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Probenvorbereitung für Masse-Massenspektrometrie-basierte Proteomics Analyse der okulären Mikrogefäßen

DOI:

10.3791/59140

⸱

February 22nd, 2019

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1Department of Ophthalmology, University Medical Centre of the Johannes Gutenberg University Mainz

* These authors contributed equally

In This Article

Summary

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Proteome Charakterisierung der okulären mikrovaskuläre Betten ist von zentraler Bedeutung für tiefes Verständnis für viele okulären Erkrankungen beim Menschen. Diese Studie zeigt eine effektive, schnelle und robuste Methode zur Proteingewinnung und Probenvorbereitung aus kleinen Blutgefäßen beschäftigt porcinen kurzen hinteren ciliary Arterien als Modell-Schiffe für Masse-Massenspektrometrie-basierte Proteomics Analysen.

Abstract

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Die Verwendung von isolierten okulären Blutgefäße in vitro zu entschlüsseln, die pathophysiologischen Zustand des Auges mit fortgeschrittenen technologischen Ansätzen hat unser Verständnis bestimmter Krankheiten erheblich erweitert. Massenspektrometrie (MS)-basierte Proteomics entstanden als ein mächtiges Werkzeug, um Änderungen in den molekularen Mechanismen und Protein Signalwege in der vaskulären Betten in Gesundheit und Krankheit zu entwirren. Probe Vorbereitungsschritte vor MS-Analysen sind jedoch entscheidend für reproduzierbare Ergebnisse und ausführliche Aufklärung des komplexen Proteome zu erhalten. Dies ist besonders wichtig für die Vorbereitung der okulären Mikrogefäßen, wo die Menge der Probe für Analysen zur Verfügung ist oft begrenzt und somit eine Herausforderung für optimale Proteingewinnung. Dieser Artikel ist bestrebt, eine effiziente, schnelle und robuste Protokoll für die Probenvorbereitung von eine beispielhafte retrobulbären okuläre vaskulären Bett beschäftigt porcinen kurzen hinteren ciliary Arterien anzubieten. Die vorliegende Methode konzentriert sich auf Protein Extraktionsverfahren aus dem überstand und Pellet der Probe nach der Homogenisierung, probieren mit zentrifugalen Filtergeräten vor eindimensionale Gel-Elektrophorese und Peptid-Reinigung Reinigung Schritte für die markierungsfreie Quantifizierung in eine flüssige Chromatographie-Elektrospray-Ionisation-lineare Ionenfalle-Orbitrap-MS-System. Obwohl diese Methode speziell für Proteomics Analysen der okulären Mikrogefäßen entwickelt wurde, haben wir auch überzeugende Beweise bereitgestellt, dass es auch ohne weiteres für andere Gewebe-basierten Proben eingesetzt werden kann.

Introduction

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Die Weiterentwicklung im Bereich der Proteomik, welche Genehmigungen integriert und unübertroffen Daten Sammlung macht, hat unser Verständnis der molekularen Mechanismen, die bestimmte Erkrankungen ebenso wie in reflektiert stark revolutioniert die physiologischen Zustand einer bestimmten Zelle Bevölkerung oder Gewebe1,2,3,4. Proteomics auch erwies sich eine wichtige Plattform in Augenheilkunde aufgrund der Empfindlichkeit und unvoreingenommene Analyse der verschiedenen augenfälligen Proben, die Identifizierung von potenziellen Krankheitsmarker für eventuelle Diagnose und Prognose, als erleichtert belegt elegant durch viele Studien in den letzten Jahren, darunter auch einige von uns1,5,6,7,8,9,10. Allerdings ist es oft schwierig, humanen Proben für Proteomic Analysen aus ethischen Gründen, vor allem in Anbetracht der Notwendigkeit für Kontrollmaterial von gesunden Personen für zuverlässige vergleichende Analysen zu erhalten. Auf der anderen Seite ist es auch schwierig, genügend Proben für optimale und zuverlässige massenspektrometrische Analysen zu erhalten. Dies ist besonders wichtig für die Masse zeitlich begrenzte biologische Materialien wie die Mikro-Blutgefäße des Auges. Eine solche große retrobulbären Blutgefäß, das spielt entscheidende Rolle bei der Regulierung der okulären Durchblutung ist die kurzen hinteren ciliary Arterie (sPCA). Jede Störung oder Anomalien in diesem Kreislauf Bett führen schwere klinische Auswirkungen die Pathogenese verschiedener Sicht lebensbedrohliche Krankheiten wie Glaukom und Nonarteritic anterior ischämische optische Neuropathie (NAION)11 führen kann , 12. Allerdings gibt es einen Mangel an Studien, die Aufklärung der Proteome Änderungen in diesem arteriellen Bett wegen der oben genannten Nachteile. Daher hat in den letzten Jahren die Haus Schwein (Sus Scrofa Domestica Linnaeus, 1758) ein gutes Tiermodell in Augenheilkunde aufgrund der hohen morphologischen und phylogenetischen Ähnlichkeiten zwischen Menschen und Schweinen13entwickelt, 14,15. Porcines okuläre Proben sind leicht zugänglich und vor allem sind genauere Darstellung der menschlichen Geweben.

