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Methodenartikel

Gewinnung von extrazellulären Vesikel aus ganze Gewebe

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DOI:

10.3791/59143

⸱

7. Februar 2019

 ,  , 
1Department of Biomedical Sciences, Florida State University College of Medicine

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Hier bieten wir ein detailliertes Protokoll um kleine extrazelluläre Vesikel (EVs) aus dem ganzen Gewebe, einschließlich Gehirn und Tumor Proben zu isolieren. Diese Methode bietet eine reproduzierbare Technik um EVs aus festen Gewebe für weitere nachgelagerte Analysen zu extrahieren.

Zusammenfassung

Zirkulierenden und interstitielle kleine Membrane-springen extrazelluläre Vesikel (EVs) stellen viel versprechende Ziele für die Entwicklung von neuartigen diagnostische oder prognostische Biomarker Assays und wahrscheinlich dienen als wichtige Akteure bei der Progression von ein breites Spektrum von Krankheiten. Die aktuelle Forschung konzentriert sich auf die Charakterisierung von Vesikeln aus mehreren Zelle sezerniert und Gewebetypen um besser zu verstehen, welche Rolle der EVs in der Pathogenese der Bedingungen, einschließlich Neurodegeneration, Entzündungen und Krebs. Bleiben jedoch weltweit konsistente und reproduzierbare Techniken zu isolieren und reinigen Vesikel im Gange. Darüber hinaus werden Methoden zur Gewinnung von EVs aus festen Gewebe ex Vivo kaum beschrieben. Hier bieten wir ein detailliertes Protokoll zum Extrahieren von kleinen EVs von Interesse aus ganz frischen oder gefrorenen Gewebe, einschließlich Gehirn und Tumor Proben zur weiteren Charakterisierung. Wir zeigen die Anpassungsfähigkeit dieser Methode für mehrere nachgeschaltete Analysen, einschließlich Elektronenmikroskopie und Immunophenotypic Charakterisierung von Vesikeln sowie quantitative Massenspektrometrie EV Proteine.

Einleitung

Kleinen extrazelluläre Vesikel (EVs) gehören Endosomal abgeleitet Exosomen und kleine Membran-Schuppen-Microvesicles, die von breiten biomedizinischen Interesse sind. Kleinen EVs bestehen aus einer heterogenen Bevölkerung von 50-250 nm Membrane-springen Vesikeln mit biologisch aktiven Proteine, Lipide und Nukleinsäuren, die kollektiv geglaubt werden, um in einer Vielzahl von Krankheiten eine wichtige Rolle spielen. Förderung der Forschung hat diese Vesikel in Neurodegenerative und Prion-Erkrankungen, infektiöse Prozesse, Autoimmun- oder entzündlichen Bedingungen und Tumorwachstum und Metastasierung1,2,3 besonders verwickelt. , 4 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13. schnell wachsenden biomedizinischen Forschung in die Bedeutung der EVs in der Pathogenese der Krankheit hat parallel Interesse an der Entwicklung reproduzierbarer und rigoroser Methoden zur Isolierung und Reinigung von diesen Bläschen erzeugt.

Eine historische und aktuelle Herausforderung in EV Charakterisierung wurde die Unfähigkeit, kleine EV Subpopulationen vollständig zu trennen. Diese Herausforderung ist im Wesentlichen auf unser begrenztes Verständnis der unterschiedlichen molekularen Mechanismen für die Biogenese von unterschiedlichen Vesikeln. Überlappende Größe, Dichte und biologischen Fracht zwischen Subpopulationen weitere Umdrehungen diese Unterscheidungen. Teil dieser Herausforderung wurde auch die Verwendung weit unterschiedliche Anreicherung Techniken, Inkonsistenz in nachgelagerte Analyse der isolierten Vesikel in Laboratorien und aufrechtzuerhalten, und untergräbt die globale Anstrengungen zur kategorische EV Populationen zu beleuchten.

