Wirkung von Anti-c-Fms-Antikörper auf Osteoklasten Bildung und Verbreitung von Osteoklasten-Vorläufer In-vitro-

Zusammenfassung

Dieses Protokoll enthält Dissektion der murinen langen Knochen und Knochenmark isoliert, Knochenmark Makrophagen zu generieren und produzieren Osteoklasten mit Makrophagen-Kolonie-stimulierende Faktor (M-CSF) und Rezeptor Aktivator des nuklearen Faktor Kappa B Ligand (RANKL) oder Tumor-Nekrose-Faktor Alpha (TNF-α) und ihre Verhaftung durch Anti-c-Fms Antikörper, M-CSF Rezeptor.

Zusammenfassung

Knochenaufbau ist ein komplexer Prozess, und es handelt sich um Zeiträume von Ablagerung und Resorption. Knochenabbau ist ein Prozess, durch den Knochen durch Osteoklasten in Reaktion auf verschiedene Reize abgebaut wird. Osteoklasten-Vorläufer differenzieren Multikern Osteoklasten in Reaktion auf Makrophagen-Kolonie-stimulierende Faktor (M-CSF) und Rezeptor Aktivator des nuklearen Faktor Kappa B Ligand (RANKL). Unter pathologischen Bedingungen das Zytokin-Profil ist anders und beinhaltet eine Mischung von inflammatorischen Zytokinen. Tumor-Nekrose-Faktor Alpha (TNF-α) ist eines der wichtigsten Zytokine wie es in großen Mengen in den Bereichen mit entzündlichen Osteolyse gefunden wird. Der Zweck dieses Protokolls ist, ein Verfahren bereitzustellen, mit denen murinen Knochenmark isoliert ist, um Osteoklasten durch Induktion mit M-CSF und RANKL oder TNF-α, anschließend gehemmt wird, durch steigende Dosen des Antikörpers Anti-c-Fms, den Rezeptor, zu generieren für M-CSF. Dieses Experiment zeigt den therapeutischen Wert des Antikörpers Anti-c-Fms bei Erkrankungen des entzündliche Knochenabbau.

Einleitung

Osteoklasten sind hoch spezialisierte Zellen, und sie unterscheiden von hämatopoetischen Stammzellen durch die Verschmelzung von mehreren Osteoklasten-Vorläufer. Sie sind unerlässlich für gesunden Knochenaufbau und tragen zur pathologischen Knochenabbau osteolytischen Entzündungskrankheiten wie rheumatoide Arthritis und Parodontitis¹zugeordnet.

Osteoclastogenesis und Osteoklasten Funktion sind durch zwei Schlüsselfaktoren vermittelt; Makrophagen-Kolonie-stimulierende Faktor (M-CSF) und Rezeptor Aktivator des nuklearen Faktor Kappa B Ligand (RANKL). M-CSF und RANKL sind wichtig für die Osteoklasten Differenzierung². Ein weiterer Faktor, das gezeigt worden ist, induzieren Osteoklasten-Formation von in-vitro-Knochenmark Makrophagen ist Tumor-Nekrose-Faktor alpha (TNF-α)^3,4,5. TNF-α vermittelten Osteoklasten Bildung kritisch für Osteolyse in destruktiver Knochenerkrankungen wie rheumatoider Arthritis⁶, Parodontitis⁷und postmenopausalen Osteoporose⁸gezeigt wurde.

C-Fms ist die Membran-Rezeptor von M-CSF und vermittelt seine Wirkung. Die Rolle des c-Fms ist in der Literatur gut dokumentiert, wie nachgewiesen wurde, dass die Verwaltung eines Antikörpers gegen c-Fms (Antikörper Anti-c-Fms) komplett verhaftet Osteoclastogenesis in einem Modell Arthritis sowie in TNF-α induzierte Knochen Erosionen während Osteoclastogenesis entfernte aus dem entzündeten Gelenk war noch robuste⁹. Verwaltung von Anti-c-Fms Antikörper gehemmt Osteoklasten Bildung und Knochen Resorption induziert durch Lipopolysaccharid (LPS) in Maus Calvariae¹⁰ ebenso wie LPS-induzierte Parodontitis Modell¹¹. Darüber hinaus gehemmt Antikörper Anti-c-Fms mechanische stressinduzierte Wurzelresorption während der kieferorthopädischen Zahn Bewegung¹²sowie kieferorthopädische Zahnbewegungen und Knochenabbau kieferorthopädischen Zahn Bewegung¹³zugeordnet.

