Method Article

Charakterisierung von Histon Post-translationale Modifikation Veränderungen in Hefe Neurodegenerative Proteinopathy Modelle

DOI:

10.3791/59104

⸱

March 24th, 2019

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Chemistry Department, Brooklyn College, 2Ph.D. Program in Biochemistry, Graduate Center of the City University of New York, 3Ph.D. Program in Chemistry, Graduate Center of the City University of New York, 4Ph.D. Programs in Chemistry, Biochemistry, and Biology, Graduate Center of the City University of New York

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dieses Protokoll beschreibt experimentelle Verfahren zur Charakterisierung von genomweiten Änderungen in der Höhe von Histon post-translationalen Modifikationen (PTM) in Verbindung mit der Überexpression der Proteine zugeordnet ALS und Parkinson in auftretenden Saccharomyces Cerevisiae Modelle. Nach der Trennung der SDS-PAGE werden einzelne Histon PTM Ebenen mit Modifikation-spezifische Antikörper über Western blotting erkannt.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Neurodegenerative Erkrankungen wie Amyotrophe Lateralsklerose (ALS) und der Parkinson-Krankheit (PD), verursachen den Verlust von Hunderten von Tausenden von Menschenleben pro Jahr. Es fehlen wirksame Behandlungsmöglichkeiten in der Lage, das Fortschreiten der Krankheit zu stoppen. Trotz der umfangreichen Sequenzierung Bemühungen in großen Patientenkollektiven sind zum Großteil ALS auch PD durch eine genetische Mutation allein ungeklärt. Epigenetik-Mechanismen, wie die Post-translationale Modifikation der Histonproteine, können bei neurodegenerativen Krankheit Ätiologie und Progression einbezogen werden und führen zu neuen Zielen für pharmazeutische Intervention. Säugetieren in vivo und in vitro-Modelle ALS auch PD sind teuer und erfordern oft langen und mühsamen experimentelle Protokolle. Hier beschreiben wir einen praktische, schnellen und kostengünstigen Ansatz zur Bestimmung der genomweiten Veränderungen in Histon Modifikation Ebenen mit Saccharomyces Cerevisiae als Modellsystem. Dieses Protokoll ermöglicht umfassende Untersuchungen in epigenetische Veränderungen verbunden, Neurodegenerative Proteinopathies, die bisherigen Ergebnisse in verschiedenen Modellsysteme bestätigen, während deutlich erweitern unser Wissen der Neurodegenerative Krankheit Epigenom.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Neurodegenerative Krankheiten sind verheerende Krankheiten mit wenig bis keine Behandlungsmöglichkeiten zur Verfügung. Unter diesen sind die Amyotrophe Lateralsklerose (ALS) und der Parkinson-Krankheit (PD) besonders schrecklich. Etwa 90 % der Fälle ALS und PD gelten nur sporadisch, auftritt ohne Familiengeschichte der Krankheit, während die übrigen Fälle in der Familie und sind in der Regel auf ein bestimmtes Gen Mutation1,2verbunden. Interessanterweise sind beide dieser Krankheiten verbunden mit Protein Mislocalization und Aggregation3,4,5,6. Zum Beispiel in Sarkom (FUS) verschmolzen und TAR DNA-bindendes Protein 43 (TDP-43) sind RNA-bindende Proteine, die mislocalize, Zytoplasma und aggregieren ALS7,8,9,10, 11,12, während α-Synuclein das Prinzip Komponente proteinhaltige Aggregate Lewy-Körper in PD5,13,14,15bezeichnet.

Trotz der umfangreichen genomweite Bemühungen in großen Patientenkollektiven sind die überwiegende Mehrheit der Fälle ALS und PD genetisch ungeklärt. Kann Epigenetik Neurodegenerative Erkrankung eine Rolle? Epigenetik umfasst Änderungen im Genausdruck auftritt ohne Änderungen auf zugrunde liegende DNA-Sequenz16. Ein wichtigste epigenetischer Mechanismus beinhaltet die post-translationalen Modifikationen (PTMs) Histon-Proteine-16. In eukaryotischen Zellen ist genetisches Material in Chromatin fest gewickelt. Die Basiseinheit von Chromatin ist das Nukleosom, bestehend aus 146 Basenpaare der DNA umwickelt ein Histon-Octamer, bestehend aus vier Paare von Histonen (jeweils zwei Kopien der Histone H2A, H2B, H3 und H4)17. Jedes Histon hat eine N-terminale Endstück, das ragt aus dem Nukleosom und kann durch die Zugabe von verschiedenen chemischen Moieties, in der Regel auf Lysin und Arginin Rückstände18geändert werden. Diese PTMs sind dynamisch, d.h. sie können leicht hinzugefügt und entfernt und gehören Gruppen wie Acetylierung, Methylierung, Phosphorylierung. PTMs die Zugänglichkeit der DNA auf die transkriptionelle Maschinen zu kontrollieren, und damit Kontrolle gen Ausdruck18. Z. B. Histon Acetylierung verringert die Festigkeit der elektrostatischen Wechselwirkung zwischen dem stark grundlegende Histon Protein und negativ geladenen DNA Rückgrat, so dass die Gene verpackt durch acetylierte Histone mehr zugänglich zu machen und damit hoch 19ausgedrückt. Vor kurzem hat die bemerkenswerte biologische Besonderheit des bestimmten Histon PTMs und deren Kombinationen führten zu die Histon-Code-Hypothese20,21 in welche Proteine, die schreiben, löschen und lesen Histon PTMs alle an einem Strang zu ziehen Genexpression zu modulieren.

