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Methodenartikel

Zwei-Schiff Okklusion Mausmodell der zerebralen Ischämie-reperfusion

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DOI:

10.3791/59078

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1. März 2019

 ,  , 
1Research Center of Translational Imaging, College of Medicine, Taipei Medical University, 2Radiogenomic Research Center, Taipei Medical University Hospital, Taipei Medical University, 3Department of Radiology, School of Medicine, College of Medicine, Taipei Medical University, 4Department of Medical Imaging, Taipei Medical University Hospital, Taipei Medical University, 5Department of Medical Research, Taipei Medical University Hospital, Taipei Medical University, 6Department of Surgery, School of Medicine, College of Medicine, Taipei Medical University, 7Division of General Surgery, Department of Surgery, Taipei Medical University Hospital

* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Ein Maus-Modell der zerebralen Ischämie-Reperfusion wird gegründet, um die Pathophysiologie des Schlaganfalls zu untersuchen. Wir nach distal verbinden rechts mittlere zerebrale Arterie und rechts gemeinsame Halsschlagader und Blutfluss nach 10 oder 40 min der Ischämie wiederherstellen.

Zusammenfassung

In dieser Studie wird eine mittlere zerebrale Arterie (MCA) Okklusion Mausmodell eingesetzt, um zerebrale Ischämie-Reperfusion zu studieren. Eine reproduzierbare und zuverlässige Maus-Modell eignet sich zur Untersuchung der Pathophysiologie der zerebralen Ischämie-Reperfusion und mögliche therapeutische Strategien für Patienten mit Schlaganfall zu ermitteln. Variationen in der Anatomie des Kreises von Willis C57BL/6 Mäusen beeinflusst ihr Infarkt-Volumen nach zerebraler Ischämie-induzierte Verletzung. Studien haben gezeigt, dass distale MCA-Verschluss (MCAO) kann dieses Problem überwinden und eine stabile Infarkt-Größe. In dieser Studie stellen wir ein zwei-Schiff Okklusion Mausmodell der zerebralen Ischämie-Reperfusion durch die Unterbrechung des Blutflusses zu den richtigen MCA. Wir verbinden die richtige MCA und rechts gemeinsame Halsschlagader (CCA) nach distal und Wiederherstellung der Durchblutung nach einer gewissen Zeit der Ischämie. Diese Ischämie-Reperfusion Verletzungen induziert ein Infarkt stabile Größe und ein Verhaltens Defizit. Peripheren Immunzellen infiltrieren die ischämische Gehirn Infiltration innerhalb von 24 h. Darüber hinaus ist der neuronale Verlust im kortikalen Bereich weniger für eine längere Dauer der Reperfusion. Daher eignet sich dieses zwei-Schiff Okklusion-Modell für die Untersuchung der Immunantwort und neuronale Erholung im Bezugszeitraum nach zerebraler Ischämie Reperfusion.

Einleitung

Der zerebralen Ischämie-Reperfusion-Maus-Modell ist eines der am weitesten verbreitete experimentelle Ansätze zur Untersuchung der Pathophysiologie der Ischämie-induzierte Gehirn Verletzungen1. Da zerebraler Ischämie-Reperfusion der peripheren Immunsystem aktiviert, peripheren Immunzellen in das ischämische Gehirn zu infiltrieren und verursachen neuronale Schäden2. Daher ist eine zuverlässige und reproduzierbare Mausmodell, die zerebrale Ischämie-Reperfusion imitiert erforderlich, um die Pathophysiologie des Schlaganfalls zu verstehen.

