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Methodenartikel

Erweiterte Bildgebung der Lunge Homing menschlichen Lymphozyten in einem experimentellen In Vivo Modell der allergische Entzündung basierend auf Licht-Blatt Mikroskopie

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DOI:

10.3791/59043

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16. April 2019

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1Department of Medicine 1, University Hospital of Erlangen, 2Department of Medicine 3, University Hospital of Erlangen

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Die hier vorgestellte Protokoll ermöglicht Charakterisierung von homing Lungenkapazität von primären menschlichen Lymphozyten unter in-vivo entzündlichen Erkrankungen. Pulmonale Infiltration der adoptively übertragenen menschlichen Immunzellen in einem Mausmodell der allergische Entzündung kann abgebildet und durch Licht-Blatt Fluoreszenzmikroskopie von chemisch ausgeglichenen Lungengewebe quantifiziert werden.

Zusammenfassung

Überwältigend Gewebe Ansammlung von hoch aktivierten Immunzellen ist ein Markenzeichen der verschiedenen chronischen Entzündungskrankheiten und erwies sich als ein attraktives therapeutische Ziel in die klinische Behandlung der betroffenen Patienten. Um Strategien zur therapeutischen Regulierung der pathologisch unausgewogen Gewebe eindringen von Pro-inflammatorischen Immunzellen weiter zu optimieren, wird es von besonderer Bedeutung für bessere Einblicke in Krankheit und organspezifischen zu erreichen sein. Homing Eigenschaften des peripheren Lymphozyten. Die hier beschriebenen experimentelle Protokoll ermöglicht, um Lunge Anhäufung von Eindringmittel beschriftet und adoptively übertragenen menschlichen Lymphozyten im Zusammenhang mit Papain-induzierten Lungenentzündung zu überwachen. Die jetzt eingeführte in-vivo-Einstellung berücksichtigt im Gegensatz zum standard in-vitro-Untersuchungen häufig verwendet für die Analyse der Immunzelle Migration und Chemotaxis Lunge-spezifische Aspekte der Gewebe-Organisation und der Einfluss des Komplexes entzündliche Szenario in murinen Lebewesen stattfindet. Darüber hinaus dreidimensionale Cross-sectional Licht-Blatt Fluoreszenz mikroskopische Bildgebung bietet nicht nur quantitative Daten an Immunzellen zu infiltrieren, sondern zeigt auch das Muster der Immunzelle Lokalisierung innerhalb der entzündeten Lunge. Insgesamt sind wir in der Lage, eine innovative Technik von hohem Wert für die immunologische Forschung auf dem Gebiet der chronisch entzündlichen Lungenerkrankungen, einzuführen, die leicht anhand der zur Verfügung gestellten schrittweise Protokoll angewendet werden können.

Einleitung

Klassische entzündliche Erkrankungen der Lunge, wie allergisches Asthma und chronisch obstruktive Lungenerkrankung (COPD) sind bekannt durch eine verstärkte Rekrutierung von aktivierten Lymphozyten in der pulmonalen Gewebe1,2getrieben werden. Lymphozyten freigegeben Zytokine (z.B. IL-4, IL-5, IL-9, IL-13, IFN-γ und TNF-α) fördern Chemotaxis von angeborenen und der adaptiven Immunzellen, induzieren fibrotische Atemwege Umbau oder direkt schädigen die Lunge Parenchym2. Bisher sind verantwortlich für die pathologische Ansammlung von Lymphozyten im Lungengewebe zugrunde liegenden Mechanismen noch nicht vollständig verstanden. In Analogie zur Gewebe-selektive T-Zell-Prägung für Darm und Haut Homing beschrieben, pulmonale dendritische Zellen (DCs) sind offensichtlich in der Lage, auf peripheren T-Zellen für bevorzugte Lung Infiltration, zumindest teilweise über die Induktion von CCR4 Ausdruck prime die Oberfläche von Lymphozyten3. Neben CCR4 zeichnen sich die Atemwege infiltrieren T-Zellen auch durch einen besonders erhöhten Ausdruck der Chemokin-Rezeptoren CCR5 und CXCR3 im Vergleich zu T-Zellen im peripheren Blut1,4,5. Insgesamt, vorhandene Daten stehen im Einklang mit dem Konzept, dass Lungenkrebs Homing von T-Lymphozyten unter physiologischen oder entzündlichen Bedingungen eine Reihe von verschiedenen Chemokin-Rezeptoren und ihrer jeweiligen Liganden beinhaltet und somit entscheidend abhängig ein eng Zusammenarbeit zwischen angeborenen und der adaptiven Immunzellen1gesteuert. Vor allem in der Anfangsphase der Erreger oder Allergen-Exposition reagieren Zellen des angeborenen Immunsystems TLR Stimulation oder IgE-vermittelten Vernetzung durch die sofortige Freilassung von verschiedenen Chemoattractants wie LTB4, CCL1, CCL17, CCL22, CCL20, CXCL10 und PID21,6,7. Als Paradebeispiel das Zusammenspiel von PID2 und der Lockstoffgradient-Rezeptor CRTh2 ist bekannt, dass für Chemotaxis von Th2-Zellen von besonderer Bedeutung und so erschien als vielversprechende therapeutische Ziel in die klinische Behandlung von Asthma. In der Tat zeigten Patienten mit moderaten Asthma eine Besserung der Symptome und eine deutliche Zunahme der erzwungenen exspiratorischen Volumen in einer Sekunde (FEV1) nach der Behandlung mit einem selektiven CRTh2-Antagonisten im Vergleich zu der Placebo-Gruppe8 ,9. Bereits rekrutierte T-Zellen können in einem mehr fortgeschrittenen Zustand der Entzündungsreaktion pulmonale Lymphozyten Akkumulation über die Freisetzung von IL-4 und IL-13 als potenter Stimulus für pulmonale DCs weiter verstärken. Anschließend, Regeln bis-diese myeloische abgeleitet angeborene Zellen die Expression von CCL17 und CCL22 in einem STAT6-abhängigen Weise1,10,11.  Obwohl die Komplexität des beschriebenen Szenarios noch ein vollständiges Verständnis der T-Zell-Lunge homing behindert, bietet es eine Fülle von molekularen Zielstrukturen für eine potenziell optimierte therapeutische Kontrolle der entzündliche oder allergische Lungenerkrankungen. Daher ist dringend innovative experimentelle Techniken, die sind in der Lage weiter zu vertiefen und ergänzen unser Wissen im Bereich der T-Zell-Chemotaxis und Lunge Homing.