Hefe ist ein sehr nützliches Modell Neurodegeneration zu studieren. Wichtig ist, sind viele neuronale zelluläre Signalwege von Hefe zu Menschen22,23,24konserviert. Hefe rekapitulieren Zytotoxizität Phänotypen und Protein Einschlüsse bei Überexpression von FUS, TDP-43 oder α-Synuclein22,23,24,25,26. In der Tat wurden Saccharomyces Cerevisiae Modelle Alsen zur genetischen Risikofaktoren im Menschen27zu identifizieren. Darüber hinaus Hefe-überexprimierenden menschlichen α-Synuclein erlaubt für die Charakterisierung des Rsp5-Netzwerks als druggable Ziel, α-Synuclein Toxizität in Neuronen28,29zu verbessern.

Hier beschreiben wir ein Protokoll Nutzung von Saccharomyces Cerevisiae um genomweite Histon PTM Veränderungen im Zusammenhang mit neurodegenerativen Proteinopathies (Abbildung 1) zu erkennen. Die Verwendung von S. Cerevisiae ist höchst attraktiv wegen seiner Mühelosigkeit, niedrige Kosten und Geschwindigkeit im Vergleich zu anderen in-vitro- und tierischen Modellen der Neurodegeneration. Nutzung der zuvor entwickelten ALS auch PD Modelle22,23,25,26, wir haben überexprimiert menschlichen FUS, TDP-43 und α-Synuclein in Hefe und ungedeckten unterschiedliche Histon PTM Veränderungen in Verbindung mit jedem Proteinopathy30. Das Protokoll, die wir hier beschreiben, kann in weniger als zwei Wochen von Transformation zur Datenanalyse abgeschlossen werden.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Umwandlung S. Cerevisiae mit Neurodegenerative Proteinopathy-assoziierten Protein Konstrukte

  1. Wachsen Sie Wildtyp (WT) 303 Hefe in Hefe Extrakt Pepton Traubenzucker (YPD) Brühe über Nacht mit schütteln (200 u/min) bei 30 ° C.
  2. Nach 12−16 h des Wachstums, verdünnen Hefe zu einer optischen Dichte bei 600 nm (OD600) von 0,25 mit YPD. Da 10 mL liquid Hefekultur für jede Transformation benötigt wird, bereiten Sie fünf Transformationen, FUS, TDP-43, a-Synuclein sowie Vektor nur (CcdB) Konstrukte und eine Negativkontrolle Transformation entspricht 50 mL liquid Hefekultur ohne DNA.
  3. Hefe mit Agitation bei 30 ° C zu wachsen, bis ein OD600 zwischen 0,60 und 0,80 erreicht ist. Dies dauert in der Regel 4−6 h.
  4. Linearisieren Sie dreißig Minuten vor Hefe Wachstum abgeschlossen, ist Plasmid Konstrukte.
    Hinweis: Der Plasmid-Konstrukte verwendet hier direkt in das Genom integriert werden müssen und Linearisierung ist daher vor der Umwandlung erforderlich.
    1. Berechnen Sie das Volumen der Plasmid-Lager, dass Beträge bis 1 µg. subtrahieren dieses Volumen von 44 µL zur Berechnung der Höhe der Nuklease frei H2O benötigt.
    2. Ein Microcentrifuge Schlauch Nuklease frei H2O, 5 µL 10 X Restriktionsenzym Puffer (Table of Materials), 1 µL NheI Restriktionsenzym (Table of Materials) und die entsprechende Menge an Plasmid (berechnet in Schritt 1.4.1) hinzufügen. Von oben und unten Pipettieren gründlich mischen und bei 37 ° C für 15 min inkubieren. Das Plasmid ist jetzt linearisierten und bereit für die Transformation.
  5. Nach Hefe erreicht Kultur eine OD600 von 0,6-0,8, Ernte Zellen in einem 50 mL konische Rohr und Spin-down bei 850 X g bei 4 ° C für 3 min. verwerfen überstand.
  6. Waschen Sie Zelle Pellet in 10 mL sterile H2O und Zentrifuge bei 850 X g bei 4 ° C für 3 min. verwerfen überstand. Wiederholen Sie 3 X, für eine Gesamtmenge von vier Waschungen.
  7. Tauen Sie zu Beginn des dritten waschen auf und Kochen Sie 10 µL Lachs Samenzellen DNA pro Umwandlung Reaktion für 5 min auf einem Heizblock.
  8. Aufschwemmen Zelle Pellet in 100 µL dH2O pro Umwandlung und in entsprechende Anzahl von Mikrozentrifugenröhrchen aufgeteilt. Für fünf Transformationen Aufschwemmen Pellet in 500 µL dH2O und in fünf separaten Mikrozentrifugenröhrchen gleichmäßig aufgeteilt.
  9. Zentrifugieren Sie für 5 min bei 850 X g bei Raumtemperatur (RT) und entfernen Sie alle verbleibenden Wasser.
  10. Fügen Sie in der folgenden Reihenfolge 50 µL steriler H2O, 240 µL 50 % Polyethylenglykol (PEG), 36 µL 1 M LiAc, 10 µL Lachs Samenzellen DNA, 20 µL der linearisierten Plasmid DNA (oder Nuklease freies Wasser für keine DNA-Kontrolle-Transformation). Mischen Sie nach jeder Zugabe und Wirbel kurz nachdem alle Komponenten der Transformation hinzugefügt wurden.
  11. Inkubieren Sie Transformation Reaktionen bei 42 ° C für 20 min.
    Hinweis: Führen Sie diese Inkubation in einem Wasserbad für konsistentere Temperaturregelung.
  12. Zentrifugieren bei 470 X g bei RT für 5 min. verwerfen überstand und Aufschwemmen jede Zelle Pellet in 200 µL steriler H2O.
  13. Hefesuspension auf Selektivmedien Platten Platte und mit sanften Perlen oder Spreizer zu verbreiten. Inkubieren Sie Platten für 2−3 Tage bei 30 ° c
    Hinweis: Synthetische definiert (SD)-seine Platten sind für die hier beschriebenen Plasmide verwendet.

