Methodenartikel

Freistehende Leaf Assays zur Vereinfachung der Genexpressionsstudien in Kartoffeln während des Befalls durch Kauen Voninsekt Manduca sexta

DOI:

10.3791/59153

⸱

15. Mai 2019

 ,  ,  , 
1Invasive Insect Biocontrol and Behavior Lab, United States Department of Agriculture (USDA), Agricultural Research Service (ARS), 2Genetic Improvement for Fruits and Vegetables Lab, USDA-ARS

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Die vorgestellte Methode schafft natürliches Pflanzenfresser schädigendes Pflanzengewebe durch die Anwendung von Manduca sexta Larven auf abgetrennte Blätter von Kartoffeln. Das Pflanzengewebe wird auf die Expression von sechs Transkriptionsfaktor-Homologen geprüft, die an frühen Reaktionen auf Insektenkraut beteiligt sind.

Zusammenfassung

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Die multitrophische Natur von Genexpressionsstudien von Insektenkraut erfordert eine große Anzahl biologischer Replizieren, wodurch einfachere, schlankere Kräuterschutzprotokolle erforderlich sind. Störungen von Kauinsekten werden in der Regel in ganzen Pflanzensystemen untersucht. Während diese ganze Organismus-Strategie beliebt ist, ist es nicht notwendig, wenn ähnliche Beobachtungen in einem einzigen abgetrennten Blatt repliziert werden können. Es wird davon ausgegangen, dass die für die Signaltransduktion erforderlichen Grundelemente innerhalb des Blattes selbst vorhanden sind. Bei frühen Ereignissen in der Signaltransduktion müssen Zellen nur das Signal von der Störung empfangen und an benachbarte Zellen übertragen, die auf Genexpression untersucht werden.

Die vorgeschlagene Methode ändert lediglich den Zeitpunkt der Ablösung. In ganzen Pflanzenexperimenten sind Larven auf ein einzelnes Blatt beschränkt, das schließlich von der Pflanze gelöst und auf Genexpression untersucht wird. Wenn die Reihenfolge der Exzision umgekehrt wird, von der letzten in ganzen Pflanzenstudien, auf den ersten in der freistehenden Studie, wird das Fütterungsexperiment vereinfacht.

Solanum tuberosum var. Kennebec wird durch Knotentransfer in einem einfachen Gewebekulturmedium vermehrt und auf Wunsch auf den Boden übertragen. Die Blätter werden von der Mutterpflanze entfernt und in Petrischalen verlegt, wo der Fütterungstest mit den Larvenstadien von M. sextadurchgeführt wird. Beschädigtes Blattgewebe wird auf die Expression relativ früher Ereignisse in der Signaltransduktion geprüft. Die Genexpressionsanalyse identifizierte befallspezifische Cys2-His2 (C2H2)-Transkriptionsfaktoren, was den Erfolg der Verwendung von freistehenden Blättern in frühen Reaktionsstudien bestätigte. Die Methode ist einfacher durchzuführen als ganze Pflanzenbefall und verbraucht weniger Platz.

Einleitung

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Herbivory setzt eine Reihe molekularer Ereignisse in Gang, bei denen eine Pflanze sowohl den Angriff identifizieren als auch eine angemessene Reaktion auf ihr Überleben montieren kann. Eine Pflanze erhält zwei grundlegende Hinweise von kauenden Insekten; eine durch die physische Schädigung des Gewebes und die andere durch insektenspezifische Substanzen. Schadensassoziierte molekulare Muster (DAMPs) werden als Reaktion auf Schäden freigesetzt, die durch Larvenmspiele verursacht werden, und lösen eine klar definierte Wundreaktion aus, die zu einer Erhöhung des Hormons Jasmonsäure und der Transkription der Verteidigungsgene1führt. Eines der bekanntesten DAMPs ist systemin, ein Polypeptid, das durch die Spaltung des größeren Prosystemin-Proteins gebildet wird, nachdem ein Blatt 2,3verwundet wurde. Die Jasmonsäure-Wundreaktion wird durch pflanzenfressende molekulare Muster (HAMPs) weiter moduliert, die aus Raupenspeichel, Darminhalt (regurgitant) und Kot (frass) abgeleitet werden können4. Insekten verwenden diese Substanzen, um entweder die Abwehrzuwehr zu steigern oder zu umgehen5. Transkriptionsfaktoren leiten dann die Botschaft von Hormonsignalen in der Abwehrreaktion über die Regulierung der nachgeschalteten Abwehrgene6,7,8weiter.