M-CSF wurde berichtet, um andere Funktionen haben, die für die Host-Immunantwort unabdingbar sind. Das Fehlen von M-CSF bei Op/Op-Mäusen mit bakterieller Lungenentzündung führen zur Steigerung der bakteriellen Belastung und bakterielle Verbreitung in der Leber mit hepatischen Nekrose¹⁴. M-CSF ist daher wichtig für immunologische Reaktion beim Schutz vor Infektionen.

Diese Studie zeigt die Wirkung der Antikörper Anti-c-Fms auf M-CSF und RANKL oder TNF-α induzierte Osteoklasten Bildung in-vitro- und M-CSF induzierte Proliferation von Osteoklasten-Vorläufer. Dieses Protokoll zeigt die Isolation der murinen Knochenmarkzellen von Röhrenknochen, und die Schritte des Knochenmarks Makrophagen (BMM) generiert, die als Osteoklasten-Vorläufer gelten und induzieren die Differenzierung der BMM in Multikern Osteoklasten durch zwei Methoden; RANKL oder TNF-α. Das Protokoll wird auch die Verhaftung von Osteoclastogenesis bei beiden Methoden mit Anti-c-Fms Antikörper verglichen.

Der Prozess mit dem Knochenmark extrahiert und anschließend zur Erzeugung von Osteoklasten-Vorläufer ist zuverlässig in der Herstellung von großen Mengen des reinen Osteoklasten-Kulturen, die in mehrere downstream-Anwendungen wie Drogentests verwendet werden können. Die Verwendung von RANKL oder TNF-α induzieren Osteoclastogenesis in diesem Protokoll unterscheidet Osteoclastogenesis als physiologische Prozess (RANKL) von Osteoclastogenesis als pathologische Prozess (TNF-α), was wiederum zwei alternative Verfahren führen die Entscheidung ist eine überlegene in Bezug auf die Reagenzien in downstream-Anwendungen verwendet werden. Dieses Protokoll bietet auch eine Methode, mit der wir eine geeignete Konzentration des Antikörpers Anti-c-Fms feststellen können, die für das spätere Studium Knochenabbau und osteolytischen Krankheiten beteiligt sicher verwendet werden kann.

Protokoll

Alle tierischen Verfahren und Pflege der Tiere wurden nach Tohoku Universität Regeln und Vorschriften durchgeführt.

(1) murinen Megalosauridae Dissektion und Handling

1. Füllen Sie vor Dissektion eine Platte mit etwa 50 mL der α-MEM abhängig von der Größe des Behälters und legen Sie ihn auf Eis. Dies wird als ein Auffangbehälter dienen, bis das Sezieren von allen Knochen abgeschlossen ist. Für diese und die folgenden verwenden Experimente, Sie α-MEM mit 10 % fetalen bovine Serum (FBS), 100 IU/mL Penicillin G und 100 μg/mL Streptomycin.
2. C57Bl/6J Maus durch Inhalation einer Überdosierung von 5 % Isofluran einschläfern.
3. Befestigen Sie die Maus in Rückenlage mit Nadeln durchbohrt die Handflächen und Füße und Spray gründlich mit 70 % Ethanol.
4. Einen Hautschnitt über sterile Chirurgische Scheren und Pinzetten auf der Ebene der Hüfte zu machen und bis zu den Füßen aussetzen der Muskeln zu verlängern.
5. Schneiden Sie die Sehne anbringen des Quadrizeps-Muskels und die Sehne anbringen die Kniesehne Muskeln bis auf die Knochen. Ziehen Sie die Muskeln, die Freilegung der Hüft-und Kniegelenke. Diese sehnen Ortung erleichtert beide Muskeln aus ihren Anlagen ohne Weichgewebe Tags zu befreien. Schneiden Sie nicht in den Knochen.
6. Positionieren Sie die Schere zwischen dem Kopf des Oberschenkelknochens und der Gelenkspalt und schneiden in den Oberschenkelknochen zu befreien, sondern halten die Knochen intakt. Damit wird die Ablösung der Knochen ohne das Risiko der Freilegung des Knochenmarks.
7. Ähnlich schneiden Sie die Muskeln an der Tibia anbringen. Schneiden der Tibia frei von seiner Anhaftung an das Sprunggelenk Knochen zur Vermeidung von Kontaminationen intakt zu halten.
8. Kratzen Sie alle verbleibenden Weichgewebe aus dem Femur und Tibia mit der Schere Messer und Windex und legen Sie sie in einen Teller mit α-MEM auf Eis gelegt.