Die Lunge Homing von Lymphozyten innerhalb des menschlichen Körpers durch mehrere zelluläre und humorale körperliche Parameter1beeinflusst wird, sind die meisten der vorhandenen experimentellen Methoden nicht in der Lage, die ganze Komplexität dieser immunologischen Prozess zu modellieren. Stattdessen konzentrieren sich viele standard-Protokolle für die Analyse der Lunge homing selektiv auf einen bestimmten Aspekt der Kaskade von Lymphozyten Attraktion, Adhäsion, Migration und Aufbewahrung beteiligt. Neben einer rein beschreibenden Bestimmung der mRNA oder Protein Expressionsmuster der Integrine und Chemokin-Rezeptoren auf periphere oder Lunge infiltrieren Lymphozyten und die ergänzende Messung des jeweiligen Chemokin-Spiegel im Blut, alvéolaire Lavage (BAL) oder pulmonale Gewebe12,13,14,15, etablierten in-vitro-Zelle-Kultur-Assays ermöglichen eine funktionelle Charakterisierung von Lymphozyten Haftung oder chemotaxis nach definierten Versuchsbedingungen16,17,18. Im Prinzip überwachen statische Haftung in-vitro-Tests die Bindungskapazität von kultivierten Lymphozyten eine endotheliale Monolage oder Glas-Objektträger beschichtet mit rekombinanten endothelialen Adhäsionsmoleküle (z. B. MAdCAM-1, VCAM-1), während der Standard in-vitro- Chemotaxis-Assays sind in der Regel angewendet, um die Fähigkeit von Lymphozyten, entlang eines Chemokin-Gradienten in ein Transwell System19migrieren zu quantifizieren. Sowohl in-vitro-Einstellungen ermöglichen eine kontrollierte Anpassung und Modulation der experimentellen Bedingungen, aber auf der anderen Seite fehlen wichtige Variablen, die bekanntermaßen kritisch Einfluss auf in-vivo Chemotaxis und Adhäsion von Lymphozyten. Überwiegend statische Zelle Kultur Assays missachten den Einfluss von Scherkräften verursacht durch die permanente Blut fließen19 und potenziell vernachlässigen die Einbeziehung der umliegenden immunologische Milieu und interagierenden-Lymphozyten Immunzellen, die beiden präsentieren in einem lebenden Organismus. Um diese Einschränkungen zu überwinden, die Interpretation der Ergebnisse erwarb statische in-vitro-Chemotaxis oder die Einhaltung von Untersuchungen benötigen weitere Validierung in dynamischen Adhäsion Experimente unter Strömung Bedingungen20,21 und in in Vivo Modelle von entzündlichen Orgel Pathologie19. In der Tat geändert wichtige Rückschlüsse auf die Regulierung der T-Zell-Lunge homing entzündliche oder allergische Bedingungen aus tierexperimentellen Studien gezogen werden könnten genetisch Analyse Mäuse in definierten Modelle von verschiedenen Lungenkrankheiten3, 22 , 23. der quantitativen Vergleich der Lunge infiltrieren Lymphozyten zwischen Wildtyp-Mäusen und Mäuse mit einem Mangel, denn ein bestimmtes Gen des Interesses, eine etablierte und allgemein verwendete Werkzeug zur Definition der Auswirkungen von bestimmten Mobilfunk dar Wege oder auf die Erkrankung ausgerichtete Verteilungsmuster T-Zell-Rezeptoren. Jedoch fehlt im Gegensatz zu vor in-vitro-Zelle-Kultur-Assays, diskutiert ein Studiendesign, basierend auf klassischen Tiermodellen die Möglichkeit, analysieren und überwachen der primären menschlichen T-Zellen direkt abgeleitet aus dem Blut oder BAL von Patienten mit einer entzündlichen Lunge Erkrankung. Somit bleibt es weiterhin schwierig, funktional zu überprüfen, ob eine diagnostisch angegebenen Lungenerkrankung ist in der Lage, Impressum menschliche Lymphozyten für bevorzugte Lunge Tropismus und wie weit klinische Parameter auf dieses Szenario auswirken könnte. Vor kurzem wurde ein sehr eleganter in-vivo-Ansatz im Zusammenhang mit entzündlichen Darmerkrankungen (IBD) eingeführt, die war in der Lage, die meisten dieser Einschränkungen zu überwinden und eröffnet neue Wege für die translationale Hauptstudium am Darm Lymphozyten homing24 . Unter Ausnutzung der Protokolle für lösemittelhaltige Gewebe Clearing gefolgt von Cross-sectional Licht-Blatt-Fluoreszenz-Mikroskopie als eine leistungsfähige imaging-Tool, war es möglich, die Infiltration und die Verteilung der adoptively übertragenen menschlichen T-Zellen visualisieren im Darm von colitic immungeschwächte Mäuse24. Insbesondere diese experimentelle Einstellung implementiert zwei wesentliche Neuerungen: (1) primäre menschliche Immunzellen analysiert werden können, unter experimentell definierten in vivo Bedingungen; (2) eine ziemlich große Fläche des erkrankten Organs (ca. 1,5 x 1,5 cm) in hochauflösender Qualität, gefolgt von 3D-Rekonstruktion abgebildet werden können. Darüber hinaus stellte mehrere neuere Studien erfolgreich die Verwendung von lösungsmittelhaltigen Gewebe clearing und Licht-Blatt Fluoreszenzmikroskopie als wichtige Werkzeuge für die fortgeschrittenen Lungenkrebs imaging25,26. Um von diesem technologischen Fortschritt auf dem Gebiet der pulmonalen Immunologie zu profitieren, haben wir nun das System für die Analyse der Lunge Homing angenommen.