Es ist erwähnenswert, dass die Mehrheit der EV Charakterisierung von in-vitro-Sammlung der Zellkultur überstand, mit neueren Studien in vivo Beschreibung Techniken zur Isolierung von Vesikeln aus tierischen oder menschlichen Körperflüssigkeiten, einschließlich Plasma, Urin durchgeführt wurde , und Speichel. EVs in großen Mengen im Umlauf sind, erkannte sie auch, dass diese Vesikel spielen eine wichtige Rolle in der Zell-Zell-Kommunikationsveranstaltungen und in das Interstitium der zellulären Gewebe vorhanden sind. In Zusammenhang mit Krebs möglicherweise interstitielle EVs Modulation der Tumor Mikroumgebung für Krebszelle Aussaat und metastasiertem Wachstum14,15besonders wichtig. Infolgedessen gibt es Wert bei der Entwicklung und Optimierung von Techniken, um Bläschen aus soliden Gewebeproben zu extrahieren. Diese Methoden bieten eine Möglichkeit direkt Orgel - Studium oder Tumor - EVs geerntet von klinischen Proben, einschließlich kleinen Biopsien und teilweise oder vollständige Orgel Resektionen abgeleitet.

In dieser Studie und in einem früheren Bericht, herausgegeben von unserem Labor16wollen wir mehrere wichtige aktuelle EV Bereicherung Methodik Bedenken: 1) um eine reproduzierbare Technik zu isolieren und reinigen EVs nach den höchsten Standards derzeit zu beschreiben auf dem Fachgebiet anerkannt; (2) zu versuchen, kleine EV Subpopulationen hochangereichertes im Endosomal abgeleitet Exosomen zu isolieren; und 3), ein Protokoll für die Gewinnung von diesen Bläschen aus massivem Gewebeproben zur weiteren Charakterisierung zur Verfügung zu stellen.

Vor kurzem, Kowal und Kollegen beschrieben eine relativ kleine Iodixanol Dichtegradient zu trennen und zu reinigen EV Subpopulationen mit größerer Wirksamkeit als vergleichbare Saccharose Dichte Gradienten17. In der zitierten Studie wurden dendritische Zelle abgeleitet EVs, eingefangen in Sekundenbruchteilen relativ geringer Dichte, mit einer Dichte von 1,1 g/mL, in Endosomal Proteine als konsequenteste mit einem hohen Anteil von Exosomen vorhanden in diesem hochangereichertes Bruchteil. Nach Ansicht der Autoren enthalten dieser "bona fide" Exosomal Proteine Tumor Anfälligkeit gen 101 (TSG101), Syntenin-1, CD81 ADAM10, EHD4 und mehrere annexin Proteine17. Diese Technik, um eine Methode der Gewebe Dissoziation von Perez Gonzalez Et al.18 und eine nachfolgende differentielle Zentrifugation Protokoll zum ganzen Gehirn abgeleitet EVs16isolieren beschrieben gelingt später angepasst Wir zeigten auch die Nützlichkeit dieser Methode bei der Charakterisierung EV Proteome durch die Kombination eine sequenzielle Protokoll für nachgeschaltete quantitative und vergleichende Massenspektrometrie vesikuläre Protein, zuvor von unserem Labor19beschrieben. Diese arbeiten parallel, die aus dem Hill-Labor, in dem EVs aus der frontalen Kortex des Gehirns20angereichert wurden.

In dieser Studie wir näher auf diese Technik und die Anwendung des Protokolls vor kurzem von unserem Labor auf die Isolation der EVs aus massivem Lungentumoren zu verlängern. Nach unserer Kenntnis ist dies die erste Studie zu beschreiben, ein Protokoll zur EVs aus ex-Vivo Tumor Proben zu bereichern. Das breite Interesse im Rahmen des EFD als neuartige diagnostischen Biomarkern und ihre Rolle in der Tumorgenese gegeben, wird diese Methode wahrscheinlich für eine wachsende Zahl von wissenschaftlichen Forscher wertvoll erweisen. Aus klinischer Sicht könnte interstitielle EVs großen diagnostischen Wert, vor allem bei Exemplaren Hafen wo histologische Auswertung begrenzt ist. Unsere Hoffnung ist, dass die hier beschriebene Methode eine Grundlage für eine reproduzierbare Technik EVs aus frischen oder gefrorenen tierischen oder menschlichen chirurgische Proben, ebnet den Weg für die künftige Arbeit aufzudecken die bedeutende Rolle in der Pathogenese der Krankheit diese kleine Ernte Bläschen können spielen.

