Isolation und Adoptiveltern Übertragung von hohen Salz behandelt Antigen-präsentierende dendritische Zellen

Zusammenfassung

Hier präsentieren wir Ihnen ein Protokoll zur dendritische Zellen aus murinen Milz von magnetischen Zellsortierung und späteren Adoptiveltern Übertragung ins naive Mäuse zu isolieren. Das Modell von hohem Salzgehalt aktivierten dendritischen Zellen wurde gewählt, um die schrittweisen Verfahren Adoptiv-Transfer und Durchflusszytometrie zu erklären.

Zusammenfassung

Überschüssiges Salz Nahrungsaufnahme trägt zur Entzündung und spielt eine entscheidende Rolle bei der Entwicklung von Bluthochdruck. Zuvor fanden wir, dass Antigen-präsentierende dendritische Zellen (DCs) spürt erhöhte extrazelluläre Natrium führt die Aktivierung von der NADPH-Oxidase und Bildung von Isolevuglandin (IsoLG)-Protein-Addukte. Diese IsoLG-Protein Addukte mit selbst-Proteine reagieren und fördern eine Autoimmun-artigen Zustand und Bluthochdruck. Wir haben entwickelt und optimiert, State-of-the-Art Methoden, um DC Funktion bei Hypertonie zu untersuchen. Hier bieten wir ein detailliertes Protokoll zur Isolierung Vitro Behandlung mit erhöhten Natrium- und Adoptiveltern Übertragung der murinen Milz CD11c⁺ Zellen in Empfänger Mäuse, ihre Rolle bei der Hypertonie zu studieren.

Einleitung

Überschüssige diätetische Salz ist ein wichtiger Risikofaktor für Bluthochdruck. ^{1 , 2} the American Heart Association empfiehlt maximal 2.300 Milligramm (mg) Natrium (Na⁺)-Zufuhr pro Tag, jedoch; weniger als 10 % der US-Bevölkerung beobachtet diese Empfehlung. ^{3 , 4} bescheidene Reduzierung der Na⁺ Einnahme Blutdruck senken und die jährliche neue Fälle von koronarer Herzkrankheit und Schlaganfall in den USA um 20 % reduzieren. ⁵ ist ein großes Problem mit überschüssiger Salzverbrauch, dass 50 % der Bevölkerung Hypertensive Salz-Empfindlichkeit aufweist definiert als Anstieg des Blutdrucks, Na^{Na+ laden oder ein ähnlicher Rückgang der Blutdruck nach 10 MmHg +} Einschränkung und Diurese. ⁶ Salz-Empfindlichkeit auch bei 25 % der normotonen Personen, und ist ein unabhängiger Prädiktor für Tod und kardiovaskuläre Ereignisse. ^{7 , 8} Salz-sensing Mechanismen bei Hypertonie unter Einbeziehung der Niere sind gut untersucht worden; Neuere Studien legen jedoch nahe, dass Immunzellen Na⁺spüren können. ^{9 , 10}

Neuer Beweis schlägt vor, dass Änderungen in extra renal Na⁺ Umgang mit Anhäufung von Na⁺ in das Interstitium verursachen und Entzündung fördern können. ^{11 , 12} unser Labor und andere haben gezeigt, dass Zellen der angeborenen und der adaptiven Immunsystems, die Verschärfung von Bluthochdruck beitragen. ^{9 , 13 , 14 , 15} verschiedene Hypertensive Reize, einschließlich Angiotensin II, Noradrenalin und Salz Ursache Makrophagen, Monozyten und T-Lymphozyten zu infiltrieren, Nieren- und Gefäßsystem Na⁺ Aufbewahrung, Vasokonstriktion, Blutdruck Höhe und Ende Organschäden. ^{9 , 16 , 17 , 18 , 19 , 20} in früheren Studien, wir fanden, dass DCs Isolevuglandin (IsoLG) ansammeln-Protein-Addukte als Reaktion auf verschiedene Hypertensive Reize einschließlich Angiotensin II und DOCA-Salz Bluthochdruck. ¹⁴ IsoLGs sind hochreaktive Produkte der Lipidperoxidation, die schnell und kovalent, Lysines auf Proteine Addukt und ihre Ansammlung DC Aktivierung zugeordnet ist. ¹⁴ wir haben vor kurzem festgestellt, dass erhöhte Na⁺ einen potenten Reiz für IsoLG-Protein Addukt Bildung in Murine, die DCs.⁹ Na⁺ Inkrafttreten DCs durch Amilorid sensible Transporter vermittelt wird. Na⁺ ist dann für Kalzium (Ca^{2 +}) über die Na⁺/Ca^{2 +} Wärmetauscher ausgetauscht. Ca^{2 +} aktiviert Proteinkinase C (PKC), die NADPH-Oxidase führt zu erhöhten Superoxid (O₂^{· -}) aktiviert, und IsoLG-Protein Addukt Bildung. ⁹ Adoptiv Übertragung von Salz ausgesetzt DCs Primzahlen Hypertonie als Reaktion auf eine Sub-Druckluftstationen Dosis von Angiotensin II. ⁹