(2) Vermessung Kolonie Wachstum Unterdrückung und Lagerung in Glycerin Aktien

  1. Impfen Sie einzelne Kolonien von Transformation Platten in 5 mL Selektivmedien mit 2 % Raffinose ergänzt. Wachsen Sie auf einem Schüttler bei 30 ° C über Nacht. Wählen Sie mindestens 12 Kolonien pro Umwandlung.
    Hinweis: Keine Kolonien werden in die "keine DNA" Transformation Steuerplatte erwartet.
  2. Pin-Frogger mit Ethanol, gefolgt von flammenden zu sterilisieren.
  3. Für jede Kultur, aliquoten 100 µL der gesättigten Zellsuspension in der ersten Zeile einer 96-Well-Platte. 200 µL steriler H2O in alle Vertiefungen der angrenzenden gut Spalten hinzufügen. Fügen Sie für serielle Verdünnungen 1:5 50 µL aus der ersten Spalte der angrenzenden Spalte hinter mit Mehrkanal-Pipettieren hinzu. Mischen Sie durch Pipettieren gründlich. Fügen Sie 50 µL aus der zweiten Spalte der dritten Säule und Mischung von pipettieren. Wiederholen Sie dies für den Rest der Platte.
  4. Platte Hefe indem Frogger in eine 96-Well-Platte und dann Stempelung durch schonend und gleichmäßig herunterdrücken auf Selektivmedien Platten mit und ohne Galaktose. 2−3 Tage bei 30 ° C inkubieren.
    Hinweis: SD-HSI und SGal, seine Platten sind für die hier beschriebenen Plasmide verwendet.
  5. Identifizieren Sie für FUS, TDP-43 und pro-Synuclein Transformationen die Kolonie, die Anzeige der meisten Wachstum Unterdrückung in Anwesenheit von Galaktose. Wählen Sie diese Kolonie von der SD-seine Platte und in 10 mL Selektivmedien ergänzt mit 2 % Raffinose für Übernachtung Wachstum zu impfen. Wählen Sie für die Vektor-Kontrolle eine Kolonie anzeigen kein Wachstum Unterdrückung in Anwesenheit von Galaktose.
  6. Um Glycerin Aktien vorzubereiten, kombinieren Sie 0,5 mL der gesättigten Flüssigkultur mit 0,5 mL 50 % Glycerin. Mischen, indem Sie auf und ab pipettieren und frieren bei-80 ° C.
    Hinweis: Glycerin Bestände gelagert werden bis zu einem Jahr bei-80 ° C.

3. die Überexpression von neurodegenerativen Proteinopathy verbundenen Proteine in S. cerevisiae

  1. Aus gefrorenen Glycerin Beständen, neu Streifen Hefe auf Histidin, 2 % Glucose Agar Selektivmedien Platten und 2−3 Tage bei 30 ° C inkubieren.
  2. Impfen Sie einzelne Kolonien für jeden der Überexpression Modelle und Kontrolle in 5 mL Histidin selektiven Flüssigmedien mit 2 % Raffinose ergänzt. Mit schütteln (200 u/min) bei 30 ° C über Nacht wachsen.
  3. 100 mL des flüssigen Kultur für jeden der Überexpression Modelle und Steuerelemente wachsen (FUS, TDP-43 und Vektor steuern; a-Synuclein und Vektor-Kontrolle).
    1. Bereiten Sie 100 mL der Kultur in Selektivmedien ergänzt mit 2 % Galaktose vor.
    2. Messen Sie die OD600 Übernachtung Kulturen und berechnen Sie die Menge der Nacht Kultur Überexpression Kulturen bei einem Start OD600 von 0,3 machen musste. In der Regel erreichen über Nacht Kulturen ein OD600 0.9−10, erfordern etwa 5 mL über Nacht Kultur 100 mL frische Kultur zu beginnen.
    3. Induzieren Sie Protein Überexpression von wachsender Hefe auf Galaktose Medien (siehe Punkt 3.3.1) für 5 h (FUS und TDP-43) bzw. 8 h (a-Synuclein) mit Schütteln bei 30 ° C.
  4. Messen Sie OD600 der jeweiligen Kultur am Ende der Einarbeitungszeit. Alle Zellenzahlen auf den niedrigsten Wert der OD-600 zu standardisieren. Ernten Sie Kultur in 50 mL Röhrchen durch Zentrifugieren bei 850 X g für 5 min bei 4 ° C. Verwerfen Sie überstand.
    Hinweis: Wenn die OD600 Messwerte am Ende der Induktion 0.654 und 0.984, bzw. für 100 mL pro-Synuclein Kultur und Kontrollkultur, 100 mL sind ernten Sie 95 mL pro-Synuclein Kultur und 67,1 mL der Kontrollkultur.
  5. Aufschwemmen Sie Pellet in 1 mL sterile dH2O für jeden 10 mL Kultur angebaut. Pellets von 1 mL der Zelle Wiederfreisetzung Aliquotierung in Mikrozentrifugenröhrchen gleichmäßig aufgeteilt. Zum Beispiel wenn mit 100 mL der Kultur ab, Aufschwemmen Sie Pellet in 10 mL sterile dH2O und teilen Sie es in 10 Mikrozentrifugenröhrchen.
  6. 850 X g für 5 min bei 4 ° C zentrifugiert, dann entfernen Sie überstand. Snap freeze Zelle Pellets in flüssigem Stickstoff und Store bei-80 ° C.
    Hinweis: Zelle Pellets können bei-80 ° C bis zu einem Jahr gelagert werden.

