Der Erfolg eines seriellen Femtosekunden zeitaufgelöste Kristallographie Experiments ist effiziente Musterlieferung abhängig. Hier beschreiben wir Protokolle, um die Extrusion von Bakteriorhodopsin Mikrokristalle aus eine hohe Viskosität Mikro-Extrusion Injektor zu optimieren. Die Methodik setzt auf Probe Homogenisierung mit einem neuartigen Dreiwege Kupplung und Visualisierung mit einer Highspeed-Kamera.
Ein Abonnement von JoVE ist erforderlich, um diesen Inhalt anzuzeigen. Melden Sie sich an oder beginnen Sie noch heute mit einer kostenlosen Testphase.
Methodenartikel
Verbesserung der hohen Viskosität Extrusion der Mikrokristalle für zeitaufgelöste serielle Femtosekunden Kristallographie an x-ray Laser
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Hoher Viskosität Mikro-Extrusion Injektoren haben dramatisch Probe in seriellen Femtosekunden kristallographischen Experimente (SFX) auf Röntgen-freie-Elektronen-Laser (XFELs) reduziert. Eine Reihe von Experimenten mit der lichtgetriebenen Proton Pumpe Bakteriorhodopsin haben als bevorzugte Option Kristalle für serielle Femtosekunden zeitaufgelöste Kristallographie (TR-SFX) strukturelle Veränderungen des aufzulösenden liefern diese Injektoren festgestellt Proteine nach Photoaktivierungen. Um mehrere strukturelle Momentaufnahmen von hoher Qualität zu erhalten, ist es wichtig, große Mengen an Daten zu sammeln und Abfertigung der Kristalle zwischen jedem Laserpuls Pumpe zu gewährleisten. Hier beschreiben wir ausführlich, wie wir die Extrusion von Bakteriorhodopsin Mikrokristalle für unsere jüngsten TR-SFX-Experimente an Linac kohärentes Licht Quelle (LCLS) optimiert. Das Ziel der Methode ist es, Extrusion für eine stabile und kontinuierliche Strömung unter Beibehaltung einer hohen Dichte von Kristallen, die Rate zu erhöhen optimieren experimentieren, auf welche Daten in einem TR-SFX aufgefangen werden können. Dieses Ziel erreichen wir durch die Ausarbeitung von Lipid-kubische Phase mit einer homogenen Verteilung der Kristalle mit einer neuartigen Dreiwege Spritze Gerät gefolgt durch Anpassen der Probenzusammensetzung basierend auf Messungen der Extrusion Stabilität genommen mit einer Highspeed-Kupplung Kamera-Setup. Die Methodik kann den Fluss der anderen Mikrokristalle optimieren angepasst werden. Das Setup wird für die Nutzer der neuen Schweizer freie-Elektronen-Laser-Anlage zur Verfügung.
Einleitung
Serielle Femtosekunden Kristallographie (SFX) ist eine strukturelle Biologie-Technik, die die einzigartigen Eigenschaften des Röntgen-freie-Elektronen-Laser (XFEL) auf Raumtemperatur Strukturen bestimmen nutzt aus Tausenden von Mikrometer große Kristalle während schneller als die meisten die Strahlenschäden durch den "Beugung vor Zerstörung" Prinzip1,2,3.
In einer zeitaufgelösten Verlängerung von SFX (TR-SFX) dienen der Femtosekunden-Impulse aus der XFEL, strukturelle Veränderungen in Proteine4,5....
Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Protokoll
(1) Protein Crystal Probenvorbereitung
- Ca. 30 min vor die Probe injiziert werden, basieren Last 50 µL Kristall-beladenen Monoolein LCP in einer 100 µL Spritze.
- Für die Injektion bei Atmosphärendruck: Last 10 µL Paraffinöl in die Rückseite einer zweiten Spritze. Vertreiben Sie die Spritze senkrecht halten, die Luftblasen aus der Spritze.