Identifizierung von CD11c⁺ DCs aus Geweben wurde bisher begrenzt Immunohistochemistry und RT-PCR, und Isolierung von DCs wurde beschränkt auf Zelle Sortierung nach Durchflusszytometrie. Obwohl Flow Cytometry Zellsortierung eine leistungsfähige Methode für die Isolierung von Immunzellen ist, es ist teuer, zeitaufwendig und führt zu einer geringen Ausbeute von entwicklungsfähigen Zellen. Deshalb haben wir eine Schritt-für-Schritt-Protokoll für Gewebe Verdauung, in-vitro-Stimulation und Adoptiveltern Übertragung von CD11c optimiert⁺ DCs, Bluthochdruck zu studieren.

Protokoll

Vanderbilt University institutionelle Animal Care und Use Committee haben die hier beschriebenen Verfahren zugestimmt. Mäuse sind untergebracht und betreut gemäß dem Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Labortieren (National Academies Press. Überarbeitete 2010).

1. Isolierung der Milz von Mäusen

1. Bereiten Sie RPMI 1640: 10 % FBS, 0,10 mM HEPES, 1 mM Natrium Pyruvat, 50 µM β-Mercaptoethanol und 1 % Penicillin/Streptomycin.
2. 10 – 12 Wochen einschläfern-alte C57bl/6 männliche Mäuse durch CO₂ einatmen. Sprühen Sie die Brust und an den Seiten der Maus mit 70 % Ethanol. Öffnen Sie auf der linken Seite vorsichtig die Haut und die Bauchhöhle, die Milz verfügbar zu machen.
3. Kleine Zange vorsichtig bewegen Sie den Darm und Leber auf der linken Seite der Maus, mit Hilfe und mit einer feinen Schere sanft Verbrauchsteuern die Milz.
   Hinweis: Dieser Schritt muss ausgeführt werden sehr sorgfältig, wie Schäden an den Magen-Darm-Trakt Kontamination induzieren kann.
4. Legen Sie jedes ausgeschnittenen Milz in beschrifteten 15 mL konische Röhrchen mit 3 mL RPMI 1640 Medium.

2. Generation des einzigen Zellsuspensionen von Milz

Hinweis: Die Milz kann in einer einzigen Zellsuspension durch Kombination von mechanischen Dissoziation und enzymatische Verdauung getrennt werden.