(4) Zell-Lyse und westliche Beflecken um Histon post-translationalen Modifikationen zu erkennen

  1. Zell-Lyse
    1. Tauen Sie Hefe-Zelle-Pellets auf Eis auf und Aufschwemmen Sie Zelle Pellets in 100 µL dH2O.
    2. Die Zelle Wiederfreisetzung fügen Sie hinzu, 300 µL 0,2 M NaOH und 20 µL 2-Mercaptoethanol. Aufschwemmen Sie durch Pipettieren rauf und runter.
    3. Inkubieren Sie Zellen für 10 min auf Eis und anschließend Zentrifugieren bei 3.200 X g auf einer Tischplatte Zentrifuge für 30 s bei RT Discard überstand.
    4. Aufzuwirbeln Sie Zelle Pellet in 100 µL 1 x laden Farbstoff und kochen für 10 min auf einem Heizblock.
      Hinweis: Das Rezept für 6 x Farbstoff Laden finden Sie in der Tabelle der Materialien.
  2. Sodium Dodecyl Sulfat Polyacrylamid Gelelektrophorese und Membran übertragen
    1. Bereiten Sie Gel Kammer, indem man zwei Gele in einem Gel Halter und Füllung Innenkammer mit Puffer ausgeführt und Füllung der äußeren Kammer bis zur Markierung zwei Gel-Linie an die Spitze.
    2. Laden Sie 15 µL Probe aus Schritt 4.1.4 pro Bohrloch in ein 10-gut 12 % Polyacrylamid-Gel. Laden Sie für die Protein-Leiter-Gasse 5 µL.
    3. Führen Sie Gel für ca. 45 Minuten bei 150 V oder bis laden Farbstoff vorne den Boden des Gels erreicht.
    4. Während das Gel läuft, bereiten Sie für Membran-Transfer durch Einweichen Faser-Pads (zwei pro Gel) in Transfer-Puffer (Table of Materials) und Einweichen Polyvinylidene Fluorid (PVDF) Membran in Methanol vor. Spülen Sie mit Membran übertragen Puffer vor der Übertragung.
      Hinweis: Die PVDF-Membran sollte geschnitten werden, um die Größe des Gels und verwenden einer PVDF-Membran für jede Gel übertragen wird.
    5. Montage auf semi-dry Transfer Apparat Zelle, einen Transfer "Sandwich": vom unteren Elektrode platzieren (1) presoaked Faser-Pad, (2) presoaked und gespülten PVDF-Membran, (3) Gel aus Schritt 4.2.3 und (4) eine zweite presoaked Faser-Pad.
      Hinweis: Achten Sie darauf, die Vermeidung von Luftblasen in der Übertragung "Sandwich." Rollen Sie sanft "Sandwich" mit serologischen pipettieren, Bläschen zu zwingen. Nachdem das Gel auf die Membran PDVF platziert wurde, stellen Sie sicher, nicht um es zu verschieben.
    6. Protein-Transfer durchführen, indem Kraftpaket auf 150 mA für 1 h (für ein "Sandwich").
  3. Erkennung von Histon PTMs mit spezifischen Antikörpern Modifikation
    1. Entfernen Sie Membran aus Transfer Vorrichtung. Spülen Sie kurz mit dH2O.
      1. Überprüfen Sie optional Transfer von Proteinen mit Ponceau-S Fleck Gießen genügend Ponceau-S Fleck Membran in einer kleinen Plastikbox und Inkubation bei RT mit sanft schütteln für 30−60 s. entfernen Ponceau-S Fleck und spülen Sie mit dH2O bis Hintergrund färben verschwindet und Protein-Bands sind für das bloße Auge sichtbar. Weiterhin mit dH2O abspülen, bis alle Fleck von Membrane entfernt ist.
    2. Blockieren Sie Membran in ein Kästchen Färbung durch Inkubation Fleck für 1 h bei RT mit sanftes Schaukeln mit Tris gepufferte Kochsalzlösung (TBS) blockierende Puffer (Table of Materials). Verwenden Sie genug blockierende Puffer Fleck zu decken.
      Hinweis: Seien Sie vorsichtig, Membran im Feld Färbung aufrecht platzieren, so dass die Membran-Seite auf der Proteine liegen ist nicht nach unten.
    3. Inkubieren Sie Fleck im Feld Färbung über Nacht mit einem Histon Modifikation-spezifische Antikörper reaktiv gegenüber Hefe bei 4 ° c Verdünnen Sie die Antikörper in TBS blockierende Puffer nach Herstellervorgabe. Auch eine ordnungsgemäße nuklearen Beladung-Steuerelement, z. B. Anti-insgesamt H3 wuchs in verschiedenen Wirtsarten aus der Modifikation-spezifischen Antikörper. Zum Beispiel, wenn für H3S10ph mit einem Anti-H3S10ph-Antikörper, aufgewachsen in Kaninchen zu sondieren, verwenden Sie Antikörpers Anti-insgesamt H3 wuchs in Maus als Steuerelement laden. Wiederholen Sie diesen Vorgang für jeden Fleck wie nötig.
      Hinweis: Antikörper-Verdünnungen können für insgesamt drei Mal innerhalb eines Monats wiederverwendet werden. Bei 4 ° c lagern
    4. Waschen Sie die Membran 4 X in hausgemachter TBS + 0,1 % Polysorbat 20 (TBST) für 5 min mit Schaukeln bei RT
    5. Inkubieren Sie Fleck mit fluoreszierenden Sekundärantikörper bei Hersteller angegebenen Verdünnungen (Esel Anti-Kaninchen 680 und Esel Anti-Maus) für 1 h bei RT
      Hinweis: Fluoreszierende Sekundärantikörper müssen während der Lagerung und Nutzung vor Licht geschützt werden. Inkubation in dunklen Kunststoffboxen durchzuführen oder mit Aluminiumfolie abdecken.
    6. Waschen Sie Membran 4 X mit TBST für 5 min und Wäsche mit TBS für 5 min beim Schaukeln bei RT
    7. Visualize Fleck auf einem fluoreszierenden Western-Blot imaging-System für 2 min. visualisieren die Anti-Kaninchen 680 und sekundäre Antikörper Anti-Maus 800 in der 800 nm und 700 nm Kanäle bzw..
      Hinweis: Repliziert werden unabhängig voneinander durchgeführt ab Abschnitt 1. Es ist notwendig, um sicherzustellen, dass die Antikörperantwort Signal innerhalb des Bereichs liegt über dem der Signalantwort linear zur Interpretation der entsprechenden Daten in diesen Experimenten ist.