In Anbetracht der wichtigen Rolle dieser Blutgefäße im Auge, sowie der Mangel an Methoden für effiziente Proteingewinnung und Analysen von diesen Mikrogefäßen gesorgt haben wir zuvor das Proteom von porcinen sPCA mit einer hauseigenen gekennzeichnet. Protokoll, das die Identifizierung der eine hohe Anzahl von Proteinen16geführt. Basierend auf dieser Studie, haben wir weiter optimiert und ausführlichen beschrieben unsere Methodik in diesem Artikel die Proteomanalyse von winzigen Mengen von Proben mit den Schweinen sPCA als Modell Gewebe ermöglicht. Wenn auch das Hauptziel dieser Studie war es, eine Frau-kompatible Methodik für Masse-limitierte okuläre Blutgefäße, haben wir erhebliche experimentelle Beweise bereitgestellt, dass der beschriebene Workflow auch weitgehend auf verschiedene Gewebe-basierten Proben angewendet werden kann.

Es ist vorgesehen, dass dieser Workflow instrumental für Herstellung von qualitativ hochwertigen MS-kompatible Proben von kleinen Mengen von Materialien für die umfassende Proteom-Analyse werden.

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Protocol

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Alle experimentelle Verfahren mit tierischen Proben wurden unter strikter Einhaltung der Association for Research in Vision und Ophthalmology (ARVO) Erklärung für die Verwendung von Tieren in Ophthalmic und Vision Research und von institutionellen Richtlinien durchgeführt. Diese Studie wurde durchgeführt und an der Abteilung für Augenheilkunde, University Medical Center Mainz genehmigt.

Hinweis: Porcines Augen zusammen mit Sehnerv und extraokulären Geweben stammen frisch aus der lokalen Schlachthof sofort Post Mortem. Entkernte Augen wurden an das Labor in eiskalten Phosphat gepufferte Kochsalzlösung (PBS) transportiert und sofort verwendet werden. Die schematische Übersicht des Workflows eingesetzt wird wie in Abbildung 1dargestellt.

(1) Lösungen

  1. Krebs-Henseleit (K-H) vorbereiten zu puffern, wiegen die folgenden Chemikalien (27,68 g NaCl, 8,4 g Nahco33, 1,4 g KCl, 1,18 g MgSO4und 0,64 g KH2PO4) in einem trockenen und sauberen 50 mL konische Zentrifugenröhrchen und , 1,47 g CaCl2 und 8,0 g Glukose in einem anderen Gefäß.
    Hinweis: Die Pulvermischung dieser Chemikalien sollten an einem kühlen und trockenen Ort gespeichert werden. Die CaCl2 und Glukose Pulvermischung wird am besten frisch zubereitet, um Absorption von Feuchtigkeit und verklumpen zu verhindern.
  2. Zur Vorbereitung 200 µL der Extraktion Puffer 2A pro Pellet Probe, Mix 100 µL Extraktion Puffer 2 und 100 µL Reagenz A aus der transmembranen Protein Extraktion kit (siehe B6 in der Table of Materials).
    Hinweis: Aliquoten die Komponenten des transmembranen Protein Extraktion Kit bestehend aus Extraktionspuffer 2, Reagenz A und Protease-Inhibitor cocktail in funktionierende Teile und Store bei-20 ° C für längerem Gebrauch. Vermeiden Sie wiederholtes Einfrieren und Auftauen. Tauen Sie die Reagenzien auf Raumtemperatur (RT) vor Beginn der Pellet-Extraktionsverfahren.
  3. Um Ammonium Bicarbonat (ABC, 100 mM) Lösung vorzubereiten, lösen Sie 0,39 g von ABC in 50 mL entionisiertem Wasser.
  4. Um 10 mM vorzubereiten auflösen 1, 4-Dithiothreitol (DTT) Lösung, 30 mg von DVB-t in 20 mL 100 mM ABC.
  5. Um 55 mM Iodoacetamide (IAA) Lösung vorzubereiten, lösen sich 200 mg der IAA 20 mL 100 mM ABC.
    Hinweis: IAA muss im Dunkeln gehalten werden. Verwenden Sie eine Aluminiumfolie, wickeln Sie die Rohre mit lichtempfindlicher Lösungen.
  6. Vorbereiten von Trypsin-Puffer mit 10 mM ABC und 10 % (Vol / Vol) Acetonitril (ACN). Fügen Sie 1,5 mL Trypsin-Puffer in einer Durchstechflasche mit 20 µg von Trypsin, inhaltlich eine 13 ng/µL Trypsin funktionierende Lösung vorbereiten aufzulösen.
    Hinweis: Sequenzierung Grade modifiziert Trypsin wird geliefert lyophilisiert und muss bei-20 ° C bis zum Gebrauch gespeichert werden.
  7. Um Peptid Extraktionspuffer vorzubereiten, mischen Sie 1:2 (V/V) von 5 % Ameisensäure mit ACN.
    Hinweis: Bereiten Sie alle Lösungen in Schritten 1,3-1,7 frisch kurz vor Gebrauch zu und entsorgen Sie alle nicht verwendeten Datenträger.
  8. Um 0,1 % Trifluoroacetic Säure (TFA) vorzubereiten, mischen Sie 10 µL von TFA mit 10 mL entionisiertem Wasser.

2. Isolierung der kurzen hinteren Ciliary Arterien

Hinweis: Porcines Auge gliedert sich grundsätzlich in die anterior (Abb. 2A) und die hinteren Abschnitte (Abbildung 2B).