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Protokoll

Ganze Köpfe wurden mit Genehmigung von der institutionellen Tier Nutzung und Pflege Committee (IACUC) von der Florida State University erhalten. Insgesamt zwölf Mäusegehirnen (3 Gehirne aus jeder Altersgruppe: 2, 4, 6 und 8 Monate) aus einem C57BL/6 J Hintergrund für EV-Extraktion, wie zuvor beschrieben16dienten. Lung Tumor Proben wurden von Dr. Mandip Sachdeva unter Zustimmung des Florida Agricultural and Mechanical University IACUC großzügig gespendet. Lungentumore stammen aus der menschlichen Adenokarzinom-Zell-Linie H1975 in immungeschwächte nackten Mäusen Balb/c Nu/Nu angebaut. Daten aus zwei repräsentativen Tumor repliziert werden in dieser Studie hervorgehoben.

Hinweis: Eine schematische Übersicht der Vesikel Isolierung und Reinigung Methode ist in Abbildung 1zur Verfügung gestellt.

(1) Gewebe Dissoziation und differentielle Zentrifugation

  1. Vorbereitung 10 mL Dissoziation-Puffer (10 mg Papain; 5,5 mM L-Cystein; 67 µM 2-Mercaptoethanol; 1,1 mM EDTA) in Hibernate-E Medium pro ca. 0,4 bis 1,0 g des Gewebes. Beachten Sie, dass alle Lösungen bei der EV-Anreicherung und Reinigung gefilterte Reinstwasser verdünnt werden sollte.
  2. Dissoziation-Puffer in einem 50 mL konische Rohr ganz frisches oder gefrorenes Gewebe hinzu, und inkubieren Sie in warmem Wasser Bad bei 37 ° C für 20 min. Gewebe kann in kleinere Bruchstücke vor der Inkubation geschnitten werden, wenn nötig.
  3. Fügen Sie nach der Inkubation Protease und Phosphatase Inhibitoren für eine endgültige 1 X Konzentration des Dissoziation Puffers, enthält das Gewebe hinzu.
  4. Gießen Sie die Lösung mit dem Gewebe in ein Locker geschnittenes Dounce-Homogenisator, und distanzieren Sie sanft das Gewebe mit ca. 30 langsamen Schlägen pro Probe zu. Die Anzahl der Schläge kann je nach Gewebe Konsistenz eingestellt werden.
  5. Transfer dissoziiert Gewebe im Puffer ein 50 mL konische Rohr und Zentrifuge bei 500 X g für 5 min bei 4 ° C, die Zellen und die restlichen faserige oder kohäsiven Gewebefragmente pellet.
  6. Übertragen Sie den Überstand auf eine saubere 50 mL konische Rohr und Zentrifuge bei 2.000 X g für 10 min bei 4 ° C, pellet und entsorgen Sie große Zelltrümmer.
  7. Übertragen Sie den Überstand auf eine saubere 50 mL konische Rohr und Zentrifuge bei 10.000 X g 40 min bei 4 ° C zu unerwünschten größere Bläschen oder kleine Apoptotic stellen Pellets wieder.
    Hinweis: Dieser Pellet kann für zusätzliche Studie von größeren Vesikeln gespeichert werden, falls gewünscht.
  8. Dekantieren Sie den Überstand durch einen 0,45 µm-Filter in einem sauberen 12 mL Ultrazentrifugation Röhrchen.
    Hinweis: Dicht fibrotische Gewebeproben möglicherweise nicht leicht gefiltert werden. Diese Proben können durch ein 40 µm Zelle Sieb gefiltert und dann seriell kleinere Nadeln (18 G, 20 G, 22 G) vor der Filterung durch den 0,45 µm-Filter durchlaufen.
  9. Ultrazentrifugen der Probe bei 100.000 X g für 2 h bei 4 ° C zu kleinen EVs Pellets.
  10. Überstand abgießen und die Ultrazentrifugation Rohre invertiert für ca. 5-10 min, klopfen häufig zu Restflüssigkeit auf den Seiten von Röhren entfernen lassen. Restflüssigkeit kann auch mit einem Absaugnadeln Vakuum Pipette abgesaugt werden.
  11. Wieder aussetzen Sie EV Pellet in 1,5 mL 0,25 M Saccharose-Puffer (10 mM Tris, pH 7.4). Es ist wichtig, die vollständige Resuspension des Pellet-in diesem Schritt zu gewährleisten. Dazu decken Sie die Rohre mit Parafilm vor vortexen EVs in Lösung. Rock die Ultrazentrifuge Rohre für 15-20 min bei Raumtemperatur vor einer endgültigen Wirbel-Mix.
  12. Zentrifugieren Sie kurz die Rohre bei einer Geschwindigkeit nicht mehr als 1.000 X g flüssige Suspension an der Unterseite des Rohres zu erholen.
  13. Fahren Sie mit der gradient Reinigungsschritte unten, oder bei Bedarf speichern Sie EV Aussetzung bei 4 ° C über Nacht.