C57BL/6J (B6) Mäuse sind die am häufigsten verwendeten Dehnung in Schlaganfall-Experimente, weil sie genetisch leicht manipuliert werden können. Stehen zwei gemeinsame Modelle von MCAO/Reperfusion, die den Zustand der zerebralen Ischämie-Reperfusion zu imitieren. Das erste ist das Intraluminal Filament Modell des proximalen MCAO, wo ein Silikon-beschichtete Faden eingesetzt wird, um den Blutfluss in die MCA intravascularly verdecken; die verschließenden Filament wird anschließend entfernt, um Blut fließen3wiederherzustellen. Eine kurze Okklusion Dauer führt zu einer Läsion der subkortikalen Region, während eine längere Dauer der Okklusion Infarkte in den kortikalen und subkortikalen Bereichen verursacht. Das zweite Modell ist die Ligatur-Modell der distalen MCAO, einhergehende extravascular Ligatur der MCA und CCA, den Blutfluss durch die MCA zu reduzieren, nach der Blutfluss durch die Entfernung des Nahtmaterials und Aneurysmen Clip4wiederhergestellt wird. In diesem Modell ein Infarkt wird in den kortikalen Bereichen verursacht, und die Sterblichkeit ist gering. Da die Ligatur der MCAO/Reperfusion Modell Kraniektomien Ortsbild des distalen MCA aussetzen erfordert, kann die Website leicht bestätigt werden, und prüfen, ob die Durchblutung in den distalen MCA während des Verfahrens unterbrochen wird ist einfach.

B6-Mäuse zeigen erhebliche Unterschiede in der Anatomie der Kreis von Willis; Dies beeinträchtigt das Infarkt-Volumen nach zerebraler Ischämie-Reperfusion5,6,7. Derzeit kann dieses Problem durch Unterbindung der distalen MCA8überwunden werden. In dieser Studie stellen wir eine Methode für die MCA-Durchblutung zubeißt und damit nach einer vorgegebenen Zeitspanne Ischämie Reperfusion. Zwei-Schiff-Okklusion des zerebralen Ischämie-Reperfusion Modells induziert transiente Ischämie des Gebietes der MCA durch Unterbindung des rechten distalen MCA und richtige CCA mit Blutfluss wiederhergestellt nach einer gewissen Zeit der Ischämie. Dieses Modell MCAO/Reperfusion induziert ein Infarkt stabile Größe, ein Großteil der Gehirn-infiltrieren Immunzellen im ischämischen Gehirn und einem Verhaltens Defizit nach zerebraler Ischämie-Reperfusion4.

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Protokoll

Die institutionelle Pflege der Tiere und Nutzung Ausschüsse der Academia Sinica und Taipei Medical University genehmigt dieses Protokolls für den Einsatz von Versuchstieren.