1. Bereiten Sie die Milz Verdauung Lösung durch Zugabe von Kollagenase D (1 mg/mL; 0,29 U/mg lyophilisiert) und DNase I (0,1 mg/mL) bis RPMI 1640 Medium vorbereitet (siehe Punkt 1.1)
2. Verwenden Sie Zange um die Milz in ein C-Rohr (Dissoziation Rohr) mit 3 mL Milz Aufschlusslösung übertragen.
3. Führen Sie die mechanische Dissoziation mit einer halbautomatischen Homogenisator nach den Anweisungen des Herstellers.
   1. Platz der C-Tube auf halbautomatische Homogenisator, um sicherzustellen, dass das C-Rohr fest auf den rotierenden Arm gelegt wird. Sobald das C-Rohr gesetzt ist, drücken Sie den Startknopf für die halbautomatische Homogenisator zum Ausführen der Milz 04.01. -Protokoll für 60 s.
      Hinweis: Mechanische Dissoziation kann auch erfolgen, indem eine 40 μm-Filter auf eine 50 mL konische Rohr und vorsichtig Schleifen der Milz durch den Filter. Nach dem Schleifen der Milz durch Spülen des 40 µm-Filters mit 10 mL RPMI Medien.
4. Lösen Sie nach mechanischen Dissoziation den Schlauch aus der Homogenisator und führen Sie die enzymatische Verdauung. Inkubieren Sie die Proben 15 min bei 37 ° C unter kontinuierliche Rotation (20 u/min).
5. Übertragen Sie die Lösung, indem nach der Filterung durch ein 40 µm-Sieb in ein 50 mL konische Röhrchen pipettieren. Waschen Sie die 40 µm-Sieb mit 10 mL Dulbeccos PBS (dPBS). Zentrifugieren Sie die Zellen bei 300 X g für 10 min bei 4 ° C.
6. Abzusaugen Sie nach Zentrifugation überstand vollständig und waschen Sie die Pellets von resuspending in 10 mL des dPBS. Zentrifuge bei 300 X g für 10 min bei 4 ° C.

3. Isolation der CD11c⁺ DCs aus Milz Einzelzelle Suspension

1. Aufschwemmen der Zelle Pellet in 5 mL des dPBS und die Anzahl der Zellen mit einem Hemocytometer und Trypan blau Ausgrenzung.
2. Pellet-Zellen durch Zentrifugieren bei 300 X g, 10 min bei 4 ° C.
3. Den Überstand vollständig abzusaugen und Pellet in 400 µL magnetisch aktivierte Zellsortierung (MACs) Puffer aufzuwirbeln.
4. Fügen Sie 100 µL CD11c Microbeads (siehe Tabelle der Materialien) pro 1 x 10⁸ Zellen hinzu.
5. Wirbel der Zellsuspension und 10 min. im Kühlschrank bei 4 ° c inkubieren
6. Fügen Sie 10 mL MACs-Puffer, Zellen zu waschen. Zentrifuge bei 300 X g für 10 min bei 4 ° C.
7. Den Überstand vollständig abzusaugen und in 500 µL Puffer MACs aufzuwirbeln.

4. magnetische Trennung von CD11c⁺ DCs

Hinweis: Magnetische Trennung erfolgt manuell mit einem Magnetabscheider mit LS-Säulen ausgestattet (siehe Tabelle der Materialien). Magnetische Trennung kann auch automatisch mit einer automatisierten Magnetabscheider erfolgen. (siehe Tabelle der Materialien).

1. Setzen Sie die LS-Säule in das Magnetfeld des MACs Trennzeichen und eine 15 mL konische Rohr unter jeder Spalte, um den Durchfluss zu sammeln.
2. Spülen Sie die LS-Spalte mit 3 mL Puffer.
3. Legen Sie die Zellsuspension auf jeder LS-Spalte und der durchströmten unbeschriftete Zellen sammeln.
4. Waschen Sie die LS-Spalte mit 3 mL MACs-Puffer sammeln die unbeschrifteten Zellen, die passieren. Waschen Sie die LS-Spalte 2 weitere Male.
5. Entfernen Sie die LS-Spalte aus der Magnetabscheider. 5 mL des MACs-Puffer zu jeder Spalte hinzufügen und sofort die magnetisch markierten Zellen durch fest Eintauchen der LS-Spalte in eine saubere 15 mL konische Röhrchen durchspülen.
   Hinweis: Es ist wichtig, dass eine doppelte Isolation von CD11c Zellen, eine hohe Reinheit Zellsuspension zu erhalten. Deshalb wiederholen Sie die Schritte 3.1 bis 4.5. und Abbildung 4 für Reinheitsanforderungen zu verweisen. Dieser Schritt verbessert die Reinheit des CD11c⁺ Zellen zu 90 – 95 %.
6. Bestimmen, CD11c⁺ DC Nummer auf einer Hemocytometer mit Trypan blau Ausgrenzung. Verdünnen Sie die Zellprobe bei einer Verdünnung von 1:1 in 0,4 % Trypan blau Lösung.
   Hinweis: nicht-lebensfähige Zellen werden blau, befleckt werden, lebensfähige Zellen ungefärbt bleiben.
   1. Um dies zu tun, sorgfältig füllen Sie ein Hemocytometer mit 10 µL der Zelle Probenverdünnung und inkubieren Sie für 1 Minute.
   2. Anzahl Zellen in 4 Quadrate von 1 x 1 mm² in der Kammer, die zur Ermittlung der Zellanzahl der lebensfähigen geladen wurde.