(5) Datenanalyse und Statistik

  1. Geöffneten Bild des Flecks in eine imaging-Software (Table of Materials). Die Rohdichte der Änderung-spezifische Bands im Vektor Steuerung, TDP-43 und FUS (oder Vektor-Kontrolle und pro-Synuclein) Proben zu erwerben, indem Sie ein Rechteck umrahmt, die die Band im Analysemodus.
  2. Wiederholen Sie Schritt 5.1 für das Steuerelement Bands laden.
    Hinweis: Es werden eine Beladung Band und eine Änderung-spezifische Band in jeder Probe zu kontrollieren.
  3. Berechnen Sie die relative Dichte der Änderung-spezifische Bands dividiert jedes Band durch die Dichte des entsprechenden Band in der Vektor-Kontrollprobe. Dies normalisiert sich die Daten zu den Vektor-Kontrolle.
  4. Berechnen Sie die relative Dichte der Belastung Kontrollbande dividiert jedes Band durch die Dichte der entsprechenden Belastung Kontrollbande in der Vektor-Kontrollprobe.
  5. Die eingestellte relative Dichte der einzelnen Bänder zu berechnen, indem man die relative Dichte der Änderung-spezifische Band über die relative Dichte der Belastung Kontrollbande für jede Probe. Nun können die Daten im Histogramm Form visualisiert werden.
    Hinweis: Zur Vereinfachung der Verarbeitung, können Schritte 5,3-5,5 in einer Tabellenkalkulation (Ergänzende Datei) erfolgen.
  6. Nachdem mehrere unabhängige Wiederholungen, laufen Welch T-Tests zwischen den beiden Kontrollproben und die entsprechenden Proteinopathy (Kontrolle im Vergleich zu FUS, Kontrolle versus TDP-43 und Kontrolle im Vergleich zu pro-Synuclein) mit p Modell = 0,05 als der Cutoff für Bedeutung .

