technische Unterstützung für die Licht-Blatt Fluoreszenz mikroskopische Bildgebung.
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| Agarose NEEO Ultra | Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Deutschland | 2267.4 | |
| AlexaFlour594 Anti-Human-CD45-Antikörper | BioLegend, San Diego, USA | 304060 | |
| Ammoniumchlorid | Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Deutschland | K2981 | |
| Kanüle 21 G | Becton, Dickinson and Company, Franklin Lakes, USA | 301300 | |
| Zellproliferationsfarbstoff eflour670 | eBioscience Inc., San Diego, USA | 65-0840-85 | |
| CD4 MicroBeads, human | Miltenyi Biotech GmbH, Bergisch-Gladbach, Deutschland | 130-045-101 | |
| EDTA (Ethylendiamintetraessigsäure) | Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Deutschland | 8043.1 | |
| Kalium-EDTA Blutentnahmeröhrchen, 9 mL | Sarstedt AG & Co., Nü mbrecht, Deutschland | 21066001 | |
| Ethly cinnamat (ECi) | Sigma-Aldrich, Steinheim, Deutschland | 112372-100G | |
| Ethanol ≥ 99,5% (EtOH) | Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Deutschland | 5054,3 | |
| FBS (fötales Rinderserum) Good Forte | PAN-Biotech GmbH, Aidenbach, Deutschland | P40-47500 | |
| Filter 100 µ M | VWR International Germany GmbH, Darmstadt, Deutschland | 732-2758 | |
| Imaris Bildanalysesoftware 9.0.2 | Bitplane AG, Zürich, Schweiz | n.a.ImspectorPro | |
| software | Abberior Instruments GmbH, Gö ttingen, Deutschland | n.a.Ketamin | |
| Inresa Arzneimittel GmbH, Freiburg, Deutschland | 3617KET-V | ||
| LaVision UltraMicroscope II | LaVision BioTec GmbH, Bielefeld, Deutschland | n.a.MACS | |
| MultiStand | Miltenyi Biotech GmbH, Bergisch-Gladbach, Deutschland | 130-042-303 | |
| Multifly Kanüle 20 G | Sarstedt AG & Co., Nü mbrecht, Deutschland | 851638035 | |
| 30 G Nadel | B. Braun Melsungen AG, Melsungen, Hessen, Deutschland | 9161502 | |
| Neubauer Zählkammer | neoLab Migge GmbH, Heidelberg, Deutschland | C-1003 | |
| Pattex Glue | Henkel AG & Co, Dü sseldorf, Deutschland | PSK1C | |
| LS Säule | Miltenyi Biotech GmbH, Bergisch-Gladbach, Deutschland | 130-042-401 | |
| Lymphozytentrennmedien (Dichte 1.077 g/ml) | anprotec | AC-AF-0018 | |
| Papain | Merck | 1.071.440.025 | |
| PBS Dulbecco (phosphatgepufferte Kochsalzlösung) | Biochrom GmbH, Berlin, Deutschland | L182-10 | |
| PerCP/Cy5.5 Anti-Human-CD4 | BioLegend, San Diego, USA | 317428 | |
| PerCP/Cy5.5 Maus IgG2b, κ Isotyp Ctrl | BioLegend, San Diego, USA | 400337 | |
| PFA (Paraformaldehyd) | Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Deutschland | 0335.1 | |
| Kaliumhydrogencarbonat | Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Deutschland | P7481 | |
| Serologische Pipette 10 mL | Sarstedt AG & Co., Nü mbrecht, Deutschland | 86.1254.001 | |
| Spritze 1 mL | B. Braun Melsungen AG, Melsungen, Hessen, Deutschland | 9166017V | |
| Spritze 5 mL | Becton, Dickinson and Company, Franklin Lakes, USA | 260067 | |
| Spritze 20 mL | Becton, Dickinson and Company, Franklin Lakes, USA | 260069 | |
| Sonde 1,5 mL | Sarstedt AG & Co., Nü mbrecht, Deutschland | 72.706.400 | |
| Röhrchen 2 mL | Sarstedt AG & Co., Nü mbrecht, Deutschland | 72.695.400 | |
| Röhrchen 2 mL, braun | Sarstedt AG & Co., Nü mbrecht, Deutschland | 72.695.001 | |
| Röhrchen 15 mL | Sarstedt AG & Co., Nü mbrecht, Deutschland | 62.554.502 | |
| Röhrchen 50 mL | Sarstedt AG & Co., Nü mbrecht, Deutschland | 62.547.254 | |
| QuadroMACS Separator | Miltenyi Biotech GmbH, Bergisch-Gladbach, Deutschland | 130-090-976 | |
| Xylazin (Rompun 2%) | Bayer Vital GmbH, Leverkusen, Deutschland | KPOBD32 |
Referenzen
- Medoff, B. D., Thomas, S. Y., Luster, A. D. T cell trafficking in allergic asthma: the ins and outs. Annual Review of Immunology. 26, 205-232 (2008).
- Baraldo, S., Lokar Oliani, K., Turato, G., Zuin, R., Saetta, M. The Role of Lymphocytes in the Pathogenesis of Asthma ....
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Nachdrucke und Genehmigungen