  1. Ort des Augapfels in eine Dissektion Kammer mit eiskalten K-H Puffer. Schneiden Sie vorsichtig entfernt umgebenden Muskeln und Gewebe mit einem scharfen Mayo Schere.
  2. Machen Sie einen Schnitt mit einem Skalpell und schneiden Sie den Globus entlang der Äquatorebene mit einem scharfen Mayo Schere, bis das Auge in der vorderen und hinteren Hälften getrennt ist. So viel Glaskörper wie möglich aus der hinteren Hälfte des Auges mit einem Standardmuster Zange entfernen.
    Hinweis: Trennung des Augapfels in zwei Hälften erleichtert die Isolation der sPCA mit Leichtigkeit ohne eine bewegende Auge in die Dissektion Gericht. Dieser Schritt ist jedoch nicht obligatorisch. Die Schiffe können auch ohne Eröffnung des Augapfels isoliert werden.
  3. Verwenden Sie Dissektion Stifte sorgfältig PIN auf der hinteren Hälfte des Auges mit der Netzhaut-Seite nach unten und nach oben in Richtung des Experimentators Sehnerven.
  4. Schneiden Sie vorsichtig das Bindegewebe rund um den Sehnerv, der zugrunde liegenden retrobulbären Gefäßsystem mit einem Student Vannas Feder Schere aussetzen Weg.
  5. Die sPCA ersichtlich als kurze Zweige von Schiffen (zwischen 5-8 Filialen), die in die Lederhaut eindringen und umlaufend umgeben des Sehnervenkopfes (Abbildung 2C). Isolieren der Paraoptic und distale sPCA zusammen mit dem umliegenden Bindegewebe mit einem Paar Typ 5 Präzisions-Pinzetten und Vannas Kapsulotomie Scheren (Abbildung 2D).
    Hinweis: Sicherzustellen Sie, dass die K-H Puffer eiskalte während des Verfahrens isoliert bleibt. Es wird dringend empfohlen, dem Puffer alle 20-30 Minuten, je nach Umgebungstemperatur ändern.

3. die Probenvorbereitung

  1. Sanft die arterielle Segmente mit extra feine Spitze Typ 5 Präzisions-Pinzetten und Vannas Kapsulotomie Scheren unter einem Stereomikroskop entfernen Sie Bindegewebe und spülen Sie die isolierten Arterien in eiskaltem PBS zu entfernen Verunreinigungen und Rückstände Blut.
    Hinweis: Wenn die Proben nicht sofort mit den nächsten Schritten ausgesetzt sind, frieren sie Snap-in flüssigem Stickstoff oder Store in-80 ° C bis zur weiteren Verwendung.
  2. Pool-Arterien von zwei Augen, eine biologische replizieren zu erhalten in 1,5 mL Mikrozentrifugenröhrchen überführen und die Proben unter Verwendung einer Analysenwaage wiegen.
  3. Jedes Rohr hinzufügen eine Mischung aus 0,5 mm und 1,0 mm Zirkonoxid-Perlen, gefolgt von Gewebe Protein Extraktion Reagenz (T-pro; siehe B7 in der Table of Materials).
    Hinweis: Das Volumen des T-pro ist das Gewicht der Proben in jedem Röhrchen mit einem Verhältnis von 1 mL Reagenz auf 50 mg der Probe abhängig. Eine allgemeine Faustregel zu folgen, wenn Rohre Laden für Homogenisierung ein Volumenverhältnis von 1 ist: 1:2 = Beispiel: Perlen: T-pro(Abbildung 3). Verwenden Sie nicht zu groß ein Volumen von dem Extraktionspuffer und zuwenig einen Betrag von Perlen, um ineffiziente Homogenisierung zu verhindern.
  4. Laden Sie die Probenröhrchen in einen Mixer-Homogenisator (siehe D6 in der Table of Materials). Stellen Sie den Timer auf 2 Minuten und Geschwindigkeit Stufe 6 und starten Sie Homogenisierung zu. Nach der Ausführung überprüfen, die Proben für vollständige Homogenisierung und Wiederholungszyklus bis Proben vollständig homogenisiert (Abbildung 3B).
    Hinweis: Insgesamt 24 Probenröhrchen kann in einem Durchlauf homogenisiert werden. Es ist wichtig, die Proben während des Verfahrens der Homogenisierung, Protein-Denaturierung zu minimieren kalt zu halten. Die Kugel-Mixer-Homogenisator in dieser Studie verwendeten hat eine inhärente kühlende Funktion, die die Proben kalt hält. In Fällen, in denen keine interne Kühlung Funktion in den Homogenisator verfügbar ist, können die Proben auf Eis zwischen jedem Lauf gehalten werden.
  5. Sorgfältig pipette Homogenat in frischen Mikrozentrifugenröhrchen. Zentrifugieren Sie Proben bei 10.000 X g für 20 min bei 4 ° C zu unlöslichen Proteine und separate überstand, lösliche Proteine enthalten Pellets. Pipette, überstand sorgfältig in frischen Mikrozentrifugenröhrchen ohne Berührung der Pellet-Schicht (Abb. 3C).
    Hinweis: Überstand und Pellets können in-80 ° C bis zur weiteren Verwendung gespeichert werden.