Die hier vorgestellte Protokoll bietet einer schrittweisen Einführung wie zu reinigen und Eindringmittel Label primären menschlichen T-Zellen für den Transfer in Mäusen mit induzierten Lungenentzündung und darüber hinaus beschreibt im Detail den nachfolgenden Prozess der Licht-Blatt Fluoreszenz mikroskopische Bildgebung, einschließlich Orgel Vorbereitung und Bildverarbeitung. Alles in allem hoffen wir, künftige translationale Studien auf dem Gebiet der entzündlichen oder allergischen Lungenerkrankungen zu unterstützen, durch die Einführung einer anspruchsvollen, aber dennoch machbar, experimentellen Modell für die Überwachung der menschlichen Lymphozyten Lunge Homing auf in-vivo-Bedingungen.

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Protokoll

Experimente mit Tieren wurden gemäß Protokollen genehmigt von den zuständigen örtlichen Behörden in Erlangen (Regierung von Unterfranken, Würzburg, Deutschland) durchgeführt. Mäuse wurden unter bestimmten Pathogen-freies Bedingungen untergebracht. Die Sammlung von menschlichem Blut wurde durch die lokale Ethikkommission und der institutionellen Review Board der Universität Erlangen-Nürnberg genehmigt. Jeder Patient hat schriftliche Einwilligungserklärung.

1. allergische Lungenentzündung bei Mäusen zu induzieren.

Hinweis: Wie in früheren Studien27beschrieben, das folgende experimentelle Verfahren kann allergische Atemwege Entzündung bei Mäusen zu induzieren und dementsprechend löst die Anhäufung von angeborenen und der adaptiven Immunzellen in der BAL. Das beschriebene Protokoll wurde in den Mäusen C57BL/6J eingerichtet, aber Annahme zu anderen standard Inzucht Stämme sollte möglich sein.

Abbildung 1A für die in-vivo Versuchsdurchführung im Überblick zu sehen.

  1. Mäuse durch intraperitoneale Injektion von Ketamin/Xylazin zu betäuben.
    Hinweis:     verwenden Sie nur C57BL/6J Mäuse älter als 6 Wochen und mit einem Körpergewicht von mindestens 16 g.
    1. Bereiten Sie Ketamin/Xylazin-Lösung mit PBS-Puffer (12 mg/mL Ketamin; 1,6 mg/mL Xylazin) und bestimmen Sie die genaue Körpergewicht von Mäusen.
    2. Die erste Maus intraperitoneal mit 8 µL/g Körpergewicht von Ketamin/Xylazin-Lösung zu injizieren und Tiefe Narkose über das Fehlen von der Pfote Prise Reflex vor 1.3 Schritt bestätigen.
  2. Frisch bereiten Sie 5 mg/mL Papain in PBS zu. Langsam pipette 10 µL (50 µg) der Papain-Lösung in das Nasenloch. Verfolgen Sie aufmerksam die Maus bis zum Erwachen.
  3. Wiederholen Sie die Schritte 1.1 und 1.2 für alle Mäuse in das Experiment einbezogen. Führen Sie Schritte 1.1-1.3, an drei aufeinanderfolgenden Tagen.

2. reinigen und Gewebekulturen beschriften menschlichen peripheren Blut CD4+ T-Zellen

Hinweis: Verarbeiten Zellen unter sterilen Bedingungen.