Einige Pflanzen-Insekten-Interaktionsstudien, die in Laborumgebungen verwendet werden, sind vom simulierten Typ, mit dem Ziel, die natürliche Methode der Fütterung durch das Insekt zu annähernden. Simuliertes Krautwird wird in der Regel durch die Schaffung künstlicher Schäden an Pflanzengeweben mit verschiedenen Werkzeugen erreicht, die den spezifischen Mechanismus von Insektenmundteilen imitieren, die ausreichen, um die Freisetzung von DAMPs zu verursachen und die Produktion von Verteidigungsgenen auszulösen. Andere insektenspezifische Komponenten wie mundende Sekrete oder Regurgitant werden oft hinzugefügt, um den Beitrag von HAMPs9,10,11zu replizieren. Die Erstellung einer bestimmten Größe und Art der Wunde und die Anwendung präziser Mengen an HAMPs ist ein Vorteil für diese Arten von Studien und kann reproduzierbarere Ergebnisse liefern. Natürliche Pflanzenschutzstudien, bei denen Schäden am Pflanzengewebe durch die Anwendung von felderworbenen oder im Labor gezüchteten Insekten durchgeführt werden, sind oft schwieriger, da Wundgrößen- und HAMP-Mengen durch Insektenverhalten bestimmt werden und die Variabilität der daten. Die natürlichen versus simulierten Methoden und ihre Vor- und Nachteile sind in der Literatur gut diskutiert12,13,14.

Um frühe Signalereignisse wie Transkriptionsfaktoren zu untersuchen, muss ein bestimmter Prozentsatz des Blattes in relativ kurzer Zeit verbraucht werden, so dass Larven sofort zu kauen beginnen und den Verbrauch aufrecht erhalten müssen, bis das Blatt zur Analyse eingefroren ist. M. sexta ist ein gefräßiger Feeder auf mehreren solanaceous Pflanzen während vieler seiner Larvenstadien, so dass es ideal für die Vermittlung von maximalen Schaden in einer relativ kurzen Zeit15. Dies ist praktisch, wenn frühe Signalereignisse untersucht werden, da die Reaktion der Pflanze fast unmittelbar nach einem Insektenkontakt mit der Blattoberfläche16,17auftritt. Die häufig verwendete Clip-Käfig-Methode der Einschließung erweist sich als ungeschickt, da mehrere Käfige während des gesamten Experiments kontinuierliche Anpassungen erfordern würden, um die Entfernung oder Zugabe von Larven zu ermöglichen. Die Blätter müssen auch groß genug und stark genug sein, um mehrere Insekten zu unterstützen, die gleichzeitig füttern. Diese Arten von Kartoffelpflanzen benötigen viel Platz, um die Fütterung zu beobachten. Larven werden oft an die Unterseite der Blattoberfläche verlagert, was auch Fütterungsbeobachtungen recht schwierig macht. Ganze Pflanzen zu verwenden, um diese Experimente durchzuführen, ist eindeutig umständlich.

Die aktuelle Studie verwendet freistehende Blätter, die in Petrischalen isoliert sind, anstatt ganze Pflanzen, um den gesamten Pflanzenansatz für das Studium von Kräutern zu rationalisieren und zu vereinfachen. Die Anwendung des Protokolls in dieser Studie beschränkt sich auf die Beobachtung einer Gruppe von C2H2-Transkriptionsfaktoren, die früh in Kartoffelblättern nach pflanzenfressenden Schäden durch M. sexta Larven induziert wurden.