(2) murinen Megalosauridae Knochenmark isoliert

1. Füllen Sie eine 30 G Nadel Spritze mit α-MEM.
2. Trennen Sie die Tibia und Femur entfernt das Kniegelenk.
3. Schneiden Sie die Enden der langen Knochen von beiden Seiten mit einer Schere.
4. Halten Sie die Knochen von der Welle mit einer Pinzette, stechen Sie die Nadel in den Knochenmark-Raum des Knochens und spülen Sie langsam den Inhalt des Knochenmarks in der Kulturschale 6 cm. Der Knochen erscheint weiß, die Gewinnung von Knochenmark Inhalte anzeigt. Wiederholen Sie für alle Knochen.
5. Belastung der Knochenmark-Extrakt mit einem 40 µm Nylon Zelle Sieb in eine konische Zentrifugenröhrchen 50 mL und Zentrifuge bei 300 X g für 5 min.
6. Den Überstand verwerfen, waschen mit 5 mL der α-MEM und Zentrifugieren bei 300 X g für 5 min. wiederholen Wash für insgesamt 2 Mal.
7. Aufschwemmen Sie das Pellet in 10 mL von α-MEM und führen Sie eine Anzahl Zellen mit einem Hemocytometer wie folgt:
   1. Machen Sie eine 1:1 Verdünnung der Zellsuspension durch Zugabe von 10 μl Zellsuspension auf 10 μL von 0,4 % Trypan blau in einem 1,5 mL Röhrchen und pipette einmal.
   2. Die Hemocytometer Kammer mit einer Schiebeabdeckung abdecken und die Farbstoff-Suspension auf die Hemocytometer übertragen. Es ist wichtig, nicht zu überfüllen oder underfill Kammer und erlauben die Aussetzung, die Kammer durch Kapillarwirkung zu füllen.
   3. Legen Sie die Hemocytometer auf einen Mikroskoptisch. Mit 10 X-Objektiv, konzentrieren Sie sich auf das mittlere Quadrat. Zählen Sie alle Zellen von 3 Zeilen gebunden. Um sicherzustellen, dass Zellen nicht zweimal gezählt werden, zählen Sie die oberen und rechten Ecken jedes Quadrats. Abgestorbenen Zellen erscheint dunkelblau, diese sind von der Zählung ausgeschlossen.
8. Abhängig von der nachgeschalteten Anwendung Samen der Zellen in einem entsprechenden Kulturgefäß. Folgen Sie für dieses besondere Experiment Abschnitt 3.