  1. Sammeln Sie 18 mL volles menschliches Blut aus einer peripheren Vene. Führen Sie Ficoll-Hypaque Steigung Zentrifugierung um den Bruchteil der peripheren mononukleären Zellen (PBMC) wählen Sie aus.
    Hinweis: Erhebung und Analyse von primären Menschenmaterial müssen von den lokalen ethischen Behörden genehmigt werden. Nur eine Person mit einer ausreichende medizinische Qualifikation darf Blut aus einer peripheren Vene zu sammeln.
    1. Sammeln Sie Blut in Ethylenediaminetetraacetic Säure (EDTA)-mit Monovettes (1,6 mg EDTA/mL Blut) zur Vermeidung von Koagulation.
      OPTIONAL: Verwenden Sie buffy Coat Blut, ein Nebenprodukt der Blutspende in Leukozyten, anstatt komplette venöses Blut angereichert.
    2. Blut in einem konischen 50 mL-Tube und verdünnen Sie 1:2 in Phosphat gepufferte Kochsalzlösung (PBS). Fügen Sie vorsichtig 10 mL Ficoll-Medium (Dichte 1,077 g/mL) als eine Unterschicht unter das verdünnte Blut. Zentrifugieren Sie die Probe (800 X g für 15 min bei Raumtemperatur ohne Bremse).
    3. Sorgfältig entfernen Sie den Schlauch aus der Zentrifuge und übertragen Sie die PBMC-haltigen Interphase in eine neue konische 50 mL Tube. Entsorgen Sie die obere und Unterschicht. Die PBMC-haltigen Röhrchen mit PBS und Zentrifuge (300 X g für 10 min bei 4 ° C) füllen. Den Überstand zu entfernen.
      Hinweis: Optional, falls erforderlich, führen Sie lyse der verbleibenden Erythrozyten. Fügen Sie 3 mL Ammonium-Chlorid-Kalium (ACP) Lysis Puffer (155 mM Ammoniumchlorid; 19 mM Kalium Wasserstoff Carbonat und 0,68 mM EDTA pH 7,27 hinzu) sorgfältig die resuspendierte Zelle Pellet und Wirbel der Probe. Schütteln Sie die Rohre für 3 min. Um die ACP-Lyse-Puffer zu entfernen, fügen Sie 40 mL PBS und Zentrifuge (300 X g für 10 min bei 4 ° C). Verwerfen Sie überstand.
  2. Reinigen von CD4+ T-Zellen über CD4 Microbeads.
    Hinweis: Im Allgemeinen gibt es mehrere Händler von magnetische Microbeads zur Reinigung des menschlichen CD4+ Zellen, die in vergleichbarem Zelle Reinheit führen sollte. Produktauswahl sollte auf individuelle Präferenzen beruhen. Die folgenden Schritte des Protokolls (2.2.2–2.2.7) werden an einen definierten CD4-Microbead-Produkt und jeweiligen Trennsäulen wie weiter in der Tabelle der Materialienangepasst. Einige Änderungen des Protokolls können Fall erforderlich sein, dass ein Alternativprodukt CD4-Microbead ausgewählt ist.
    1. Aufschwemmen der PBMC Pellet in mindestens 80 µL PBS mit 0,5 % fetalen bovine Serum (FBS) und 2 mM EDTA (PBS/FBS/EDTA-Puffer) pro 107 PBMC. Nutzung ab Einwohner etwa 30 x 106 PBMC um Enden mit ca. 3 x 106 bis 6 x 106 gereinigt menschlichen CD4+ T Zellen.
    2. Fügen Sie 20 µL CD4 Microbeads pro 107 PBMC, vorsichtig mischen und 20 min bei 4 ° c inkubieren Füllen Sie das Rohr mit PBS/FBS/EDTA-Puffer (bis zu 4 ° C gekühlt) und Zentrifuge (300 X g für 10 min bei 4 ° C). Entfernen Sie überstand.
    3. Legen Sie eine Trennsäule in ein magnetisches Feld. Spülen Sie die Spalte mit 3 mL PBS/FBS/EDTA-Puffer. Aufschwemmen der Zelle Pellet in 500 µL PBS/FBS/EDTA-Puffer (bis zu 4 ° C gekühlt) und übertragen die Zellsuspension auf die gespülten Trennsäule, platziert in einem Magnetfeld.
    4. Spülen Sie die Trennsäule dreimal mit 3 mL PBS/FBS/EDTA-Puffer (bis zu 4 ° C gekühlt) und entsorgen Sie das Abwasser.
    5. Das magnetische Feld entfernen Sie der Trennsäule und legen Sie sie in einem 15 mL-Tube. Die CD4 eluieren+ Zelle Bruchteil in 5 mL PBS/FBS/EDTA-Puffer mit den Kolben.
    6. Füllen Sie das Rohr mit PBS und Zentrifuge (300 X g für 10 min bei 4 ° C). Entfernen Sie überstand. Wiederholen Sie waschen zweimal.
    7. Bestimmen Sie die Anzahl der ergab Zellen durch eine standard-Methode der Wahl (z. B. Neubauer Kammer).
  3. CD4-Label+ T-Zellen mit einem fluoreszierenden Zelle Verbreitung Farbstoff.
    1. Aufschwemmen CD4+ T-Zellen mit PBS-Puffer (bis zu 107 Zellen/mL; verwenden Sie nicht weniger als 500 µL PBS).
    2. Bereiten Sie eine 6 µM-Lösung von einem Rotlicht-erregbare Zellproliferation in PBS (vorher auf Raumtemperatur erwärmt) färben (siehe Tabelle der Materialien). Mischen Sie diese Lösung 1:2 mit dem vor der Zellsuspension und Vortex gründlich vorbereitet (3 µM Endkonzentration).
    3. 10 min bei 37 ° C (lichtgeschützt) inkubieren. Danach fügen Sie fünf Bände von RPMI Medium mit 10 % FBS und inkubieren Sie für 5 min auf Eis (vor Licht geschützt).
    4. Waschen mit der Bezeichnung Zellen dreimal in RPMI Medium mit 10 % FBS (Zentrifugieren bei 300 X g für 10 min bei 4 ° C). Aufschwemmen markierte Zellen in PBS, speichern auf Eis und bis zum Gebrauch vor Licht schützen.
      Hinweis: Längere Lagerung von Zellen (> 60 min) könnte negative Auswirkungen auf das Überleben der Zelle.
      OPTIONAL: Bestimmen Sie die Reinheit der CD4+ Zell-Anteil und die Wirksamkeit des Verfahrens Kennzeichnung durch Durchflusszytometrie. Aufschwemmen 0,5 x 106 bis 1 x 106 CD4+ Zellen in 100 µL Puffer (1 % FBS, 2 mM EDTA mit PBS-Puffer) und fügen Sie einen Anti-Human CD4 Antikörper gekoppelt mit einem Fluoreszenzfarbstoff Wahl. 30 min bei 4 ° c inkubieren Fügen Sie 1 mL Puffer und Zentrifuge (300 X g für 10 min bei 4 ° C). Verwerfen Sie überstand. Fahren Sie mit der durchflusszytometrischen Messung der Probe (repräsentatives Ergebnis wird dargestellt in Abbildung 1B, C).