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Um diese Methode zu veranschaulichen, werden wir vor kurzem veröffentlichten Ergebnisse30nutzen. WT menschlichen FUS und TDP-43 wurden für 5 h überexprimiert, während für 8 h WT α-Synuclein überexprimiert wurde. Ein CcdB Konstrukt wurde als Vektor Negativkontrolle verwendet. Abbildung 2 zeigt Wachstum Unterdrückung in festen und flüssigen Kulturen. Hefe wurde geerntet, wie beschrieben und westliche Beflecken mit Modifikation-spezifisch...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Das hier beschriebene Protokoll bietet eine einfache, sinnvolle und kostengünstige Möglichkeit kategorisieren genomweite Histon PTM Veränderungen korreliert mit Neurodegenerative Proteinopathies. Zwar gibt es andere Modelle ALS auch PD, z. B. in-vitro- humanen Zelllinien und Murine Modelle32, S. Cerevisiae bleibt attraktiv wegen seiner einfachen Handhabung. Zum Beispiel Hefe Modelle benötigen keine Verwendung von sterilen Kapuze, noch benötigen sie das Intensive training, das zus...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wir danken Royena Tanaz, Huda Yousuf und Sadiqa Taasen für technische Hilfe. Wir sind sehr dankbar für die großzügige Bereitstellung von Reagenzien und geistige Unterstützung bei der Gestaltung von Saccharose tuning Experimente Prof. James Shorter. Hefe-Plasmide wurden ein großzügiges Geschenk von Prof. Aaron Gitler (einschließlich 303Gal-FUS; Addgene Plasmid # 29614). Brooklyn College und der Advanced Science Research Center (CUNY) sowie ein NIH NINDS Advanced Postdoc Übergang Award (K22NS09131401) unterstützt M.P.T

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
-His DO SupplementClontech630415
10x Running BufferMix: 141,65 g Glycin (ThermoFisher BP381-1), 30,3 g Tizma-Base (Sigma-Aldrich T6066), 10 g Natriumdodecylsulfat (Sigma-Aldrich L3771) und 1 l deionisiertes Wasser, pH 8,8.
12% Polyacrylamid-GeleBIO-RAD456-1041
2-MercaptoethanolSigma-AldrichM3148
Anti-Acetyl-Histon H3 (Lys14) Primärer AntikörperMilliporeSigma07-353 (Los-Nr. 2762291)Verdünnung: 1/1000
Anti-Acetyl-Histon H4 (Lys 16) Primärer AntikörperAbcamab109463 (Los-Nr. GR187780)Verdünnung: 1/2000
Anti-Acetyl-Histon H4 (Lys12) Primärer AntikörperAbcam ab46983 (Lot Nr. GR71882)Verdünnung: 1/5000
Anti-Dimethyl-Histon H3 (Lys36) PrimärantikörperAbcam ab9049 (Los-Nr. GR266894, GR3236147)Verdünnung: 1/1000
Anti-Histon H3 PrimärantikörperAbcamab24834 (Los-Nr. GR236539, GR174196, GR3194335)Kontrolle der nuklearen Beladung; Verdünnung: 1/2000
Anti-Phospho-Histon H2B (Thr129) PrimärantikörperAbcam ab188292 (Los-Nr. GR211874)Verdünnung: 1/1000
Anti-Phospho-Histon H3 (Ser10) Primärer AntikörperAbcam ab5176 (Los-Nr. GR264582, GR192662, GR3217296)Verdünnung: 1/1000
BioPhotometer D30Eppendorf6133000010
Zellkulturschale (100 x 20 mm)Eppendorf30702118
Zellkulturplatte, 96 WellEppendorf30730011
Zentrifuge 5804/5804 R/5810/5810 REppendorf22625501
Donkey Anti-Mouse IRDye 800 CWLI-COR926-32212 (Los-Nr. C60301-05, C61116-02, C80108-05)Verdünnung: 1/5000