4. Pellet Verdauung

  1. Jede Probe Pellet 200 µL der Extraktion Puffer 2A und 5 µL Protease-Inhibitor cocktail hinzufügen. Unterbrechen Sie die Pellets mit einer Pipette mehrmals.
    Hinweis: Mischen Sie die Extraktion Reagenzien gut vor dem Hinzufügen zum Pellet. Halten Sie Extraktion Puffer 2A auf Eis und der Proteaseinhibitor bei RT im gesamten Extraktionsverfahren.
  2. Verwenden Sie ein Ultraschall Homogenisator, um das Pellet vollständig zu homogenisieren.
    1. Legen Sie die Amplitude auf 60 und Zyklus 1. Verwenden Sie eine Sonde gemacht aus Titan (Ø 0,5 mm, 80 mm lang), die für Homogenisierung von Proben mit kleinen Mengen (10-500 µL) geeignet ist.
    2. Tauchen Sie die Sonde in das Pellet-Extraktion Puffer-Gemisch, und drücken Sie die Schaltfläche "Start", um die Probe um Ultraschallwellen verfügbar zu machen.
    3. Beschallen Sie die Probe, bis die Pellet-Klumpen vollständig homogenisiert werden. Pause für ein paar Sekunden zwischen jedem Beschallung.
    4. Sichtkontrolle für vollständige Homogenisierung. Mischen Sie das Homogenat mehrmals mit einer Pipette um sicherzustellen, dass es keine Klumpen gibt.
      Hinweis: Die Pellet-Extraktionsverfahren sollte auf Eis, um zu verhindern, dass Protein-Denaturierung durch Wärmeentwicklung während der Homogenisierung (Abbildung 4) durchgeführt werden.

5. Probieren Sie Reinigung und Austausch-Puffer

  1. Zentrifugale Filter Geräte mit 3 kDa cutoff verwenden (siehe D3 in der Tabelle der Materialien) für dieses Verfahren gemäß den Anweisungen des Herstellers mit Änderungen gegebenenfalls. Zunächst legen Sie die Filtereinheit in einem Microcentrifuge Schlauch (zur Verfügung gestellt, in der Filter-Pack).
  2. Pipette 200 µL der Probe Homogenat um einer Filtereinrichtung und 200 µL deionisiertes Wasser in den gleichen Filter hinzufügen. Sicher verschließen (Abb. 5A).
  3. Legen Sie die Filtereinheit in eine Zentrifuge und Spin für 14.000 X g für 15 min bei 4 ° C.
  4. Entfernen Sie das Gerät aus der Zentrifuge und trennen Sie die Filtereinheit mit Probe-Konzentrat aus den Microcentrifuge Schlauch, enthält das Filtrat zu. Entsorgen Sie das Filtrat (Abb. 5B).
  5. Bereiten Sie das Konzentrat durch Zugabe von 400 µL deionisiertes Wasser in die Filtereinheit. Wiederholen Sie die Schritte 5.3 und 5.4 dreimal. Pipette vorsichtig das "gereinigte" Probe-Konzentrat in eine saubere Reaktionscup.
    Hinweis: In der Regel roh 200 µL Probe ergibt ca. 50-70 µL Konzentrat nach der Filtration.
  6. Wiederholen Sie die Schritte 5.1-5.5 für die restlichen Probe Homogenates.

(6) Protein-Messung

  1. Verwenden Sie die Bicinchoninic Säuren (BCA) Protein Assay kit (siehe B5 in der Tabelle der Materialien), um Proteinkonzentrationen der Überstand und Pellet Bruchteile der sPCA Proben auf einer Platte Leser zu bestimmen.
  2. Bereiten Sie die Albumin standard (BSA) Verdünnungen (letzte BSA Konzentrationen liegen zwischen 25 bis 2.000 µg/mL) aus eine 1 mL Ampulle bestehend aus 2 mg/mL BSA, gemäß den Anweisungen des Herstellers.
  3. Pipette 10 µL der einzelnen BSA standard Verdünnung und Probe repliziert (überstand und Pellet) in jede Vertiefung eine 96-Well flach-Boden Mikrotestplatte.
  4. Vorbereiten der BCA arbeiten Reagenz durch Zugabe von 50 Teile des BCA Reagenz A zu 1 Teil des BCA Reagenz B.
    Hinweis: Berechnen Sie das Gesamtvolumen des arbeitenden Reagens benötigt für jede Messung vor der Zubereitung zu und frisch bereiten Sie ausreichendes Volumen anhand der Anzahl von Proben und standard Verdünnungen, untersucht werden zu.
  5. Pipette vorsichtig 200 µL des Reagenz in jede Vertiefung arbeiten BCA. Die Mikrotestplatte abdecken und bei 37 ° C für 30 min inkubieren. Nach dem Abkühlen der Platte auf RT, Messung der Extinktion bei 562 nm auf ein Lesegerät, Platte (siehe D13 in der Table of Materials).
  6. Bestimmen Sie anhand der Standardkurve generiert für jedes BSA Standardkonzentration (µg/mL), die Proteinkonzentrationen der Proben.

(7) eindimensionaler Gelelektrophorese (1DE)