(5) in Vitro High Salz Behandlung von CD11c⁺ DCs

1. Bereiten Sie DC Kulturmedium durch Zugabe von 10 % FBS, 0,1 mM HEPES, 1 mM Natrium Pyruvat, 50 µM β-Mercaptoethanol und 1 % Penicillin/Streptomycin, 500 mL 1640 RPMI.
2. Bereiten Sie 10 x DC hohen Salz Zellkulturmedien (400 mM) mit einem Gewicht von 1,17 g NaCl und platzieren es in einen sterilen 50 mL Falcon-Röhrchen. Hinzu kommen 50 mL sterile DC Zellkulturmedien (vorbereitet im Schritt 5.1) die 50 mL Falcon-Röhrchen und Wirbel bis der NaCl Lösung ist.
3. Sofort Filtern der hohen Salz DC Kulturmedien mit Vakuumfiltration durch einen 0,2 µm-Filter in einer Zelle Kultur Kapuze.
4. Zentrifugieren Sie jedes Zellsuspension aus der Milz bei 300 X g für 10 min bei 4. Jede Zelle Pellet in DC Kulturmedien in einer Konzentration von 1 x 10⁶ Zellen/mL aufzuwirbeln.
5. Pipette 900 μl (ca. 1 x 10-⁶ -Zellen) der DC-Suspension in einer 24-Well Flachboden Falcon Platte. Geben Sie 100 µL der hohen Salz DC Nährmedien in jeder für eine endgültige Natriumkonzentration von 190 mM. Beschriften Sie die Platte und humifizierten Platz in einem 37 ° C CO₂ Inkubator für 48 h.

(6) Adoptiveltern Übertragung von hohen Salz behandelt CD11c⁺ DCs

1. Nach der in-vitro-Stimulation für 48 h humifizierten entfernen der Platte von 37 ° C CO₂ Inkubator.
2. Pipette den Zellkulturmedien oben und unten Aufschwemmen der CD11c⁺ DCs Pipette alle CD11c⁺ DC Aufhängung in eine entsprechende Bezeichnung 1,6 mL-Tube. Wiederholen Sie diesen Schritt für jeden einzelnen gut vergoldet.
3. Zentrifugieren Sie jedes CD11c⁺ DC Aussetzung bei 300 X g für 10 min bei 4 ° C. Den Überstand abgesaugt. Das DC-Pellet mit 100 µL steriler dPBS aufzuwirbeln.
4. Auslosung DC Aufhängung in eine 1 mL Spritze mit einer Nadel 27 G ½ Zoll ausgestattet.
5. Legen Sie die naive männlichen 10 Wochen alten C57bl/6 Mäusen unter 2 % Isofluran, eine stabile operative Ebene zu erreichen. Überprüfen Sie die Höhe der Anästhesie mit dem Mangel an Pedal Reflex. Sobald eine stabile operative Ebene erreicht wird, langsam und vorsichtig einführen der Nadelöhrs in den Retro-Orbital-Raum in einem Winkel von etwa 30°.
   Hinweis: Die Abschrägung der 27 G Nadel sollte nach unten, vom Auge, um augenfällige Schäden zeigen.
6. Langsam und gleichmäßig injizieren die CD11c⁺ DC Aussetzung (ca. 1 x 10-⁶ -Zellen). Nach die Injektion abgeschlossen ist, entfernen Sie vorsichtig die Nadel für den Retro-Orbital-Raum bewusst, das Auge nicht zu beschädigen.
   Hinweis: Nach der Injektion sollte wenig oder gar keine Blutungen. Adoptiveltern Übertragung von CD11c⁺ DCs können auch mit einer IV-Methode der Injektion (z.B. Tail Vene) durchgeführt werden. Die Kontroll-Mäusen erhalten CD11c⁺ DCs, die in normalen Salz Medien gezüchtet wurden.
7. Entfernen Sie die Mäuse aus der Bugnase und überwachen sie für etwa 30 min bei der Bergung aus der Narkose.