(1) MCAO/Reperfusion Modell

  1. Geben Sie die Mäuse mit freiem Zugang zu Wasser und Chow, bis die Operation.
  2. Autoklaven der chirurgische Werkzeuge und desinfizieren Sie den OP-Tisch und Ausrüstung mit 70 % Ethanol. Tragen Sie einen Mundschutz und sterile Handschuhe. Verwenden Sie ein trockenes Korn-Sterilisator, um chirurgische Instrumente restilisieren, wenn mehrere Maus-Operationen in einem Experiment durchgeführt werden.
  3. Eine 8 bis 12 Woche alte Maus zu betäuben (Masse: 25 – 30 g) mit 0,8 % Chloral Hydrate, über eine intraperitoneale Injektion. Stellen Sie sicher, dass die narkotisierten Maus nicht über ein Pedal Reflex (wie mit einer festen Fuß Klemme getestet) nach der Anesthetization.
  4. Verwenden Sie Tierarzt Salbe, um Augentrockenheit für die Maus zu verhindern, während es unter Narkose ist.
  5. Verwenden Sie eine nicht-invasive Blutdruck-System, um die Maus Blutdruck zu überwachen.
  6. Verwenden Sie ein physiologische monitoring-System zur Überwachung der Rektaltemperatur und arteriellen Blutgase. Aufrechterhaltung der Körpertemperatur auf 36,5 ± 0,5 ° C.
  7. Subkutan injizieren Sie die Maus mit einem prophylaktische Antibiotika (25 mg/kg Cefazolin)8.
  8. Platzieren Sie den Mauszeiger in die Rückenlage auf das Heizkissen.
  9. Verwenden Sie elektrischen Haarschneider, um die Haut durch das Rasieren der Maus Fell auf dem ventralen Halsbereich, sowie in der Region zwischen dem rechten Auge und Ohr verfügbar zu machen.
  10. Verwenden Sie Epilieren Creme, das Fell vom Körper der Maus und desinfizieren der Operationsstelle abwechselnd Scrbus mit Povidione-Jod und 70 % Ethanol.
  11. Mit Iris einer Schere schneiden Sie einen 1 cm langen Mittellinie Schnitt am Hals.
  12. Verwenden Sie Iris Zange vorsichtig frei von Vagus Nerven CCA sezieren ohne physische Verletzungen.
  13. Verwenden Sie 5-0 Seide Nähte, um CCA zu isolieren.
  14. Machen Sie einen 0,3 cm Schnitt in der Kopfhaut in der Mitte zwischen dem rechten Auge und Ohr.
  15. Verwenden Sie Microscissors, um die Temporalis Muskel um das Jochbein und squamosal Knochen freizulegen geschnitten.
  16. Verwenden Sie unter einem Stereomikroskop sezierenden eine Microdrill um eine 2 mm Durchmesser-Loch direkt über der rechten distalen MCA zu erstellen.
  17. Verbinden Sie den Kofferraum des rechten distalen MCA mit einer 10-0-Naht.
  18. Verdecken Sie mit Hilfe eines nichttraumatischen Aneurysma-Clips rechts CCA.
  19. Entfernen Sie nach 10 oder 40 min Ischämie Aneurysma-Clips und Naht Blutfluss in der MCA und CCA wiederherstellen.
  20. Verwenden Sie einen Naht Clip, um der Hautschnitt auf den Kopf zu versiegeln.
  21. Versiegeln Sie die zervikalen Hautschnitte mit einer einzigen Naht gefolgt von Halshaut mit Naht oder Grundnahrungsmittel9schließen.
  22. Buprenorphin (0,1 mg/kg) für Pain Relief9subkutan zu injizieren.
  23. Halten Sie die Maus Körpertemperatur auf 36,5 ± 0,5 ° C auf das Heizkissen, bis es vollständig aus der Narkose erholt hat. Das Tier, das Operation, um die Gesellschaft anderer Tiere durchlaufen hat, bis es vollständig erholt hat nicht zurück. Nicht unbeaufsichtigt lassen das Tier bis es ausreichend Bewusstsein wiedererlangt.
  24. Platzieren Sie den Mauszeiger in den Autoklaven Käfig, so dass es frei Zugang zu Wasser und Essen gehen, nachdem es vollständig erholt hat.

2. Färbung mit 2,3,5-Triphenyltetrazolium Chlorid

  1. Die Maus mit 0,8 % Chloral Hydrate über eine intraperitoneale Injektion zu betäuben.
  2. Verwenden Sie operative Schere, um das Tier zu enthaupten.
  3. Setzen Sie den Schädel mithilfe von Iris-Schere, um einen Einschnitt in die Haut des Kopfes zu machen.
  4. Mit operativen einer Schere schneiden Sie den vorderen Stirnbein.
  5. Verwenden Sie Iris-Schere zum Schneiden des Schädels entlang die sagittale Naht.
  6. Verwenden Sie einen Knochen Rongeur, beiseite schieben, die frontalen und parietalen Knochen und setzen das Gehirn.
  7. Verwenden Sie Iris Zange, um das Gehirn sezieren.
  8. Verwenden Sie eine Maus-Gehirn-Matrix und Rasierklingen, um 2 mm koronalen Scheiben zu erhalten.
  9. Färben Sie die Gehirnscheiben für 10 min bei 37 ° C mit 2 % 2,3,5-Triphenyltetrazolium-Chlorid (TTC) in 1 x Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung.
  10. Spülen Sie das Gehirn 2 X mit 10 % Formalin.
  11. Befestigen Sie das Gehirn in 10 % Formalin bei Raumtemperatur für 24 h.