  1. Bereiten Sie die Proben für 1DE vor, wie in Tabelle 1 (für ein Beispiel). Mischen Sie die Probe-Mischung mit einer Pipette gut. Erhitzen Sie die Proben bei 70 ° C für 15 min und Cool, RT
  2. Bereiten Sie 1 x laufen Puffer durch Zugabe von 50 mL MES SDS laufen Puffer in 950 mL entionisiertem Wasser vor. Mischen Sie gut.
  3. Bereiten Sie Betonfertigteile 4-12 % Bis-Tris-Protein-Gele (siehe B4 in der Table of Materials).
    1. Aufschneiden des Kunststoff Beutels zum Entfernen der Gel-Kassette und die Kassette mit entionisiertem Wasser spülen.
    2. Entfernen Sie den Kamm aus der Gel-Kassette in einer fließenden Bewegung, kümmert sich nicht um den Brunnen zu beschädigen.
    3. Spülen Sie sanft die Beladung Brunnen 2-3 Mal mit 1 x laufen Puffer mit einer Pipette. Umdrehen Sie und schütteln Sie die Gel-Kassette, um den Puffer, sicherzustellen, dass es keine Luftblasen in den Brunnen zu entfernen.
    4. Entfernen Sie das weiße Band am unteren Rand der Gel-Kassetten.
  4. Legen Sie Gele (maximal zwei Kassetten) in den Tank-Gel und einmal komplett montiert, sperren Sie Gel Spannung Keil zu.
  5. Füllen Sie der oberen (Kathode) Puffer Kammer mit 200 mL Puffer ausgeführt, bis der Brunnen vollständig bedeckt sind. Auf Lecks prüfen.
  6. Fügen Sie 500 µL Antioxidans (siehe A14 in der Table of Materials) in den Puffer ausgeführt.
    Hinweis: Das Antioxidans ist ein Reagenz Anstand, die mit Proben reduziert mit Reduktionsmittel verwendet werden muss (siehe) Tabelle 1, um die reduzierenden Bedingungen während der Elektrophorese pflegen und Re-Oxidation von empfindlichen Aminosäuren wie Tryptophan zu verhindern und Methionin.
  7. Laden Sie sorgfältig 50 µg Probe pro Bahn mit einer Pipette. Laden Sie dann die bereits gefärbten Protein-Standard als molekulare Masse Marker (siehe A18 in der Table of Materials).
  8. Füllen Sie das Unterhaus (Anode) Puffer mit 600 mL Puffer ausgeführt.
  9. Führen Sie die Gele für ~ 60 min bei einer konstanten Spannung von 175 V. Am Ende des Laufs entfernen Sie vorsichtig das Gel von der Kassette Platte mit einem Gel-Messer.
  10. Übertragen Sie die Gele sorgfältig in ein Gel, die Färbung Feld
    1. Bereiten Sie die Befestigung Lösung frisch bezogen auf die Gesamtzahl Gele, die befleckt werden, gemäß den Anweisungen des Herstellers, wie in Tabelle 2beschrieben.
    2. Schütteln Sie den Gel(s) in der Befestigung Lösung für 10 min bei RT auf einem schaukelnden Plattform.
  11. Entsorgen Sie die Befestigung Lösung und färben Sie die Gele mit kolloidalen blaue Färbung Kit.
    1. Vorbereiten der befleckenden Lösungen frisch bezogen auf die Gesamtzahl von Gelen, die gefärbt werden, müssen gemäß den Anweisungen des Herstellers wie in Tabelle 3beschrieben.
    2. Zuerst messen Sie die richtige Lautstärke und mischen Sie direkt die Komponenten in das Gel Box Färbung mit einem Sternchen (*) markiert. Schütteln Sie den Gel(s) in der Färbelösung ohne Stainer B für 10 min bei RT auf einem schaukelnden Plattform.
    3. Fügen Sie Stainer B direkt in die Färbung Box enthält die * Färbelösung. Achten Sie darauf, Stainer B gut vor Gebrauch schütteln.
      Vorsicht: Vorbereitungsschritte 7.10.1 und 7.11.1 unter einem Abzug durchzuführen.
  12. Schütteln Sie den Gel(s) in der Färbelösung über Nacht für beste Gesamtergebnis.
    Hinweis: Die bunten Bänder sichtbar innerhalb von 10 min nach die Zugabe von Stainer B. Färbung ein Minimum von 3 h erfordert und die Intensität nicht variiert länger stundenlang in der Färbelösung bleibt.
  13. Vorsichtig die Färbelösung zu dekantieren und mit 200 mL entionisiertem Wasser ersetzen. Schütteln Sie die Gel(s) für mindestens 7-8 Stunden im Wasser um den Hintergrund zu löschen.
    Hinweis: Deionisiertes Wasser muss mehrere Male während das destaining Verfahren besser übermäßige Fleck entfernen geändert werden. Die Gel(s) können auch in Wasser für bis zu 3 Tage belassen werden, ohne Kompromisse bei der Protein-Band-Intensität. Wenn die Gel(s) nicht sofort mit den nächsten Schritten ausgesetzt wird, kann es in 20 % Ammonium-Sulfat-Lösung bei 4 ° C für die Langzeitspeicherung gespeichert werden.

8. in-Gel Tryptic Verdauung

Hinweis: Dieses Protokoll ist entsprechend der Methode von Shevchenko Et Al.17, mit geringfügigen Änderungen. Dieses Verfahren sollte durchgeführt werden, in eine laminare Strömung Haube und engagierten Gruppe von Pipetten, Tipps, Röhren und Glaswaren speziell für diesen Zweck zu verwenden. Tragen Sie Handschuhe und entsprechenden Labor-Bekleidung zu allen Zeiten, Keratin und andere Verunreinigungen zu verhindern. Bereiten Sie alle Lösungen und Reagenzien in diesem Verfahren kurz vor der Verwendung vor.