7. Vorbereitung der 14-tägigen niedrig dosierte Angiotensin II (140 ng/kg/min)

1. Bereiten Sie den Angiotensin-II-Puffer durch Zugabe von 500 μl 5 M NaCl und 300 μL der Essigsäure. Quantum Satis (QS) bis zu 30 mL entionisiertem H₂0.
2. Angiotensin II, 5 mg/mL Stammlösung mit Angiotensin-II-Puffer zu lösen. Verdünnen Sie Angiotensin-II-Stammlösung mit zusätzlichen Puffer, eine Endkonzentration zu erreichen, so dass die osmotische Minipump Angiotensin II in Höhe von 140 ng/kg/min nach dem Körpergewicht des jede Maus liefern wird.
   Hinweis: Wesentlichen Angiotensin II (mg) = (Maus Gewicht (g) x 0,2 mg / Tag x 14 Tage) / 1000
   Vorbereitet von Angiotensin II (mg) = (wesentliche Angiotensin II X 260 µL) / Pumpe Rate (0,25 μl/hr)
   Angiotensin II Lager Volumen (μL) = bereit Angiotensin II / Lager Konzentration (5 mg/mL) X 1,000
   Verdünnen Volumen (μL) = 270 - Angiotensin II Lager Volumen
3. Die verdünnte Angiotensin II Lager Volumen hinzufügen (Angiotensin-II-Puffer) basierend auf den Volumes in Schritt 7.2 berechnet.
4. Öffnen Sie unter einer sterilen Zelle Kultur Haube osmotische Minipump.
5. Fügen Sie verdünnte Angiotensin-II-Lösung und vertreiben Sie alle Luft aus der Spritze und Nadel. Stecken Sie die mitgelieferte Nadel in den unteren Teil der osmotische Minipump und injizieren Sie langsam Angiotensin-II-Lösung während Sie langsam und vorsichtig zurückziehen der Nadel aus der Blase.
6. Legen Sie die osmotische Minipump Kopf in die osmotische Blase voll, Aufmerksamkeit nicht auf Luft in die Blase gelangen.

8. die Implantation von 14 Tage niedrig dosierte Angiotensin II osmotische Minipumps

1. Zehn Tage nach Adoptiveltern Übertragung von CD11c⁺ DCs, Ort Mäuse in einer Kammer Isoflurane Narkose zu initiieren und dann Mäuse, Bugnase kontinuierlich erhalten 2 % Isofluran zu erreichen und aufrechtzuerhalten eine geeignete chirurgische Ebene.
2. Entfernen Sie das Fell an der dorsalen Seite des Halses mit Klipper Operationsstelle vorzubereiten. Reinigen Sie den rasierten Bereich mit 70 % Ethanol, gefolgt von 7,5 % Betadine vor Beginn der Operation.
3. Erstellen Sie einen kleinen Schnitt (ca. 1,5 cm) in der Haut. Der Schnitt eine subkutane Tasche für die Platzierung der osmotische Minipump erstellen stecken Sie Futterzange.
4. Legen Sie die Minipump in der subkutanen Tasche. In der Nähe die Haut mit chirurgischen Klammern ca. 2-3 gewickelt und anwenden einer anderen Anwendung von 7,5 % Betadine auf die Wunde und Heftklammern, Infektion zu verhindern.
5. Überwachen Sie die Mäuse für 30 – 60 min während der Wiederherstellung aus der Narkose vor der Rückgabe an ihren Käfigen.
   Hinweis: Mäuse brauchen werden bis zu 3 – 4 Tage nach der Implantation des osmotischen Minipump überwacht.

9. Isolation der Milz Empfänger Mäuse für durchflusszytometrischen Analyse

1. Nach 14 Tagen niedrig dosierte Angiotensin-II-Infusion, isolieren behandelt Milz von Mäusen empfangen von in-vitro-hohe Salz DCs von Adoptiveltern übertragen. Die genauen Schritte aufgeführten (Schritte 1 und 2).