2. Dichte Gradienten Reinigung

  1. 1,5 mL Saccharose/Tris-Puffer mit EVs zum Erstellen einer endgültigen Lösung mit 30 % Iodixanol fügen Sie 1,5 mL 60 % Iodixanol (Stammlösung in Wasser hinzu). Pipette oben und unten mehrmals um Lösung gründlich zu mischen. Seien Sie vorsichtig zu verlieren in der Pipettenspitze Lösung, da die hohen Iodixanol Konzentration ziemlich dickflüssig ist.
  2. Die 30 % Iodixanol Pufferlösung mit EVs auf den Boden einer 5,5 mL Ultrazentrifugation Röhre zu übertragen.
  3. Mindestens 1,5 mL 20 % und 10 % Iodixanol Lösungen pro Probe Reinstwasser aus 60 % Iodixanol Vorratslösung vorzubereiten.
  4. Messen Sie 1,3 mL 20 % Iodixanol und sorgfältig Schicht über der unteren Verlaufsebene mit Hilfe einer Spritze und Nadel eine 18 G. Um zu vermeiden, mischen die Schichten an der Schnittstelle von Dichte, halten Sie die schräge der Nadel in Kontakt mit der Innenseite des Rohres oberhalb der Meniskus Ultrazentrifugation und fügen Sie die Lösung tropfenweise hinzu.
  5. Layer 1,2 mL 10 % Iodixanol Lösung auf die 20 % Iodixanol Schicht mit der gleichen Technik wie oben beschrieben.
  6. Sorgfältig balancieren Sie und laden Sie die Ultrazentrifugation Rohre in Rotor Eimer und Zentrifuge in ein Schaukel-Eimer-Rotor bei 268.000 X g 50 min bei 4 ° c Legen Sie die Beschleunigungs- und Verzögerungswerte Geschwindigkeiten der Zentrifuge auf die Mindestsätze zulässig, Unterbrechungen der Dichte Schichten zu vermeiden.
  7. Beschriften Sie zehn 1,5 mL Mikrozentrifugenröhrchen für jede Probe zu Bruchteilen 1 bis 10 von der Dichtegradient entsprechen. Bruchteil 1 bezeichnet man als die obersten Bruch, der zuerst entfernt wird, während Bruch 10 der unteren Anteil zuletzt entfernt ist.
  8. Nach Abschluss der gradient Ultrazentrifugation sanft entfernen Sie die Rohre aus dem Rotor-Eimern und in einer stabilen Halterung. Eine sichtbare Band von Vesikeln wird oft in der Fraktion von Interesse gesehen werden. Pipette 10 serielle Bruchteile von 490 µL von der Spitze des Farbverlaufs in die entsprechenden Röhren. Es wird eine kleine Menge Flüssigkeit bleiben an der Unterseite des Rohres, die wahrscheinlich kontaminierende Proteine enthält. In diesem Beispiel kann verworfen, oder als Bruchteil 11 beibehalten, falls gewünscht.
  9. Messen Sie die Brechungsindizes der Fraktionen mit einem Refraktometer. Dies kann auch durchgeführt werden, mit einem Steuerelement Verlauf parallel laufen, wenn Probe Erhaltung notwendig ist. 20-30 µL der einzelnen Fraktionen Iodixanol auf die Oberfläche der Refraktometer mit Pipette, und schätzen die Dichte durch den Vergleich der Brechungsindizes zu bekannten Iodixanol dichten. Beachten Sie, dass Brüche in die Iodixanol-haltige Lösung über Nacht gespeichert werden können, ggf. vor dem fortfahren mit dem nächsten Schritt der Ultrazentrifugation waschen.
  10. Übertragen Sie jede Fraktion auf eine saubere 12 mL Ultrazentrifugation Rohr. 5 mL 1 x Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS; 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 2 mM KH2PO4, pH 7,4) am Rohr und fügen Sie Mischung von Pipettieren langsam rauf und runter hinzu.
    Hinweis: PBS hinzugefügt, um die Proben sollten partikelfreie, werden gewährleistet durch sterile PBS durch einen 0,22 µm Filter Filterung und Lagerung bei Raumtemperatur Salz Niederschlag zu vermeiden.
  11. Fügen Sie eine zusätzliche 6 mL 1 X PBS nach oben und wieder umrühren Sie vorsichtig.
  12. Ultrazentrifugen der Rohre bei 100.000 X g für 2 h bei 4 ° C zu kleinen Bläschen wieder Pellets. Abgießen Sie den Überstand und tippen Sie auf die Rohre trocken ist, bevor die lyse von Vesikeln für Proteinanalytik (Schritt 3) oder Resuspension des EFD zur morphologischen Analyse (Schritt 5).