3. adoptively Transfer menschlichen CD4+ T-Zellen in Papain-exponierten Empfänger Mmice

Hinweis: Siehe Abbildung 1A für eine Zusammenfassung der in-vivo experimentelle Verfahren durchgeführt. Führen Sie einen Tag nach der letzten intranasale Verabreichung von Papain Zelltransfer.

  1. Passen Sie die Aussetzung der Gewebekulturen beschriftete menschliche CD4+ T Zellen (Schritt 2.3.4) zu einer Konzentration von 1 x 107 Zellen/mL in PBS. Füllen Sie 100 µL Zellsuspension in eine 1 mL/30 G-Spritze.
  2. Setzen Sie sorgfältig die erste Papain-exponierten C57BL/6J Maus (Schritte 1.1-1.3) in einer Rückhalteeinrichtung für Heck Vene Injektion. Die vorbereitete Spritze (Schritt 3.1) verwenden, um die Rute Vene punktieren und langsam injizieren 100 µL Zellsuspension mit 1 x 106 beschriftet menschlichen CD4+ Zellen. Nicht sofort herausziehen der Nadelöhrs nach der Injektion, aber weitere 5 Sekunden warten, um die Entladung der Zellsuspension zu verhindern.
  3. Lassen Sie die Maustaste aus der Rückhalteeinrichtung und fahren Sie mit dem nächsten Tier. Halten Sie mindestens eine Papain-exponierten Tier, das Transfer mit Fluoreszent markierten Zellen als Negativkontrolle für Licht-Blatt Fluoreszenzmikroskopie dienen nicht durchlaufen.

4. bereiten Sie Lungengewebe für Licht-Blatt-Fluoreszenz-Mikroskopie

Hinweis: Die folgenden Schritte sind 3 h durchgeführt, nach der Übertragung von Eindringmittel menschliche Zellen (Schritt 3.2) beschriftet. Die beschriebenen experimentellen Verfahren einschließlich der Entnahme von Lungengewebe, wurden Fixierung und lösemittelhaltige Gewebe clearing angepasst von derzeit beschriebenen Protokolle24,28.

  1. Die Maus durch Kohlendioxid (C02) Inhalation zu opfern.
  2. Durchspülen der Lungenkrebs an Ort und Stelle mit PBS, 5 mM EDTA enthalten.
    1. Öffnen Sie den Brustkorb über Schnitt entlang dem Brustbein das Herz aussetzen. Punctata die rechte Herzkammer mit einer Kanüle 21 G mit einem Katheter verbunden.
    2. Öffnen Sie die linke Herzkammer durch Schneiden und ermöglichen Sie dadurch die Blut- und Perfusion Flüssigkeit zu verlassen. Langsam durchspülen der Lungenkrebs mit 20 mL eiskaltem PBS mit 5 mM EDTA über den Katheter.
  3. Um in-situ Fixierung der Lunge führen, entfernen Sie den Katheter nicht von der rechten Herzkammer. Langsam durchspülen der Lungenkrebs mit 2 mL eiskaltes 4 % Paraformaldehyd (PFA) mit PBS-Puffer gelöst. Entfernen Sie den Katheter und die Kanüle.
    Hinweis: PFA-basierte in-situ Fixierung von Lungengewebe stellt eine bewährte Technik zur anschließenden mikroskopischen Analyse29,30murinen Lungengewebe Vorbereitung.
    Vorsicht: PFA ist giftig und muss unter einer Haube mit Sorgfalt behandelt werden.
  4. Füllen Sie die Lunge mit 0,75 % Agarose an Ort und Stelle.
    1. 0,75 % Agarose in PBS vorbereiten und bis zum Gebrauch bei 50 ° C in einem Thermo-Shaker solide halten. Die Speicheldrüsen der Maus entfernen, schneiden Sie den Sternohyoid-Muskel und Aussetzen der Luftröhre durch Verschieben einer Pinzette unter.
    2. Unterstreichen Sie die exponierten Trachea mit einer 30 G-Nadel und ersetzen Sie ihn durch einen stumpfen 30 G Katheter zur Vermeidung von weiteren Schäden der Luftröhre, was zu unerwünschten Austritt von Agarose. Versiegeln Sie die Verbindung zwischen der Katheter und der Trachea mit einem Nadelhalter.
      OPTIONAL: Kombinieren Sie die hier beschriebenen Verfahren mit BAL Sammlung infiltrierte menschliche Zellen in BAL wie kürzlich im Detail31 beschrieben zu analysieren (siehe Abbildung 2E für repräsentative Ergebnisse).
    3. Füllen Sie vorsichtig die Atemwege mit 0,75 % Agarose (auf Körpertemperatur abgekühlt) über den Katheter bis vollständige Entfaltung der Lunge; warten Sie bis zum vollständigen Erstarrung von der Agarose. Den Katheter entfernen und vorsichtig ernten die Lunge in einem abgedunkelten 2 mL Röhrchen gefüllt mit 4 % PFA.
  5. Für zusätzliche Fixierung Inkubation die Probe bei 4 % PFA mit PBS-Puffer für 2 h bei 4 ° C unter kontinuierliche Rotation (31 u/min) gelöst.
  6. Entwässern von Gewebe durch nachträglich Inkubation der Probe unter kontinuierliche Rotation (31 u/min) bei 4 ° C in 50 % igem Ethanol (pH 9), 70 % igem Ethanol (pH 9) und 100 % Ethanol; Jeder Schritt für mindestens 4 Stunden. Am Ende führen Sie eine zweite Inkubation in frische 100 % Ethanol für 4 h.
  7. Führen Sie lösemittelhaltige Clearing des Gewebes mit Ethyl Cinnamate (ECi). Übertragen Sie daher die Probe in ECi. Inkubation über Nacht bei Raumtemperatur (unter ständiger Drehung), bis das Gewebe durchscheinend (siehe Abbildung 1D für repräsentative Bilder) angezeigt wird.
    Hinweis: Proben bei Raumtemperatur (lichtgeschützt) in ECi gespeichert sind über mehrere Wochen bis Monate stabil.