3. Generation der BMM

1. Samen 1 x 10⁷ Zellen/10 mL in ein 10 cm Kultur Schüssel und fügen Sie M-CSF 100 ng/mL. Die Endkonzentration von M-CSF ist 100 ng/mL Kulturmedium. Inkubieren Sie die Kultur bei 37 ° C, 5 % CO₂ für 3 Tage.
2. Nach 3 Tagen das Kulturmedium zu entfernen, die Zellen kräftig mit 10 mL von Phosphat gepufferte Kochsalzlösung (PBS) zweimal, nicht anhaftende Zellen zu entfernen, fügen Sie 5 mL Raumtemperatur 0,02 % Trypsin-EDTA in PBS waschen und Inkubation bei 37 ° C, 5 % CO₂ für 5 min.
3. Lösen Sie die Zellen, indem gründliche pipettieren. Stellen Sie sicher, dass die Zellen getrennt wurde, durch die Beobachtung der Kultur unter dem Mikroskop (die Zellen sollte abgerundete und schwebend in den Medien erscheinen). Wenn die Zellen nicht wegziehen lassen, wiederholen Sie pipettieren gründlich um sie zu lösen. Wenn die Zellen getrennt haben, fügen Sie 5 mL α-MEM, die Reaktion zu inaktivieren.
4. Sammeln Sie die Zellen in ein 50 mL konische Rohr und Zentrifuge bei 300 X g für 5 min. überstand verwerfen, und waschen Sie mit 5 mL der α-MEM.
5. 300 X g für 5 min Zentrifugieren und das Pellet in 10 mL von α-MEM aufzuwirbeln.
6. Führen Sie eine Zellzahl im Schritt 2.7.1 wie zuvor beschrieben.
7. Samen 1 x 10⁶ Zellen/10 mL in ein 10 cm Kultur Schüssel und fügen Sie M-CSF 100 ng/mL. Die Endkonzentration von M-CSF ist 100 ng/mL Kulturmedium. Inkubieren Sie die Kultur bei 37 ° C, 5 % CO₂ für 3 Tage.

4. Generation von Osteoklasten von BMM als Osteoklasten-Vorläufer

1. Ernten Sie nach 3 Tagen die angeschlossenen Zellen, die Osteoklasten-Vorläufer, folgende Schritte 3.2-3.7 BMM darstellen.
2. Samen BMM auf 5 x 10⁴ Zellen/200 μL der α-MEM in eine 96-well-Platte. Fügen Sie RANKL für eine Endkonzentration von 50 ng/mL oder TNF-α für eine Endkonzentration von 100 ng/mL. Geben Sie in jede M-CSF für eine Endkonzentration von 100 ng/mL.
3. Fügen Sie Anti-c-Fms-Antikörper (Endkonzentrationen von 0, 1, 10, 100, 1000 ng/mL) in jede Vertiefung.
4. Inkubation bei 37 ° C, 5 % CO₂ für 4 Tage. Medien täglich für 4 Tage zu wechseln.

5. Tartrat-resistente saure Phosphatase (TRAP) Fleck

1. Aspirieren Sie nach 4 Tagen Inkubation sanft das Kulturmedium von jedem Bohrloch. Waschen Sie nun einmal mit 200 μL der Raumtemperatur 1 X PBS.
2. Fügen Sie 200 μl 10 % Formalin in jede Vertiefung zur Fixierung und 1 h bei Raumtemperatur inkubieren. Aspirieren Sie der Formalin und waschen Sie jeweils gut 3 Mal mit entionisiertem Wasser.
3. Fügen Sie 200 μL von 0,2 % Triton x-100 mit PBS-Puffer zu jedem gut für Permeabilisierung und 1 h bei Raumtemperatur inkubieren. Aspirieren Sie der Triton x-100 und waschen Sie jeweils gut 3 Mal mit entionisiertem Wasser.
4. Fügen Sie 200 μL der TRAP-Fleck-Lösung in jede Vertiefung. Visualisieren Sie den Fleck unter dem Mikroskop. Es dauert 10-30 min für den Fleck richtig entwickeln.
5. Aspirieren Sie den Fleck und waschen jeweils gut mit entionisiertem Wasser 3mal, und an der Luft trocknen. Halten Sie bei Raumtemperatur, in weitere Beobachtungen zu verwenden.