  1. Verbrauchsteuern Sie die Protein-Bands aus dem Gel mit sauberen, neuen Mikrotom klingen. Schneiden Sie die Band in kleine Stücke (ca. 1 x 1 mm bis 2 mm x 2 mm). Übertragen Sie die Gel-Stücke sorgfältig in 1,5 mL Mikrozentrifugenröhrchen.
    Hinweis: Stücke, die zu klein sind können Pipettenspitzen verstopfen und größere Stücke reduzieren Peptid Erholung. Vorsicht bei Verwendung von Mikrotom klingen, die sehr scharf sind.
  2. Entfärben
    1. Fügen Sie 500 μL entfärben-Lösung mit 100 mM ABC Lösung/ACN (1:1, V/V) und inkubieren Sie Proben bei RT 30 min mit gelegentlichen schütteln oder aufschütteln.
    2. Sorgfältig die Pipette die destaining Lösung. Sichtkontrolle für alle Rohre mit restlichen Fleck. Wiederholen Sie Schritt 8.2.1 Wenn Gel Stücke noch blau gefärbt sind.
  3. Reduktion und Alkylierung
    1. ~ 400 µL frisch zubereitete DVB-t-Lösung hinzufügen und brüten bei 56 ° C für 30 min. darauf achten, dass die Lösung komplett Gel Stücke umfasst. Sorgfältig die reduzierenden Lösung pipette und entsorgen.
    2. Fügen Sie hinzu ~ 400 µL frisch zubereitete IAA-Lösung und inkubieren Sie im Dunkeln bei RT für 30 min. entfernen die Alkylantien mit einer Pipette zu puffern und entsorgen.
  4. Verdauung
    1. Fügen Sie 500 µL ordentlich ACN für 10-15 min bei RT hinzu, bis das Gel Stücke schrumpfen und undurchsichtig. Pipette, ACN und lufttrocknen Gel Stücke für 5-10 min unter der Haube.
    2. Pipette 50 µL Trypsin-Lösung in jedem Röhrchen um die Gel-Stücke vollständig zu bedecken. Inkubieren Sie die Röhren in 4 ° C für 30 min.
    3. Prüfen Sie nach 30 min jedes Rohr alle Trypsin-Lösung von Gel-Stücke aufgenommen worden. Fügen Sie ausreichendes Volumen an Trypsin-Puffer (50-100 µL, je nach Volumen in der Röhre) um die Gel-Stücke vollständig zu bedecken, falls erforderlich. Die Proben über Nacht bei 37 ° c inkubieren
  5. Peptid-Extraktion
    1. Pipette vorsichtig die extrahierten Peptidlösung vom Röhren und Transfer Mikroröhrchen reinigen. Trocknen des Überstands in einem zentrifugalen Vakuum-Verdampfer.
      Hinweis: Verwerfen Sie die restlichen Stücke Gel nicht.
    2. 100 µL Extraktionspuffer hinzufügen (siehe Schritt 1,7) zu jedem Rohr und inkubieren Sie für 30 min bei 37 ° C mit schütteln.
    3. Pipette des Überstands in der gleichen Mikroröhrchen mit die extrahierten Peptide nach den jeweiligen Bands und trocknen nach unten in einer Vakuum-Zentrifuge.
      Hinweis: Wenn nicht sofort verwendet, können getrocknete Peptid-Extrakte bei-20 ° C bis zu mehreren Monaten bis zur weiteren Verwendung gespeichert werden.

9. Peptid-Reinigung

Hinweis: Dieses Peptid Beispielprozedur Entsalzung und Reinigung erfolgt mit dem Einsatz von C-18 -Pipettenspitzen (siehe C15 in der Table of Materials). Verwenden Sie einen neuen Tipp für jede Probe.

  1. Bereiten Sie die folgenden Lösungen frisch konische Zentrifuge Rohren und aliquoten für das Peptid Reinigungsprozedur in 2 mL Mikrozentrifugenröhrchen zu, wie in Tabelle 4dargestellt. Eine Zusammenfassung der Rohre für die Peptid-Reinigung ist wie folgt: Tube (Probe-Lösung), Schlauch B (Benetzung Lösung), Tube C (Gleichgewichtherstellung Lösung), Rohr D (Waschlösung), Rohr E (Elution Lösung), Rohr F (einem 2 mL oder 5 mL Microcentrifuge Leerrohr, je nach die Anzahl der Proben für die Abfallentsorgung gereinigt werden), und Rohr G (eine saubere, leere Reaktionscup, Kapazität 0,2 mL).
  2. Rekonstituieren getrocknete Peptid Auszüge aus Schritt 8.6.3 mit 10 µL von 0,1 % TFA. Dieses Rohr ist Rohr A. bezeichnet.
  3. Beschallen Sie Röhren A in ein Ultraschallbad mit Eis für 5 min.
  4. Spin-down der Probenlösung in einer Benchtop-Zentrifuge bei 1.000 X g für 1 min.
  5. Die maximale Lautstärke-Einstellung von 10 µL einer Mikropipette P10 gesetzt und befestigen Sie eine C-18 -Pipettenspitze sicher.
  6. Tauchen Sie die Pipettenspitze in die Benetzung Lösung (Rohr B) und in das Verpackungsmaterial abzusaugen Sie vorsichtig. Verzichten Sie langsam dem Abfall in Rohr F. Wiederholen Sie diesen Schritt mindestens 7-8 Mal.
    Hinweis: Drücken Sie die Pipette Kolben zum Stillstand und langsam loslassen oder Kolben während des Verfahrens zu verzichten. Treffen Sie Vorkehrungen, nicht um Luftblasen in die Spitzen einzuführen, während dafür maximale Peptid-Bindung an die C18-Säule pipettieren.
  7. Equilibrate der Tipp für Peptid-Bindung durch Absaugnadeln 10 µL Gleichgewichtherstellung Lösung im Rohr C. die Lösung zu verwerfen und wiederholen Sie diesen Vorgang 3 bis 4 Mal.
  8. Als nächstes aspirieren Sie und verzichten Sie Musterlösung in Rohr A mehrmals (abhängig von der entsprechenden Gel Band Dicke) zu, um die Peptide Spalte ein Trinkgeld zu binden.
    Vorsicht: Die Aspiration und Dispensierschritte während der Binding-Prozedur (Schritt 9,8) erfolgen im Rohr A. Verzichten Sie die Beispiellösung zu verschwenden nicht.
  9. Waschen Sie die Pipettenspitze C18 durch Absaugen der Waschlösung in Rohr D und verwerfen es unnötig (Rohr F) 4 bis 5 Mal.
  10. Zu guter Letzt eluieren Sie gebundene Peptide durch die Elution Lösung (Rohr E) pipettieren und Verzicht auf das Laufmittel in Rohr G.
  11. Wiederholen Sie die ganze Schritte 2 bis 3 Zyklen pro Probe zu Probe steigern.
  12. Entsorgen Sie die Spitze nach einer Probereinigung und verwenden Sie einen neuen Tipp für das nächste Beispiel.
  13. Trocknen Sie die gereinigten Peptid-Eluate in einem Vakuum Konzentrator.
    Hinweis: Die gereinigten Proben können nun für LC-MS/MS-Analysen in der LC-ESI-LTQ-Orbitrap MS-System. Speichern Sie die getrockneten Proben in-20 ° C bis zur weiteren Verwendung.