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Protokoll

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HINWEIS: Das folgende Protokoll ist für eine Person zum Einrichten, Erfassen von Beobachtungen und Sammeln von Proben konzipiert. Mehrere Durchläufe desselben Setups können kombiniert werden, um die biologische Replikation zu erhöhen. Alle zusätzlichen Wiederholungen des Experiments sollten zur gleichen Tageszeit eingerichtet werden, um mögliche tagtägliche Einflüsse auf die Genexpression zu beseitigen. Das Protokoll ist so konzipiert, dass 3 "befallene" Blätter für 5 separate Erntezeitpunkte erstellt werden. Abgestimmte Steuerelementblätter für jeden Zeitpunkt erstellen insgesamt 30 Samples. Das Experiment kann mit einer Vielzahl von Blattgrößen und Larvenstadien durchgeführt werden, aber es wird empfohlen, dass Blattgröße, Larvenstadium und Befallzeit während des gesamten Verfahrens konsistent sein.

1. Zubereitung der Kartoffelpflanzen

HINWEIS: Alle Schritte, die sterile Technik erfordern, müssen in einer Gewebekulturhaube18,19durchgeführt werden.

  1. Bereiten Sie Kennebec-Pflanzen aus der Explantationsquelle vor.
    1. Vorbereiten des Ausbreitungsmediums.
      1. 4,43 g Murashige und Skoog (MS) mit Vitaminpulver, 20 g Saccharose und 2 g Agarersatz zu 1 L Umkehrosmose (RO) gereinigtem Wasser in einem 2 L Kolben mit Spinbar hinzufügen. Kolben auf eine Rührplatte geben und mischen. Stellen Sie den pH-Wert mit NaOH auf 5,8 ein, während Sie weiter rühren.
        HINWEIS: Agar löst sich erst auf, wenn er autoklaviert ist.
      2. 1 ml Konservierungsmittel/Biozid und Autoklav auf Flüssigkeitszyklus für 20 min (121 °C, 101,3 kPa) hinzufügen. Entfernen Sie das Medium unmittelbar nach Demzyklus aus dem Autoklaven und kühlen Sie es auf 50 °C. Übertragen Sie 100 ml steriles und gekühltes Vermehrungsmedium auf sterile Kulturgefäße (z. B. Magenta oder Plantcon) mit steriler Technik in einer Gewebekulturhaube.
    2. Bereiten Sie Explant-Material vor.
      1. Erhalten Sie die Explantationsquelle als Kennebec-Pflanzkartoffeln und entfernen Sie alle Spuren des Bodens, indem Sie mit Demhahn H2O waschen. Sprossen entfernen und mit einem sterilen Skalpell in 2 cm große Stücke schneiden.
      2. Sterilisieren Sie Sprossenstücke durch Einweichen für 15 s in 70% Ethanol, gefolgt von 13 min in 1:1 Bleichmittel (1 Teil RO-Wasser: 1 Teil konzentrierte keimtötende/kommerzielle Bleichmittel). 5 Mal steril h2 Oabspülen.
      3. Übertragen Sie Explantationsmaterial mit Sterilisationsmedium in einer Gewebekulturhaube mit steriler Technik auf sterile Gewebekulturgefäße mit Vermehrungsmedium. Übertragen Sie Gefäße in eine Pflanzengewebekulturkammer und wachsen Sie für 2-u20123 Wochen oder bis sich Pflanzenbeilage bei 24 °C, 16 h Licht (140 x-m -2s-1)/8 h dunkle Photoperiode bildet.
  2. Bereiten Sie knotenvermehrte Gewebekultur Kartoffelpflanzen vor.
    1. Vorbereiten von Knotentransfermedium.
      HINWEIS: Dadurch werden 10 Gewebekulturgefäße hergestellt, die am selben Tag oder im Voraus verwendet und bei 4 °C bis zum Knotentransfer gelagert werden können.
      1. Fügen Sie 36,43 g Nährstoff-Agar-Mix zu 1 L RO-gereinigtem Wasser in einem 2 L-Kolben mit einem Spin-Bar hinzu. Kolben auf eine Rührplatte geben und mischen. Stellen Sie den pH-Wert mit KOH auf 5,8 ein, während Sie weiter rühren.