(3) lyse und Immunoblot Bestätigung der EV-Proteine

Hinweis: Erhaltung der ganzen Vesikel für Morphologische Charakterisierung oder biologische Aktivität erwünscht, können Forscher direkt mit Schritt 5 fortfahren. In ersten Experimenten oder vor der Massenspektrometrie Analyse sollte allen Fraktionen erholt durch Immunoblot Brüche mit EV Proteine bestätigen analysiert werden.

  1. Fügen Sie 40 µL starke Lyse Puffer (5 % SDS, 10 mM EDTA, 120 mM Tris-HCl pH 6,8, 2,5 % 2-Mercaptoethanol, 8 M Harnstoff) mit dem Zusatz von Protease-Inhibitor um EFD für Proteinanalytik lysieren hinzu, EV Pellet in Ultrazentrifuge Rohr.
    Hinweis: Wenn nicht-reduzierenden Bedingungen für Antikörpernachweis von Proteinen gewünscht werden, ersetzen Sie Reinstwasser für 2-Mercaptoethanol in der starken Lyse-Puffer.
  2. Vollständige Resuspension der Pellet und lyse der EVs im Puffer zu gewährleisten, indem man Parafilm über die Ultrazentrifugation tube, vortexen kräftig rocken dann für 20 min bei Raumtemperatur vor einem endgültigen Wirbel.
  3. Kurz Zentrifugieren Sie bei 1.000 X g für 30-60 s, um das gesamte Sample Volume wiederherzustellen. Übertragen Sie die Probe auf eine neue 1,5 mL Microcentrifuge Schlauch und speichern bei-20 ° C bis-80 ° C bis Weiterverarbeitung.
  4. Die Proben für eine Endkonzentration von 1 X um gereinigte Lysates Immunoblot Analyse vorzubereiten, 5 X Laemmli Probenpuffer (10 % SDS, 250 mM Tris pH 6.8, 1 mg/mL Bromophenol blue, 0,5 M DVB-t, 50 % Glycerin, 5 % 2-Mercaptoethanol) hinzugefügt.
    Hinweis: Wenn nicht-reduzierenden Bedingungen gewünscht werden, ersetzen Sie die DVB-t und 2-Mercaptoethanol mit Reinstwasser.
  5. Wenn ganze Gewebe Homogenat Kontrollen sind erwünscht, lösen Sie das Gewebe in der Harnstoff-haltige starke Lyse Puffer oben erläuterten mit Protease-Inhibitor, anschließend Zentrifugieren bei 10.000 X g für 10 min die restlichen extrazellulären Matrix, ganze Zellen zu verwerfen oder intakte Zelltrümmer. Die Gewebe-Homogenat für eine Endkonzentration von 1 X 5 X Laemmli Probenpuffer hinzufügen.
  6. Die Probenpuffer mit EV oder Gewebe homogenisierte Proben bei 95 ° C für 5-10 min kochen, dann gleich Ladevolumen (aus den Gegenwert von 0,1-0,3 g Gewebe Ausgangsmaterial; 1-2 µg des gereinigten EV Protein) der Fraktionen 1-10 zu einem 10 % SDS-PAGE Gel. Laden Sie gleich Masse von Gewebe Homogenat. Größeres Volumen der Proben wird möglicherweise für die Erkennung von unempfindlicher Antikörper benötigt.
  7. Gehen Sie mit Gelelektrophorese und Western-Blot Analyse wie zuvor detaillierte21 EV Proteine in den gereinigten Lysates bestätigen und relative Häufigkeit der EV in Sekundenbruchteilen zu vergleichen.
    Hinweis: Sobald EV Protein in Einklang Bruchteilen reproduzierbar nachgewiesen wurde, kann die endgültige Ultrazentrifugation Wäsche im Schritt 2.12 beschrieben auf Farbverlauf Bruchteile von Interesse beschränkt werden.