10. flüssige Chromatographie-Elektrospray-Ionisation-MS/MS-Analysen

Hinweis: Markierungsfreie quantitative Proteomik Analyse ist auf eine flüssige Chromatographie-Electrospray Ionisierung-lineare Ionenfalle-Orbitrap (LC ESI LTQ Orbitrap) MS-System durchgeführt. Die LC besteht aus Rheos Allegro quartäre Pumpe ausgestattet mit einem Online-Degasser (gekoppelt an ein HTS PAL Autosampler, und das System besteht aus einer 30 x 0,5 mm C18 Pre-Spalte mit einer 150 mm x 0,5 mm C18 Spalte verbunden. Verwendung reverse Phase wässrige Lösungsmittel A bestehend aus LC-MS Grade Wasser mit 0,1 % (V/V) Ameisensäure und organische Lösungsmittel B bestehend aus LC-MS Grade Acetonitril mit 0,1 % (V/V) Ameisensäure. Verwenden Sie die Steigung mit einer Laufzeit von 60 min pro Gel Band, wie ausführlich in unseren früheren Studien6,16beschrieben.

  1. Auflösen der gereinigten Peptid Proben in 10 µL von 0,1 % TFA. Beschallen Sie die Proben für 5 min auf Eis.
  2. Pipette 10 µL Proben in einem V-Boden-96-Well-Platte und mit einer klaren, selbstklebende Abdeckfolie verschließen.
  3. Übertragen Sie die Platte auf den Autosampler.
  4. Verwenden Sie die folgende Steigung für jede Laufzeit 60 min: 0-35 min (15-40 % Lösungsmittel B), 35-40 min (40-60 % Lösungsmittel B), 40-45 min (60-90 % Lösungsmittel B), 45-50 min (90 % Lösungsmittel B), 50-53 min. (90: 10 % Lösungsmittel B) und 53-60 min (10 % Lösungsmittel B).
  5. Verwenden Sie die folgenden massenspektrometrischen Bedingungen des Instruments: positive Ionen Electrospray Ionisierung Modus, Spray Spannung (2,15 kV), Kapillare Temperatur (220 ° C), datenabhängige Akquisitionsmodus, automatische Erfassung Umschalten zwischen Orbitrap-MS und LTQ MS/MS, Orbitrap Auflösung (30.000), m/Z-Reihe (300 bis 1.600), Ziel automatische Verstärkungsregelung (AGC, 1.0 x 106 -Ionen), interne Rekalibrierung (Polydimethlycyclosiloxane [PCM] bei m/Z 445.120025 Ionen in Echtzeit), sperren Sie Option "Masse" im MS-Modus aktiviert, Tandem-Daten durch Auswahl der Top 5 intensivsten Vorläufer Ionen, weitere Fragmentierung durch Kollision-induzierte Dissoziation (CID), normalisiert Aufprallenergie (NCE, 35 % mit Aktivierungszeit von 30 ms mit Wiederholungsanzahl von 3) und dynamische Dauer (600 s).
    Hinweis: Die daraus resultierende fragmentierten Ionen werden in der LTQ aufgezeichnet.
  6. Führen Sie mindestens drei biologische Wiederholungen für jede Probe.

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Results

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Begrenzten Stichprobe Verfügbarkeit ist einer der großen Nachteile in Augenheilkunde. Dementsprechend ergeben Extraktionsmethoden für optimale Protein von kleinen Mengen an Proben wie okuläre Blutgefäße oft umstritten sind. Bis heute gibt es ein Mangel an Methoden besonders Proteingewinnung aus retrobulbären Blutgefäßen versorgt. Daher, als ein erster Schritt in der Optimierung der Methode sowie eine Proof-of-Principle zum Vergleich der Wirksamkeit und Robustheit von mehreren allgemein be...

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Discussion

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Umfassende Proteom Profilierung der unterschiedlichsten okuläre Proben ist eine wichtige und unverzichtbare erste Schritt, die molekularen Mechanismen und Signalwege verwickelt in Gesundheit und Krankheit aufzuklären. Um qualitativ hochwertige Daten zu erhalten und die Reproduzierbarkeit der Ergebnisse aus diesen Analysen zu gewährleisten, die vorhergehenden Probe Vorbereitungsschritte sind von entscheidender Bedeutung, wie hervorgehoben in einer Rezension von Mandal Et Al., die eingehende diskutiert die Probe Verarbeitu...

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Acknowledgements

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Dr. Manicam stützt sich auf die interne Universität Forschungsförderung (Stufe 1) aus dem Universitätsklinikum der Johannes-Gutenberg-Universität Mainz und ein Stipendium der Deutschen Forschungsgemeinschaft (MA 8006/1-1).