        HINWEIS: Agar löst sich erst auf, wenn er autoklaviert ist.
      2. Autoklav auf Flüssigkeitszyklus für 20 min (121 °C, 101,3 kPa). Entfernen Sie das Medium unmittelbar nach Demzyklus aus dem Autoklaven und kühlen Sie es auf 50 °C. Übertragen Sie 100 ml sterilgekühltes Knotentransfermedium auf sterile Kulturgefäße (siehe Materialtabelle)mit steriler Technik in einer Gewebekulturhaube.
    2. Bereiten Sie Knotenschnitte vor.
      1. Erhalten Sie Kennebec-Pflanzen, die aus Explant-Material (hergestellt in Schritt 1.1.2) angebaut werden. Plantlets sollten mindestens 3 bis 4 Knoten (Zweigpunkte) haben. Entfernen Sie die Blätter mit einer sterilen Schere oder einem Skalpell. Schneiden Sie Äste in der Nähe des Hauptstamms, so dass etwa 2 mm Zweiggewebe.
      2. Entfernen Sie Knotenabschnitte vom Stamm, indem Sie etwa 2 mm über und unter jedem Astpunkt oder Knoten schneiden. Anordnen Sie Knotenschnitte in einem sterilen Gewebekulturgefäß, das das Knotentransfermedium (hergestellt in Schritt 1.2.1.2) in der gleichen Ausrichtung wie im vorherigen Gefäß (Zweig nach oben) enthält.
      3. Gefäße mit Knotenschnitten in eine Pflanzengewebekulturkammer übertragen und für 2-u20123 Wochen bei 24 °C, 16 h Licht (140 x-2-s-1)/8 h dunkle Photoperiode wachsen.
        HINWEIS: Jeder Knotenschnitt wird zu einem neuen Pflanzgefäß heranwachsen. Die Anzahl der Stecklinge in jedem Gefäß bestimmt die Blattgröße. Weniger Stecklinge, die pro Gefäß übertragen werden, führen zu größeren Blättern. Drei Pflanzen pro Gefäß haben 15 mm x 20 mm Blätter in 2-u20123 Wochen.
  3. (Optional) Bereiten Sie bodenangebaute Kennebec-Kartoffelpflanzen vor.
    HINWEIS: Um größere Blätter zu produzieren, können knotenvermehrte Kartoffelpflanzen auf den Boden übertragen werden.
    1. Übertragen Sie Kartoffelpflanzen, die in Knotenanbaumittel angebaut werden, auf den Boden, indem Sie die Pflanze sanft aus dem Medium ziehen, bis das gesamte Wurzelgewebe aus dem Agar freigesetzt wird.
    2. Von den Wurzeln auf den Boden direkt über dem 1. Knoten übertragen und den Boden leicht um die Transplantation verpacken. Wasser schonend, um den Bodenkontakt mit dem Wurzelsystem zu gewährleisten.
    3. In eine Wachstumskammer mit 16 h Licht (140 'mol'm-2's-1)/8 h dunkle Photoperiode und 25/20 °C Tag/Nacht Temperaturen platzieren.
      HINWEIS: Pflanzen sind bereit, wenn die beiden oberen vollständig expandierten Blätter die für den Test geeignete Größe erreicht haben.
  4. (Optional) Bereiten Sie in Knollen angebaute Kartoffelpflanzen zu.
    HINWEIS: Kartoffelpflanzen, die aus Knollen angebaut werden, sind größer und robuster und können nützlich sein, wenn Larven auf Pflanzen aufgezogen werden oder wenn über Nacht Larvenfütterung gewünscht wird.
    1. Legen Sie eine Kartoffelknolle 6 in tief in einen 10 in Topf mit Bodenmischung ergänzt mit 10 ml pelleted Slow Release Dünger.
    2. In eine Wachstumskammer mit 16 h Licht (140 'mol'm-2's-1)/8 h dunkle Photoperiode und 25/20 °C Tag/Nacht-Temperatur. Die Pflanzen sind ca. 30-u201240 Tage nach der Knollenbepflanzung bereit.
      HINWEIS: Verwenden Sie keine Pflanzen, die zu blühen begonnen haben.