5. führen Sie Licht-Blatt Fluoreszenz-Mikroskopie der Wwhole Murine Lungenlappen

Hinweis: Entnehmen Sie die Tabelle der Materialien für Details bitte der Licht-Blatt Fluoreszenzmikroskop und der dazugehörigen Software, auf dem die folgenden Schritte basieren. Vergleichbare Systeme von anderen Herstellern, können jedoch auch mit Entwickler-spezifische Änderungen Folgendes Protokoll verwendet werden. Machen Sie bevor Sie beginnen sich vertraut mit der Mikroskop-spezifische Betriebsanleitung und Anweisungen Sie der technischen der verantwortlichen Person vor Ort.

  1. Richten Sie die Licht-Blatt-Mikroskop.
    1. Schalten Sie das Licht-Blatt-Mikroskop und öffnen Sie den entsprechenden imaging-Software auf dem Computer. Füllen Sie die Probenkammer mit gefilterten EBI (100 µm Filter) und legen Sie sie in ihre Position zwischen den Laserstrahlen.
    2. Verwenden Sie einen kleinen Tropfen des organischen Lösungsmittel-Stall-Kleber, die Lunge, der Probenhalter stick. Um die erforderliche Eindringtiefe von Licht-Bogen so gering wie möglich zu halten, setzen Sie die Lungenflügel aufrecht. Als Nächstes platzieren der Probenhalter in seiner Kammer.
    3. 3.5 der Brechungsindex des Ziels soll bei der ECi Verwendung als clearing-Reagenz.
  2. Passen Sie die Einstellungen am Licht-Blatt Mikroskop um menschliche Zellen im Kontext des gesamten Organs zu erkennen.
    1. Wählen Sie erforderliche Laser (Filter für Messung > aktivieren Kontrollkästchen erforderlich Laser) und wählen Sie geeignete Intensitäten in der Steuersoftware (laser-Getriebesteuerung > verwenden Schieberegler "" ein laser Intensität > gelten). Verwenden eine Anregung Wellenlänge von 488 nm (525/50 Filter) zur Erkennung von Autofluorescent Lungengewebe und 640 nm (680/30 Filter) menschliche Zellen mit einem Fluorophor emittierende im roten Spektrum beschriftet begeistern.
    2. Konzentrieren sich auf die Probe begeistert von 488 nm und passen Sie den Fokus über das Tool "chromatischen Korrektur" bei Erregung Wellenlänge 640 nm (mithilfe des Schiebereglers chromatischen Korrektur eingestellt > gelten).
    3. Wählen Sie einen entsprechende Zoom-Faktor; Verwenden Sie eine geringe Vergrößerung-Übersicht (z. B. 6,3 X) die Gesamtverteilung der markierten Zellen im Lungengewebe und vergrößerte Bilder (z. B. 32 X) für die genaue Lokalisierung zu bestimmen.
    4. Wählen Sie eine Bogenbreite gleichmäßig das gesamte Organ oder einen bestimmten Abschnitt des Interesses Aufklärung (Optik > mithilfe Schiebereglers Bogenbreite fest; in der Regel zwischen 20 – 40 %). Definieren Sie den Blatt numerische Apertur (NA) mit höheren NA schärfere Bilder erstellen (Optik > verwenden Schieberegler einstellen die Blatt-NA; für einen murinen Lungenflügel erweitert seine physiologische Größe NA von 0,025 % häufig genutzt werden).
    5. Wählen Sie die Anzahl der Licht-Blätter unter "advanced Measurement Einstellungen" verwendet werden. Bei bidirektionalen Beleuchtung, linken und rechten Licht-Blätter um eine homogen beleuchtete Bild zusammenführen (Erweiterte > Zusammenführen Lightsheets > Select Mischmodus > Schieberegler verwenden, um Überschneidungen zwischen beiden Licht-Blättern definieren).
      Hinweis: Es wird empfohlen, die bidirektionale Beleuchtung der Probe mit drei Licht-Blätter nutzen.
      OPTIONAL: Um die Bildqualität weiter zu erhöhen, verwenden Sie die Dynamik-Fokus-Operation. Dies ermöglicht um den Fokus während der Bildaufnahme in X-Richtung zu verschieben.
    6. Definieren Sie Anfangs- und Endpositionen der Z-Stapel, werden gemessen und die Schrittweite 5 µm (Xyz-Tabelle Z > scan-Bereich).
      Hinweis: Anfangs- und Endpositionen eines Z-Stack ist abhängig von Größe und Positionierung der Lungenflügel in den Probenraum. Etwa 300 bis 800 Z-Stacks sind jedoch in der Regel für eine einzelne Lungenflügel (5 µm Schrittweite) erworben.
    7. Speichern von Dateien mit Autosave-Einstellungen und starten Sie die Messung um Bilder zu erfassen. Reinigen Sie nach Abschluss der Datenerfassung die ECi-kontaminierten Probenhalter und Kammer unter fließendem Wasser.
      Hinweis: Verwenden Sie dieselben Einstellungen für mehrere Lungenlappen Bild, das anschließend verglichen werden sollen.