(4) EV Protein Quantifizierung

  1. Ein Waschmittel und Harnstoff-kompatibel Fluoreszenz basierende Assays zu verwenden, wenn sensible Quantifizierung der EV Proteine zur weiteren Analyse gewünscht wird (siehe Tabelle der Materialien). Beachten Sie, dass einige Fluoreszenz basierende Assays kompatibel mit dem Bromophenol Blue im Probenpuffer Laemmli sind, direkte lyse des Pellet-EV (in Schritt 2.12) in diesem Puffer zu erleichtern, falls gewünscht.
  2. Wenn die oben genannten Fluoreszenz-basierte Protein Quantifizierung Kit verwendet wird, vor Ort 1 µL der Probe oder Standards in mindestens auf dem mitgelieferten Filterpapier duplizieren und weiter Protein Quantifizierung nach Herstellerangaben.

5. Charakterisierung von EV Morphologie

  1. Um ganze Vesikel untersuchen nach der abschließende Zentrifugationsschritt in Schritt 2.12 waschen, auszusetzen Sie gründlich neu EV Pellet in partikelfreie 1 X PBS. Store EVs bei 4 ° C nicht länger als eine Woche bis Verarbeitung, Frost-Tau-Zyklen zu vermeiden.
    Hinweis: Es ist vorteilhaft, Brüche, die konsequent mit angereicherten EV Protein durch Immunoblot Analyse, morphologische Analysen zu Bruchteilen von Interesse zu begrenzen zuvor bestätigt haben.
  2. Führen Sie Nanopartikel tracking-Analyse auf ganze EV-Proben, die Konzentration und Größe von Vesikeln in Vorbereitungen, wie zuvor detaillierte22bestimmen.
  3. Charakterisieren Sie EV Morphologie zu und bestätigen Sie Größenmessungen durch Elektronenmikroskopie von Vesikeln, zu, falls gewünscht. EM-Raster aus Vesikel Suspensionen nach Schritt 5.123zubereitet werden oder alternativ als Block Vorbereitungen24 von Pellets nach Schritt 2.12 verarbeitet werden können.

6. in-Gel Reinigung und Trypsin-Verdauung für Massenspektrometrie Analyse

  1. Charakterisierung von EV Proteome durch Massenspektrometrie gewünscht, laden Sie gleich Masse (mindestens 10 µg Protein) der Fraktionen, die EVs in einer vorgegossenen Polyacrylamid-Gel zu trennen und zu reinigen Proteine enthalten. Hersteller gelieferten vorgegossenen Gele werden bevorzugt, die Verringerung der Potenzial kontaminierende Proteine (z.B. Keratin) in den Proben eingeführt.
  2. Führen Sie das Beispiel mindestens 0,5 Zoll in das Polyacrylamid-Gel für Proteinreinigung, dann fix und Flecken mit Coomassie-Färbung, wie oben beschrieben im Detail25.
  3. Schneiden Sie die Bahnen in 1 mm3 Würfel für Trypsin-Verdauung, als zuvor detaillierte19,26.
  4. LC-MS/MS-Instrument für die Trennung auf die Trennsäule und anschließende Analyse bestücken Sie 5 µL verdaute Peptid Probe durch Massenspektrometrie im Detail16angegebenen Parametern.