3. Messung der Infarkt Größe

  1. Ordnen Sie die Abschnitte auf eine saubere Kunststoff Folie und orientieren Sie Querschnitte von rostral kaudalen.
  2. Scannen Sie die Folie mit Hilfe eines Scanners. Ein metrischen Lineal und stellen Sie sicher, dass es im gescannten Bild sichtbar ist. Die Folie umdrehen und die Rückseite zu scannen.
  3. Berechnen Sie die Infarkt-Fläche der einzelnen Abschnitte mit ImageJ-Software.
    1. Öffnen Sie die Image-Datei und richten Sie die Skala für das Bild.
    2. Verwenden Sie Freihandauswahl um den Infarkt-Bereich auszuwählen.
    3. Verwenden der Regionen von Interesse (ROI)-Manager, um den gewünschten Bereich zu messen.
  4. Summe der Infarkt-Bereiche für jeden Abschnitt und multiplizieren Sie das Ergebnis durch die Schnittdicke, das totale Infarkt Volumen zu schätzen.

4. statistische Analyse

  1. GraphPad Prism 6 verwenden, um festzustellen, die statistische Signifikanz mit der Student t-test.
    Hinweis: Die Fehlerbalken auf die Balkendiagramme darstellen Standardfehler des Mittelwerts (SEMs).
  2. Verwendung G * Power 3.1 zu den entsprechenden Stichprobenumfang ermitteln und führen Sie einen Power-Analyse-10.

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Ergebnisse

Dieses MCAO/Reperfusion Verfahren produziert eine kortikale Infarkt in der Nähe der richtigen MCA und verursacht ein Verhaltens Defizit. Verschiedene Grade der Ischämie-induzierte Infarkt Volumen (Abb. 1AB) und neuronaler Verlust (Abbildung 1D) entstanden in der Hirnrinde des MCA-rechts durch eine Erhöhung der Ligatur Dauer. Dieser MCAO/Reperfusion Verletzungen verringert das Tier lokomotorischen...

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Diskussion

Die MCAO/Reperfusion-Maus-Modell ist ein Tiermodell häufig eingesetzt, um transiente Ischämie bei Menschen zu imitieren. Dieses Tiermodell kann auf transgenen und Knockout-Mäusen Stämme zu untersuchen, die Pathophysiologie des Schlaganfalls angewendet werden. Besonders kritisch sind mehrere Schritte im Protokoll. (1) die Microdrill muss vorsichtig verwendet werden, wenn Sie ein Loch in den Schädel, mit unangemessene Handlung leicht verursachen Blutungen aus der MCA erstellen. (2) die MCA dürfen nicht beschädigt, und Blut...

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Offenlegungen

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Danksagungen

Diese Arbeit wurde durch das Ministerium für Wissenschaft und Technologie, Taiwan (am meisten 106-2320-B-038-024, die meisten 105-2221-E-038-007-MY3 und die meisten 104-2320-B-424-001) und Taipei Medical University Hospital (107TMUH-SP-01) unterstützt. Dieses Manuskript wurde von Wallace wissenschaftliche Bearbeitung bearbeitet.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
KnochenrongeurDienerFriedman
BuprenorphinSigmaB-044
CefazolinSigma1097603
ChloralhydratSigmaC8383
DissektionsmikroskopNikonSMZ-745
Elektrische HaarschneidemaschinePetpro
10% FormalinSigmaF5304
Germinator TrockenperlensterilisatorBraintree Scientific
IriszangeKarl Klappenecker10 cm
IrisschereDiener9 cm
Irisschere STRKarl Klappenecker11 cm
MicrodrillStoeltingFOREEDOM K.1070
Mikroschere-VannasHEISSH-4240Klinge 7mm, 8 cm
Maus Gehirn MatrixWorld Precision Instruments
Nicht-invasives BlutdrucksystemMuromachiMK-2000ST
Operationsschere STRKarl Klappenecker14 cm
Physiologisches ÜberwachungssystemHarvard Apparat
Rasierer KlingenEver-Ready
Stoelting NagetierwärmerStoelting53810Heizkissen
NahtclipStoelting
PinzetteIDEALTEKNo.3
Vetbond3M15672Chirurgischer Kleber
10-0 NahtUNIKNT0410
2,3,5-Triphenyltetrazolium ChloridSigmaT8877

Referenzen

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