6. Post-Bild Processing und Quantifizierung der Lunge angesammelt menschlichen Zellen

Hinweis: Siehe Tabelle der Materialien für Details über die Post-Imaging-Software für die 3D Analyse, auf denen die folgenden Schritte basieren. Alternative Post-imaging-Software kann jedoch auch verwendet werden.

  1. Laden Sie das erste Bild aus einem Z-Stapel (aktivieren Sie die Schaltfläche "übertreffen", Datei > Öffnen > Wählen Sie das Bild) um die Öffnung aller anderen Bilder von der gewählten Z-Stack und ihre automatische 3D-Rekonstruktion zu initiieren.
  2. Um korrekte Anzeige von x zu gewährleisten, y und Z Abmessungen Voxel Größen zu überprüfen und gegebenenfalls anpassen (Bearbeiten > Bild-Eigenschaften > Voxel-Größe manuell eingeben). Geben Sie für die Voxel-Größe von z die gewählte Schrittweite zwischen zwei Bildern (hier 5 µm).
  3. Jeder Kanal in eine bestimmte Farbe anzeigen (Bearbeiten > Displayanpassung zeigen). Klicken Sie auf jedem Kanal eins nach dem anderen zur Definition einer Farbe der Wahl (in Abbildung 2A, B, C, D die Autofluoreszenz-Signal in grau angezeigt und mit der Bezeichnung menschlichen CD4 Zellen+ in rot).
  4. Passen Sie Intensität, Schwarzwert und Kontrast für jeden Kanal (Bearbeiten > Displayanpassung zeigen) mit Hilfe der Dreiecke in den Kanal-Bars oder exakte Zahleneingabe in die Kanaleinstellungen. Verwenden Sie zur Einstellung der Intensität rechtwinkligen Dreiecks. Verwenden Sie für schwarze Pegelanpassung das linke Dreieck und Kontrasteinstellung, verwenden Sie das mittlere Dreieck.
    Hinweis: Verwendung der Lunge abgeleitet aus der Steuerelement-Maus ohne Zelltransfer (Schritt 3.3), bestimmte menschliche Zelle abgeleitet Signale und unspezifischen Hintergrund zu unterscheiden.
  5. Markierte Zellen innerhalb des Lungen-Gewebes um zu quantifizieren verwenden "hinzufügen neue Spots" in der Symbolleiste und wählen Sie "automatische Erstellung überspringen, manuell bearbeiten" für manuelle Zellzählung.
    Hinweis:     Alternativ verwenden Sie die automatische Zelle zählen-Tool unter "Flecken". Allerdings ermöglicht die manuelle Zählung spezifische und unspezifische Signale genauer unterscheiden.
    1. Um die Ansammlung von menschlichen Zellen in verschiedenen Proben zu vergleichen, definieren einen Lunge Würfel mit einem bestimmten Volumen mit der 3D Schneidwerkzeug (Bearbeiten > Zuschneiden 3D) (hier 813 μm X 813 μm X 1,000 μm).
    2. Zu zählen angesammelten Zellen wählen Sie 640 nm-Kanal und definieren eine "Radius-Maßstab" von 10 µm. Klicken Sie auf "Bearbeiten", überprüfen Sie "auswählen" im Menü "Zeiger" zu und markieren Sie jede Zelle mit einem Punkt über Shift-Klick mit der linken Maustaste. Finden Sie die Anzahl der gezählten Zellen in der Statistik angezeigt.
      Hinweis: Es wird dringend empfohlen, mehrere Würfel pro Lungenflügel (hier 5) Zuverlässigkeit der Ergebnisse zu gewährleisten und zu entschädigen für Wissenschaftler-abhängige Auswahl der gezählten Lungenvolumen zu zählen (Quantifizierung Strategie und Vertreter Ergebnisse sind dargestellt in Figur 2D).
  6. Erfassen Sie ein Bild mit dem Werkzeug "Snapshot" und/oder nehmen Sie eine Video mit dem Werkzeug "Animation". Speichern Sie Dateien als .ims Dateien angepasst (Datei > export).
    Hinweis: Für repräsentative Zwecke ein- oder blenden Sie des Rahmens durch Kontrolle oder Sie deaktivieren den Rahmen in der Symbolleiste aus. Darüber hinaus Anzeige Bilder entweder als maximale Intensität Projection (MIP) (Symbolleiste > Volumen > Modus > überprüfen MIP) oder verwenden Sie die "Oberflächenmodus" (Symbolleiste > neue Flächen Hinzufügen). Der "Oberflächenmodus" muss separat aktiviert werden, für jeden Kanal markieren Gewebearchitektur und/oder Zellkörper (repräsentative Bilder erscheinen in Abbildung 2C).

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Ergebnisse

Die vorgestellte Protokoll beschreibt einen experimentellen Mausmodell, die Überwachung und Quantifizierung der Ansammlung von adoptively übertragenen menschlichen T-Lymphozyten in der Lunge über Licht-Blatt Fluoreszenz-Mikroskopie ermöglicht. Abbildung 1 A stellt eine schematische Übersicht über die in-vivo Schritte des experimentellen Zeitplans. Um zuverlässige Ergebnisse zu garantieren, es ist von wesentlicher Bedeutung, um eine gute Qualität von der isolierten und Gewebe...