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
A. Chemikalien
1, 4-Dithiothreitol (DTT)Sigma-Aldrich1.11474
Calciumchlorid-Dihydrat (CaCl2)   Carl Roth 5239,12,5 Mio. M 
Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) von Dulbecco Thermo Fisher Scientific14190169
Ameisensäure (CH2O2)AppliChemA0748
Acetonitril in HPLC-Qualität (ACN, C2H3N)AppliChemA1605
Methanol in HPLC-Qualität (CH3OH)Fisher ScientificM/4056/17
Wasser in HPLC-Qualität AppliChemA1589
Iodacetamid (IAA)Sigma-AldrichI6125
Kaliumchlorid (KCl)   Carl Roth 6781,14,7 Mio. M 
Kaliumdihydrogenphosphat (KH2PO4)  Carl Roth 3904,21,2 Mio. M 
Essigsäure in LC-MS-Qualität  Carl Roth AE69.1
Magnesiumsulfat (MgSO4)     Carl Roth 261,21,2 Mio. M 
NuPAGE AntioxidationsmittelThermo Fisher Scientific (Invitrogen)NP0005
NuPAGE LDS Probenpuffer Thermo Fisher Scientific (Invitrogen)NP00074x
NuPAGE MES SDS Laufpuffer Thermo Fisher Scientific (Invitrogen)NP000220x
NuPAGE Reduktionsmittel für die Probe Thermo Fisher Scientific (Invitrogen)NP000410x
SeeBlue Plus2 vorgefärbtes Protein Standard Thermo Fisher Scientific (Invitrogen)LC5925
Modifiziertes Trypsin in SequenzierqualitätPromegaV5111
Natriumchlorid (NaCl)  Carl Roth 9265,2118,3 Mio. M 
Natriumhydrogencarbonat (NaHCO3)  Carl Roth 965,325 Mio. M 
Trifluoressigsäure (TFA,  C2HF3O2)Merck Millipore108178
α-(D)-(+)- Glukose-Monohydrat  Carl Roth 6780.111 Mio. M 
B. Reagenzien und Kits
0,5 mm Zirkonoxid-Kügelchen Next AdvanceZROB05
1,0 mm Zirkonoxid-Kügelchen Next AdvanceZROB10
Kolloidale Blaufärbung  KitThermo Fisher Scientific (Invitrogen)LC6025Zum Färben von 25 Mini-Gelen pro Kit
NuPAGE 4-12 % Bis-Tri GeleThermo Fisher Scientific (Invitrogen)NP0321BOX1,0 mm, 10-Well-Pierce
Bicinchoninsäure (BCA) Protein Assay Kit Thermo Fisher Scientific23227
ProteoExtract Transmembran-Protein-Extraktionskit, TM-PEKMerck Millipore71772-320 Reaktionen pro Kit
Reagenz zur Extraktion von Gewebeproteinen (T-PER)Thermo Scientific78510
C. Werkzeuge
96-Well-V-BodenplattenGreiner Bio-One651180
Corning 96-Well-Platten mit flachem BodenSigma-AldrichCLS3595-50EA
Einweg-Mikrotomklingenpfm Medical207500014
Einwegskalpelle #21pfm Medical200130021
Dissektionsnadeln Carl RothPK47.1
Extra feine Bonn Schere  Fine Science Tools14084-08
Falcon konische Zentrifugenröhrchen (50 mL)Fisher Scientific14-432-22
Mayo-Schere, robuster Schnitt Fine Science Tools14130-17
Präzisionspinzette  Fine Science Tools11251-105
Präzisionspinzette, gerade mit extra feinen SpitzenCarl RothLH53.1Typ 5
Selbstklebende Siegelfolien für MikrotiterplattenRatiolab (vWR)RATI6018412
Zange mit Standardmuster  Fine Science Tools11000-12
Student Vannas Federschere  Fine Science Tools91501-09
Vannas Kapsulotomie-Schere   Geuder19760  Gerade
Pipettenspitzen mit 77 mm ZipTipC18Merck MilliporeZTC18S096
D. Geräte und Geräte
150 & 0,5 mm BioBasic C18 SäuleThermo Scientific, Rockford, USA72105-150565
30 & 0,5 mm BioBasic C18 Vorsäule Thermo Scientific, Rockford, USA72105-030515
Amicon Ultra-0.5 3K-Zentrifugalfilter-Geräte Merck MilliporeUFC500396Packung mit 96 Stück.
AnalysenwaageSartoriusH51
Autosampler CTC Analytics AG, Zwingen, SchweizHTS Pal
BBY24M Bullet Blender Storm Next AdvanceNA-BB-25
Eppendorf Konzentrator, Modell 5301Sigma-AldrichZ368172
Eppendorf Mikrozentrifuge, Modell 5424Fisher Scientific05-403-93Ungekühlte
Heraeus Primo R ZentrifugeThermo Scientific75005440gekühlter
Labsonic M Ultraschall Homogenisator SartoriusBBI-8535027
LC-MS Pumpe, Modell Rheos AllegroThermo Scientific, Rockford, USA22080
LTQ Orbitrap XL Massenspektrometer Thermo Scientific, Bremen, Deutschland
Multiskan Ascent Plattenleser Thermo Labsystemsv2.6
Rotator mit WirbelneoLab7-0045
Titan-Sonde (Ø 0,5 mm, 80 mm lang)SartoriusBBI-8535612
Ultraschallbad, Typ RK 31Bandelin329
Xcell Surelock Mini CellLife TechnologiesEl0001
Typ

References

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  23. Cottingham, K. 1DE proves its worth... again. Journal of Proteome Research. 9, 1636(2010).

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