6. Verbreitung Assay

1. Samen BMM als Osteoklasten-Vorläufer auf 5 x 10³ Zellen/200 μL der α-MEM in eine 96-well-Platte. Geben Sie in jede M-CSF für eine Endkonzentration von 100 ng/mL.
2. Fügen Sie Anti-c-Fms-Antikörper (Endkonzentrationen von 0, 1, 10, 100, 1.000 ng/mL) und Inkubation bei 37 ° C, 5 % CO₂ für 3 Tage ohne mittlere Änderung.
3. Nach 3 Tagen Waschen der Zellen mit 1 X PBS. Geben Sie in jedes 100 μL der α-MEM.
4. Hinzufügen von 10 μL der Zelle zählen Kit Lösung und Inkubation bei 37 ° C, 5 % CO₂ für 2 h und bestimmen die Extinktion von jedem Bohrloch bei 450 nm mit einer Mikrotestplatte Reader.

Ergebnisse

Dieses Protokoll dient zur Bewertung der Wirkung der Anti-c-Fms-Antikörper auf Osteoklasten Bildung in Gegenwart von RANKL oder TNF-α und die Wirkung von M-CSF auf Osteoklasten-Vorläufer-Verbreitung zu bestimmen. In diesem Protokoll haben wir einen zuverlässigen Prozess bereitgestellt, mit dem große Mengen von reinem Osteoklasten Kulturen entstehen. Wir haben auch eine Möglichkeit, Anti-c-Fms Antikörperkonzentration geeignet für Hemmung der Osteoklasten Formation unter verschiedenen Kultu...

Diskussion

In dieser Studie untersuchten wir die Wirkung des Antikörpers Anti-c-Fms auf Osteoklasten RANKL-induzierte Bildung, Bildung von TNF-α-induzierte Osteoklasten und M-CSF-induzierte Osteoklasten Vorläufer Verbreitung. Wir fanden, dass die wirksame Menge des Antikörpers Anti-c-Fms für die Hemmung des Osteoclastogenesis zwischen Osteoklasten RANKL-induzierte Bildung, TNF-α induzierte Osteoklasten Bildung und M-CSF-induzierte Proliferation von Osteoklasten-Vorläufer unterscheidet.

RANKL vermittelt O...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Anti-c-Fms-Antikörper			AFS98, ein monoklonaler, antimuriner c-Fms-Antikörper (IgG2a) an der RatteTNF
-& alpha;			Rekombinantes murines TNF-α in unserem Labor hergestellt. TNF-α cDNA-Fragment, das mittels RT-PCR kloniert und in ein pGEX-6P-I (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ) kloniert wurde, um ein GST-Fusionsprotein zu erzeugen. GST-TNF-α wurde in Escherichia coli BL21-Zellen (Stratagene, La Jolla, CA) exprimiert. Die Zellen wurden unter nichtdenaturierenden Bedingungen lysiert und GST-TNF-α wurde über eine Glutathion-Sepharose-Säule gereinigt. GST wurde durch PreScission Protease (Amersham Biosciences) vom Hersteller abgespalten." und wurde durch eine Glutathion-Sepharose-Säule entfernt.
RANKL	PEPROTECH	315-11	Rekombinanter muriner sRANK-Ligand, Quelle: E. coli
M-CSF			Rekombinantes humanes M-CSF. 1/10 vol von CMG14– 12 Zelllinien-Kulturüberstände bei 5x106  Zellen in einer 10 cm Suspensionskulturschale.
α-MEM	Wako		mit L-Glutamin und Phenolrot
Fötales Kälberserum	Biowest	s1820-500	Fötales Kälberserum Französische Herkunft
Kulturschale	Corning		100 mm x 20 mm Style Schale
96-Well-Platte	Thermofischer Scientific		Nun Clon Delta
Oberfläche Zellzählkit-8	Dojindo, Kumamoto, Japan
Mikroplatten-Reader	Sunrise REMOTE; Tekan Japan, Kawasaki, Japan
Zellsieb	Corning		40 μ m Nylon
Zentrifugenröhrchen	Corning		50 mL CentriStar Kappe
Triton X-100	Wako		Polyoxyethylen (10) Octyphenylether