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Ergebnisse

Eine schematische Übersicht über die Gewebe Dissoziation, differentielle Zentrifugation und gradient Reinigung von Vesikeln wird in Abbildung 1angezeigt. Die morphologische und Immunophenotypic Bestätigung der Gradient-gereinigte EVs wird in Abbildung 2hervorgehoben. Ein Diagramm der reproduzierbaren dichten nach Ultrazentrifugation des 10-30 % Iodixanol Verlaufs mit zwei unterschiedlichen Vesikel Populationen migrieren nach oben...

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Diskussion

Viel wissenschaftliches Interesse wurde im Hinblick auf die Rollen, die kleine EVs in der Mikroumgebung Tumor sowie in Organentwicklung, Reifung und Funktion spielen generiert. Insgesamt bietet diese Studie einen optimierten Workflow für die Gewinnung von intakten EVs aus Gesamt-Hirn oder Tumor Proben. Während hier wir einfach die Anwendbarkeit dieser Technik auf Lunge Tumor abgeleitet EVs zeigen, könnte diese Methode einfach angepasst werden für die Arbeit auf anderen festen Geweben, Möglichkeiten für weitere Ex Vivo Ch...

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Offenlegungen

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Danksagungen

Die Autoren danken Dr. Richard Nowakowski und die Florida State University Labor Tier Ressourcen für die Bereitstellung und Pflege für die Tiere zu diesem Protokoll respektvoll zu entwickeln. Wir danken Liu Xia, Dr. Rakesh Singh und Florida State University translationale Science Laboratory für Hilfe mit der Massenspektrometrie Arbeit zur nachgelagerten Vesikel Charakterisierung sowie die FSU Biological Science Imaging Resource-Anlage für die Verwendung des Transmissions-Elektronenmikroskop in dieser Studie. Zu guter Letzt danken wir Dr. Mandip Sachdeva (Florida A & M University) für die Spende der Tumor Proben bei der Entwicklung dieser Methode verwendet. Diese Studie wurde unterstützt durch Zuschüsse aus Florida Department of Health Ed und Ethel Moore Alzheimer Krankheit Forschungsprogramm an D.G.M. und J.M.O (6AZ11) und das National Cancer Institute der National Institutes of Health unter Prämiennummer vergeben R01CA204621 an D.G.M. vergeben

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
0,45 &Mikro; m FilterVWR28145-505
12 mL UltrazentrifugenröhrchenBeckman Coulter331372
5,5 mL UltrazentrifugenröhrchenBeckman Coulter344057
Anti-Alix AntikörperSanta Cruzsc-7129
Anti-CalnexinAntikörper Santa Cruzsc-11397
Anti-CD63 AntikörperAbcamab59479
Anti-CD81-AntikörperSanta Cruzsc-9158
Anti-Flotillin 2-AntikörperSanta Cruzsc-25507
Anti-HSC70-AntikörperSanta Cruzsc-7298
Anti-Syntenin-1-AntikörperSanta Cruzsc-100336
Anti-TSG101-AntikörperSanta Cruzsc-7964
EZQ Protein-QuantifizierungskitThermoFisher ScientificR33200
FA-45-6-30 Rotor Eppendorf5820715006
FEI CM120 ElektronenmikroskopTSS-Mikroskopie
Anti-Kaninchen-IgG (Fab-Fragment)Genetex27171
HALT-Phosphatase-Inhibitor (100-fache Lösung)ThermoFisher Scientific78420
HALT-Protease-Inhibitor (100-fache Lösung)ThermoFisher Scientific78438
Hibernate E mediumThermoFisher ScientificA1247601
MLS-50 AusschwingrotorBeckman Schar367280
NanoSight LM10Malvern
Optima MAX-XP Tisch-Ultrazentrifuge  Beckman Coulter393315
Optima XE-100 UltrazentrifugeBeckman CoulterA94516
OptiprepSigmaD155660% Iodixanol in steriler Wasserlösung
Q Exaktives HF-MassenspektrometerThermoFisher Scientific
Kaninchen Anti-Ziegen-IgGGenetex26741
Kaninchen Anti-Maus IgGGenetex26728
Refracto 30PX (Refraktometer)Mettler Toledo51324650
S-4-104 RotorEppendorf5820759003
SW 41 Ti Schwingschaufel RotorBeckman Coulter333790
Tischzentrifuge 5804REppendorf22623508

Referenzen

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