Donkey Anti-Rabbit IRDye 860 RDLI-COR926-68073 (Los-Nr. C60217-06, C70323-06, C70601-05, C80116-07)Verdünnung: 1/2500
EthanolSigma-AldrichE7023
Extra dickes Fleckenpapier (Filterpapier)BIO-RAD1703968
GalactoseSigma-AldrichG075020 %ige Stammlösung herstellen.
GlucoseSigma-AldrichG827020 % w/v Stammlösung herstellen.
GlycerolSigma-AldrichG551650 % w/v Lösung herstellen.
Immobilon-FL TransfermembranenMilliporeSigmaIPFL00010
Lithiumacetat-Dihydrat (LiAc)Sigma-AldrichL4158Bereiten Sie eine 1 M Lösung vor.
Loading DyeMix: 1,2 g Natriumdodecylsulfat, 6 mg Bromphenolblau (Sigma-Aldrich B8026), 4,7 mL Glycerin, 1,2 mL 0,5 M Trizma-Base pH 6,8, 0,93 g DL-Dithiothreitol (Sigma-Aldrich D0632) und 2,1 mL deionisiertes Wasser.
MethanolThermoFisherA412-4
Mini-PROTEAN Tetra Vertikale ElektrophoeresezelleBIO-RAD1658004
MehrkanalpipetteEppendorf2231300045
NEB Restriktionsenzym Puffer 2.1, 10xNew England Bio Labs102855-152
Nhe I RestriktionsenzymNew England Bio Labs101228-710
Nukleasefreies WasserQiagen129114
Odyssey Fc Imaging SystemLI-COR Biosciences2800-03
OmniTray Zellkultur behandelt mit Deckel Steril, PS (86 x 128 mm)ThermoFisher165218
pAG303GAL-a-Synuclein-GFPGeschenk von A. Gitler
pAG303GAL-ccdBAddgene14133
pAG303Gal-FUSAddgene29614
pAG303GAL-TDP-43Geschenk von A. Gitler
Poly(ethylenglykol) (PEG)Sigma-AldrichP4338Bereiten Sie eine 50%ige w/v-Lösung vor.
Ponceau S StainSigma-AldrichP3504Mix: 0,5 g 0,1 % w/w Ponceau S Farbstoff, 5 mL 1 % v/v Essigsäure (Sigma-Aldrich 320099) und 500 mL deionisiertes Wasser.
PowerPac Basic NetzteilBIO-RAD164-5050
Raffinose-PentahydratSigma-AldrichR763010%ige Stammlösung herstellen.
Lachs Sperma DNAAgilent Tech201190
SD-His PlattenMix: 20 g Agar (Sigma-Aldrich A1296), 0,77 g -His DO-Supplement, 6,7 g Hefe Stickstoffbase ohne Aminosäuren (ThermoFisher 291920) und 900 ml deionisiertes Wasser.
SGal-His-PlattenMix: 20 g Agar, 0,77 g -His DO-Ergänzung, 6,7 g Hefe-Stickstoffbase ohne Aminosäuren, 100 ml Galaktoselösung und 900 ml deionisiertes Wasser.
Natriumdodecylsulfat LadepufferBei -20 oC lagern. 6X, Mix: 1,2 g Natriumdodecylsulfat, 6 mg Bromphenolblau, 0,93 g DL-Dithiothreitol, 2,1 mL deionisiertes Wasser, 4,7 mL Glycerin und 1,2 mL 0,5 M Trizma-Base, pH 6,8.
NatriumhydroxidSigma-Aldrich2214650,2 M Lösung herstellen.
SaccharoseSigma-Aldrich8409720 % w/v Stammlösung herstellen.
TBS + 0,1 % Tween 20 (TBST)Mix: 100 mL 10X TBS, 1 mL Tween 20 (Sigma-Aldrich P7949) und 900 mL deionisiertes Wasser.
TBS Blocking BufferLI-COR927-5000
Trans-Blot SD Halbtrockene elektrophoretische TransferzelleBIO-RAD170-3940
Transfer BufferMix: 22,5 g Glycin, 4,84 g Tizma-Base, 400 ml Methanol, 1 g Natriumdodecylsulfat und 1,6 l deionisiertes Wasser.
Tris-gepufferte Kochsalzlösung (TBS)10X, pH 7,6, Lösung: Mischen Sie 24 g Trizma-Base und 88 g Natriumchlorid (Sigma-Aldrich S7653). Füllen Sie bis zu 1 L mit entionisiertem Wasser.
WT 303 S. cerevisiaeGeschenk von J. Shorter
Hefe Extrakt Pepton Dextrose (YPD)Sigma-AldrichY1375
Hefe