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Diskussion

Die hier beschriebenen experimentellen Einstellung bietet die Möglichkeit, homing Lungenkapazität von primären menschlichen Immunzellen unter in-vivo entzündlichen Erkrankungen und damit einschlägig ergänzt klassisch überwachen in-vitro-Adhäsion und Chemotaxis durchgeführt Assays. Um die Berücksichtigung der spezifischen anatomischen Organ Merkmale der Lunge zu berücksichtigen, haben wir wichtige Aspekte der Immunzelle homing (einschließlich Chemotaxis und Zelle Verteilung in das Zielorgan) s...

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Offenlegungen

M.f. Neurath diente als Berater für Pentax, Giuliani, MSD, Abbvie, Janssen, Takeda und Boehringer. Die übrigen Autoren geben keinen Konflikt.

Danksagungen

Die Autoren erkennen dankbar, Förderung durch die DFG Collaborative Research Centers SFB 1181 und TRR 241. Die Optical Imaging Zentrum Erlangen (Hauptsitz) und in bestimmten Ralf Palmisano, Philipp Tripal und Tina Fraaß (Projekt Z2 der DFG SFB 1181) sind anerkannt für kompetente technische Unterstützung für die Licht-Blatt Fluoreszenz mikroskopische Bildgebung.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Agarose NEEO UltraCarl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Deutschland2267.4
AlexaFlour594 Anti-Human-CD45-AntikörperBioLegend, San Diego, USA304060
AmmoniumchloridCarl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, DeutschlandK2981
Kanüle 21 GBecton, Dickinson and Company, Franklin Lakes, USA301300
Zellproliferationsfarbstoff eflour670eBioscience Inc., San Diego, USA65-0840-85
CD4 MicroBeads, humanMiltenyi Biotech GmbH, Bergisch-Gladbach, Deutschland130-045-101
EDTA (Ethylendiamintetraessigsäure)Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Deutschland8043.1
Kalium-EDTA Blutentnahmeröhrchen, 9 mLSarstedt AG & Co., Nü mbrecht, Deutschland21066001
Ethly cinnamat (ECi)Sigma-Aldrich, Steinheim, Deutschland112372-100G
Ethanol ≥ 99,5% (EtOH)Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Deutschland5054,3
FBS (fötales Rinderserum) Good FortePAN-Biotech GmbH, Aidenbach, DeutschlandP40-47500
Filter 100 µ M VWR International Germany GmbH, Darmstadt, Deutschland732-2758
Imaris Bildanalysesoftware 9.0.2Bitplane AG, Zürich, Schweizn.a.ImspectorPro
softwareAbberior Instruments GmbH, Gö ttingen, Deutschlandn.a.Ketamin
 Inresa Arzneimittel GmbH, Freiburg, Deutschland3617KET-V
LaVision UltraMicroscope IILaVision BioTec GmbH, Bielefeld, Deutschlandn.a.MACS
MultiStandMiltenyi Biotech GmbH, Bergisch-Gladbach, Deutschland130-042-303
Multifly Kanüle 20 GSarstedt AG & Co., Nü mbrecht, Deutschland851638035
30 G NadelB. Braun Melsungen AG, Melsungen, Hessen, Deutschland9161502
Neubauer ZählkammerneoLab Migge GmbH, Heidelberg, DeutschlandC-1003
Pattex GlueHenkel AG & Co, Dü sseldorf, DeutschlandPSK1C
LS SäuleMiltenyi Biotech GmbH, Bergisch-Gladbach, Deutschland130-042-401
Lymphozytentrennmedien (Dichte 1.077 g/ml)anprotecAC-AF-0018
PapainMerck1.071.440.025
PBS Dulbecco (phosphatgepufferte Kochsalzlösung)Biochrom GmbH, Berlin, DeutschlandL182-10
PerCP/Cy5.5 Anti-Human-CD4BioLegend, San Diego, USA317428
PerCP/Cy5.5 Maus IgG2b, κ Isotyp CtrlBioLegend, San Diego, USA400337
PFA (Paraformaldehyd)Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Deutschland0335.1
KaliumhydrogencarbonatCarl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, DeutschlandP7481
Serologische Pipette 10 mLSarstedt AG & Co., Nü mbrecht, Deutschland86.1254.001 
Spritze 1 mLB. Braun Melsungen AG, Melsungen, Hessen, Deutschland9166017V
Spritze 5 mLBecton, Dickinson and Company, Franklin Lakes, USA260067
Spritze 20 mLBecton, Dickinson and Company, Franklin Lakes, USA260069
Sonde 1,5 mLSarstedt AG & Co., Nü mbrecht, Deutschland72.706.400
Röhrchen 2 mLSarstedt AG & Co., Nü mbrecht, Deutschland72.695.400 
Röhrchen 2 mL, braunSarstedt AG & Co., Nü mbrecht, Deutschland72.695.001
Röhrchen 15 mLSarstedt AG & Co., Nü mbrecht, Deutschland62.554.502 
Röhrchen 50 mLSarstedt AG & Co., Nü mbrecht, Deutschland62.547.254 
QuadroMACS SeparatorMiltenyi Biotech GmbH, Bergisch-Gladbach, Deutschland130-090-976
Xylazin (Rompun 2%)Bayer Vital GmbH, Leverkusen, DeutschlandKPOBD32

Referenzen

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