10. Oberfläche Färbung

1. Übertragen Sie Splenocyten, die mit 1 X PBS-Puffer in einem Polystyrol FACS Rohr und Zentrifuge bei 350 X g für 8 min bei 4 ° c Nukleinsäuretablette werden Aspirieren Sie überstand nach Zentrifugation. Waschen Sie sich zweimal mit 1 mL MACs-Puffer und Zentrifugierung (350 X g, 8 min, 4 ° C).
   1. Teilen Sie die Splenocyten gleich in verschiedene Polystyrol FACS Röhren basierend auf der Anzahl der Fluss durchflusszytometrischen Panels auf Wunsch.
2. Um die Live/Dead Cell Lebensfähigkeit Färbung durchzuführen, waschen Sie die Zellen mit 1 X PBS und Zentrifuge (350 X g, 8 min, 4 ° C). In 1 mL 1 X PBS Aufschwemmen und fügen Sie 1 µL einer Zellviabilität Fleck (siehe Materialtabelle). 15 min bei 4 ° C inkubieren (Kühlschrank oder auf Eis) bedeckt in Folie um vor Licht zu schützen.
3. Während der Inkubation der Zelle Lebensfähigkeit Fleck bereiten des Cocktails von Antikörpern auf der Zelloberfläche Färbung in einem entsprechenden Volumen des MACS-Puffer.
4. Waschen Sie die Zellen mit 1 mL des MACS-Puffer, Zentrifuge (350 X g, 8 min, 4 ° C), und aufzuwirbeln Sie jede Zelle Pellet mit 100 µL des Antikörpers cocktail. Inkubation für 30 min bei 4 ° c lichtgeschützt
   Hinweis: Jeder Flow Cytometry Antikörper ist einzigartig, und es ist sehr nützlich und empfehlenswert zu bestimmen, die optimale Menge von Antikörpern, die durch die Durchführung einer Dosis-Titration-Kurve für jeden spezifischen Antikörper benötigt.
5. Waschen Sie die Zellen zweimal mit 1 mL des MACS-Puffer und Aufschwemmen der Splenocyten in einer entsprechenden Menge an MACS-Puffer für durchflusszytometrischen Analyse.

Ergebnisse

Abbildung 1 stellt eine schematische Darstellung der oben beschriebenen Schritte. Isolierte murinen Milz sind für CD11c sortiert⁺ DCs durch magnetische Zelle sortieren und vergoldet in entweder normales Salz (NS; 150 Mmol NaCl) oder hohen Salz Medien (HS; 190 Mmol NaCl) für 48 h CD11c⁺ DCs werden dann mit einem Retro-Orbital adoptively übertragen Injektion zu naive Empfänger Mäuse. Zehn Tage später, werden Mäuse mit osmotischen Minipumps...

Diskussion

In das aktuelle Protokoll haben wir Verfahren zur Isolierung von CD11c optimiert⁺ DCs aus der Milz von Mäusen und adoptively in naiven Tiere zur Untersuchung der Rolle von DCs in Salz-induzierte Hypertonie überführen. Dieses Protokoll kann angepasst zu isolieren und andere Immunzellen Teilmengen einschließlich adaptive Immunzellen einschließlich T- und B-Lymphozyten, Makrophagen und Monozyten adoptively übertragen werden. Wir haben die Milz Verdauungsprozess zur Erreichung angemessener Zelle überleben und Stab...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
APC/Cy7 Anti-Maus CD11c	Biolegend	117324
autoMACS Running Buffer	Miltenyi Biotec	130-091-221
CD11c Mikroperlen ultrarein	Miltenyi Biotec	130-108-338
Kollagenase D	Roche	11088866001
DNase I	Roche	10104159001
DPBS ohne Calcium und Magnesium	Corning	21-031-CV
FcR Blockierungsreagenz	Miltenyi Biotec	130-092-575
FITC Anti-Maus CD45	Biolegend	103108
GentleMACS C-Röhre	Miltenyi Biotec	130-096-334
GentleMACS Dissoziatorgerät	Miltenyi Biotec	130-093-235	Verwendungsprotokoll: Milz 04.01
LIVE/DEAD fixierbares violettes Färbeset für tote Zellen	Invitrogen	L34964
LS Säulen	Miltenyi Biotec	130-042-401
QuadroMACs Trenner	Miltenyi Biotec	130-090-976
RPMI 1640 mittel...	Gibco	11835-030