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Landgrave-Gómez, J., Mercado-Gómez, O., Guevara-Guzmán, R. Epigenetic mechanisms in neurological and neurodegenerative diseases. Frontiers in Cellular Neuroscience. 9, 58(2015).
  2. Paez-Colasante, X., Figueroa-Romero, C., Sakowski, S. A., Goutman, S. A., Feldman, E. L. Amyotrophic lateral sclerosis: mechanisms and therapeutics in the epigenomic era. Nature Reviews Neurology. 11 (5), 266-279 (2015).
  3. Beitz, J. M. Parkinson's Disease: a Review. Frontiers in Bioscience. 6, 65-74 (2014).
  4. Kim, H. J., et al. Mutations in prion-like domains in hnRNPA2B1 and hnRNPA1 cause multisystem proteinopathy and ALS. Nature. 495 (7442), 467-473 (2013).
  5. Poewe, W., et al. Parkinson disease. Nature Reviews Disease Primers. 3, https://www.nature.com/articles/nrdp201713 - supplementary-information 17013(2017).
  6. Robberecht, W., Philips, T. The changing scene of amyotrophic lateral sclerosis. Nature Reviews Neuroscience. 14 (4), https://www.nature.com/articles/nrn3430 - supplementary-information 248-264 (2013).
  7. Chen-Plotkin, A. S., Lee, V. M. Y., Trojanowski, J. Q. TAR DNA-binding protein 43 in neurodegenerative disease. Nature Reviews Neurology. 6 (4), 211-220 (2010).
  8. Couthouis, J., et al. A yeast functional screen predicts new candidate ALS disease genes. Proceedings of the National Academy of Sciences. 108 (52), 20881-20890 (2011).
  9. Da Cruz, S., Cleveland, D. W. Understanding the role of TDP-43 and FUS/TLS in ALS and beyond. Current Opinion in Neurobiology. 21 (6), 904-919 (2011).
  10. King, O. D., Gitler, A. D., Shorter, J. The tip of the iceberg: RNA-binding proteins with prion-like domains in neurodegenerative disease. Brain Research. 1462, 61-80 (2012).
  11. Neumann, M., et al. FET proteins TAF15 and EWS are selective markers that distinguish FTLD with FUS pathology from amyotrophic lateral sclerosis with FUS mutations. Brain. 134 (9), 2595-2609 (2011).
  12. Neumann, M., et al. Ubiquitinated TDP-43 in Frontotemporal Lobar Degeneration and Amyotrophic Lateral Sclerosis. Science. 314 (5796), 130-133 (2006).
  13. Baba, M., et al. Aggregation of alpha-synuclein in Lewy bodies of sporadic Parkinson's disease and dementia with Lewy bodies. The American Journal of Pathology. 152 (4), 879-884 (1998).
  14. Lotharius, J., Brundin, P. Pathogenesis of parkinson's disease: dopamine, vesicles and α-synuclein. Nature Reviews Neuroscience. 3 (12), 932-942 (2002).
  15. Spillantini, M. G., et al. α-Synuclein in Lewy bodies. Nature. 388 (6645), 839-840 (1997).
  16. Probst, A. V., Dunleavy, E., Almouzni, G. Epigenetic inheritance during the cell cycle. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 10 (3), 192-206 (2009).
  17. Luger, K., Mäder, A. W., Richmond, R. K., Sargent, D. F., Richmond, T. J. Crystal structure of the nucleosome core particle at 2.8 Å resolution. Nature. 389 (6648), 251-260 (1997).
  18. Mazzio, E. A., Soliman, K. F. A. Basic concepts of epigenetics. Epigenetics. 7 (2), 119-130 (2012).
  19. Struhl, K. Histone acetylation and transcriptional regulatory. Genes & Development. 12 (5), 599-606 (1998).
  20. Garcia, B. A., Shabanowitz, J., Hunt, D. F. Characterization of histones and their post-translational modifications by mass spectrometry. Current Opinion in Chemical Biology. 11 (1), 66-73 (2007).
  21. Strahl, B. D., Allis, C. D. The language of covalent histone modifications. Nature. 403 (6765), 41-45 (2000).
  22. Jovicic, A., et al. Modifiers of C9orf72 dipeptide repeat toxicity connect nucleocytoplasmic transport defects to FTD/ALS. Nature Neuroscience. 18 (9), 1226-1229 (2015).
  23. Sanchez, Y., Lindquist, S. L. HSP104 required for induced thermotolerance. Science. 248 (4959), 1112(1990).
  24. Outeiro, T. F., Lindquist, S. Yeast Cells Provide Insight into Alpha-Synuclein Biology and Pathobiology. Science. 302 (5651), 1772(2003).
  25. Johnson, B. S., et al. TDP-43 Is Intrinsically Aggregation-prone, and Amyotrophic Lateral Sclerosis-linked Mutations Accelerate Aggregation and Increase Toxicity. Journal of Biological Chemistry. 284 (30), 20329(2009).
  26. Sun, Z., et al. Molecular Determinants and Genetic Modifiers of Aggregation and Toxicity for the ALS Disease Protein FUS/TLS. PLOS Biology. 9 (4), e1000614(2011).
  27. Elden, A. C., et al. Ataxin-2 intermediate-length polyglutamine expansions are associated with increased risk for ALS. Nature. 466 (7310), https://www.nature.com/articles/nature09320 - supplementary-information 1069-1075 (2010).
  28. Wijayanti, I., Watanabe, D., Oshiro, S., Takagi, H. Isolation and functional analysis of yeast ubiquitin ligase Rsp5 variants that alleviate the toxicity of human α-synuclein. The Journal of Biochemistry. 157 (4), 251-260 (2015).
  29. Tardiff, D. F., et al. Yeast Reveal a “Druggable” Rsp5/Nedd4 Network that Ameliorates α-Synuclein Toxicity in Neurons. Science. 342 (6161), 979(2013).
  30. Chen, K., et al. Neurodegenerative Disease Proteinopathies Are Connected to Distinct Histone Post-translational Modification Landscapes. ACS Chemical Neuroscience. 9 (4), 838-848 (2018).
  31. Flick, J. S., Johnston, M. Two systems of glucose repression of the GAL1 promoter in Saccharomyces cerevisiae. Molecular and Cellular Biology. 10 (9), 4757(1990).
  32. Fernandez-Santiago, R., Ezquerra, M. Epigenetic Research of Neurodegenerative Disorders Using Patient iPSC-Based Models. Stem Cells International. 2016, 9464591(2016).
  33. Armakola, M., et al. Inhibition of RNA lariat debranching enzyme suppresses TDP-43 toxicity in ALS disease models. Nature Genetics. 44 (12), 1302-1309 (2012).
  34. Tibshirani, M., et al. Cytoplasmic sequestration of FUS/TLS associated with ALS alters histone marks through loss of nuclear protein arginine methyltransferase 1. Human Molecular Genetics. 24 (3), 773-786 (2015).
  35. Masala, A., et al. Epigenetic Changes Associated with the Expression of Amyotrophic Lateral Sclerosis (ALS) Causing Genes. Neuroscience. 390, 1-11 (2018).
  36. Eryilmaz, I. E., et al. Epigenetic approach to early-onset Parkinson’s disease: low methylation status of SNCA and PARK2 promoter regions. Neurological Research. 39 (11), 965-972 (2017).
  37. Daniele, S., et al. Epigenetic Modifications of the α-Synuclein Gene and Relative Protein Content Are Affected by Ageing and Physical Exercise in Blood from Healthy Subjects. Oxidative Medicine and Cellular Longevity. 2018, 3740345(2018).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Histone ModificationYeast ModelNeurodegenerative DiseaseWestern BlotProtein OverexpressionHistone AcetylationEpigenetic AnalysisSaccharomyces CerevisiaeALS PD ModelsPost translational Modification

Related Articles