- Für die Injektion in Vakuum: Last 5 µL MAG 7,9 und 5 µL Paraffinöl in die Rückseite einer zweiten Spritze. Vertreiben Sie die Spritze senkrecht halten, die Luftblasen aus der Spritze.
- Verbinden Sie die Spritze mit Paraffin/MAG 7,9 auf eine standard-Spritze-Koppler, die Luft aus der Kup....
Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Ergebnisse
Das ideale Ausgangsmaterial für die hier beschriebenen Verfahren (Abbildung 3) sind hohe Dichten von Mikrokristalle in viskosen Trägermedium für die Einspritzdüse integriert. Das Verfahren erfordert etwa 50 µL Kristall beladenem Träger für jede Zubereitung. Diese können direkt im LCP als mit dem bR-9,-10 diente hier als Beispiel (Abbildung 4), oder Kristalle gewachsen in .......
Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Diskussion
Die TR-SFX-Methode mit dem zähflüssigen Extrusion Injector erweist sich eine praktikable Technik für Strukturdynamik Studien Bakteriorhodopsin9,10 und Photosystem II13 und jetzt scheint bereit, fahren andere Proteine zu studieren Foto biologischen Prozessen wie lichtgetriebenen Ionentransport oder Sinneswahrnehmung5,50. Die oben beschriebenen Protokolle wurden entwickelt, um den Er.......
Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Offenlegungen
Die Autoren erklären keine widerstreitenden Interessen.
Danksagungen
Wir erkennen Gebhard Schertler, Rafael Abela und Chris Milne zur Unterstützung des Einsatzes von hoher Viskosität Injektoren am PSI. Richard Neutze und sein Team sind für Diskussionen über die zeitaufgelöste Kristallographie und Probeneingang mit hoher Viskosität Injektoren anerkannt. Für die finanzielle Unterstützung, wir erkennen den Schweizerischen Nationalfonds für Zuschüsse 31003A_141235, 31003A_159558 (zu j.s.) und PZ00P3_174169 (um P.N.). Dieses Projekt wird finanziell von der Europäischen Union Horizont 2020 Forschungs- und Innovationsprogramm unter Marie Sklodowska-Curie-Stipendium Vereinbarung Nr. 701646.
....Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| Mosquito LCP Spritzenkupplung | TTP labtech store | 3072-01050 | |
| Hamilton Spritze 1710 RNR, 100 & micro; l | Hamilton | HA-81065 | |
| Hamilton Spritze 1750 RNR, 500 µ l | Hamilton | HA-81265 | |
| Monoolein | Nu-Chek Prep, Inc. | M-239 | |
| 7.9 MAG | Avanti Polare Lipide Inc. | 850534O | |
| 50% w/v PEG 2000 | Molekulare Abmessungen | MD2-250-7 | |
| Paraffin (flüssig) | Sigma-Aldrich | 1.07162 | |
| Hochgeschwindigkeitskamera | Photron | Photron Mini AX | |
| Objektiv mit hoher Vergrößerung | Navitar | 12X Zoom Objektivsystem | |
| Dreiachsiger Tisch | ThorLabs | PT3/M | |
| Faserlicht | Thorlabs | OSL2 | |
| Quarzglasfaser | Molex / Polymicro | TSP-505375 | |
| Lite Touch-Ferrule | IDEX | LT-100 | |
| ASU Injektor mit hoher Viskosität | Arizona State University | Erhältlich bei Uwe Weierstall (weier@asu.edu) | |
| HPLC-Pumpe | Shimadzu | LC-20AD | |
| Elektronischer Gasregler | Anteil Luft | GP1 |
Referenzen
- Neutze, R., Wouts, R., van der Spoel, D., Weckert, E., Hajdu, J. Potential for biomolecular imaging with femtosecond X-ray pulses. Nature. 406 (6797), 752-757 (2000).
- Chapman, H. N., et al. Femtosecond X-ray protein nanocrystallography. Nature. 470 (7332), 73-77 (2011).
- B....
Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Nachdrucke und Genehmigungen