2. Zubereitung von Insekten zur Fütterung

  1. Erhalten Sie gewünschte Larvenstadium von M. sexta.
    HINWEIS: Larven für diese Studie wurden auf künstliche Nein-Diät durch die 5. instar20 aufgezogen und von einer erfahrenen Person aus dem hauseigenen Insektary inszeniert. Larven können auch teilweise oder vollständig auf Pflanzengewebe aufgezogen werden. Larven essen nicht unmittelbar vor einem Molt und sind am ehesten direkt nach molt zu essen, so dass angemessene Inszenierung ist wichtig21.
  2. Larven je nach Larvengröße in ein geeignetes Containmentgefäß (z.B. 6-, 12-, 24-Well-Gewebekulturschale) übertragen. Es sollte eine Larve pro Brunnen in der Schale sein.
    HINWEIS: Larven können territoriales oder Kannibalistisches Verhalten ohne Nahrungsquelle anzeigen und verletzt werden, wenn sie zusammen untergebracht werden.
  3. (Optional) Larven bis zu 2 h verhungern, da dies die Larvenfütterung verbessern kann.
    HINWEIS: Larven sollten sich während dieser Zeit in einem Rückhaltegefäß in der Wachstumskammer befinden.

3. Komponenten-Setup für das Befallexperiment

HINWEIS: Siehe die schematische Zusammenfassung in Abbildung 1.

  1. Erstellen Sie Platzierungsvorlagen für jeden Erntezeitpunkt.
    HINWEIS: Es ist hilfreich, 5 verschiedene Schalen für jeden Erntezeitpunkt einzurichten. Dies hält Die Proben organisiert und ermöglicht es, die Gerichte effizienter als Set zu bewegen, ohne ihre Anordnung zu ändern. Wenn Schadensberechnungen durchgeführt werden, ist dies unerlässlich, da Bilder vor und nach dem Befall mit der gleichen Brennweite aufgenommen werden müssen.
    1. Erhalten Sie 5 robuste Schalen, die in der Lage sind, einen Satz von sechs entsprechend großen Petrischalen zu halten und mit weißem Papier zu säumen.
      HINWEIS: Die Größe der Petrischale basiert auf der Blattgröße, die für den Fütterungstest gewählt wurde. Das Blatt sollte leicht in die Schale passen, ohne die Seiten zu berühren. Zum Beispiel eignet sich eine 60 mm x 15 mm Schale für Blätter bis 50 mm Länge oder Breite.
    2. Verfolgen Sie einen Satz von sechs Kreisen mit der entsprechend großen Petrischale auf dem Papier in jedem Fach. Beschriften Sie einen Satz von Kreisen 'steuern' A, B und C und die andere 'befallen' A, B und C. Etikettieren Sie auch jede Platzierungsvorlage mit der entsprechenden Erntezeit.
  2. (Optional) Richten Sie eine Kamera für die Bildaufnahme "vor dem Befall" und "nach dem Befall" ein.
    1. Sichern Sie eine Kamera an einem Ständer an der entsprechenden Brennweite für die Bildaufnahme aller Petri-Gerichte in der Platzierungsvorlage.
  3. Beschriften Sie die Erntezeitpunktrohre.
    1. Beschriften Sie einen Satz von 30, 1,7 ml Mikrozentrifugenrohren, die jedem Kreis in der Platzierungsvorlage entsprechen. Beschriften Sie die Rohre, um die Störung (Steuerung/Befallen), den Pflanzenreplikationsbuchstaben (A, B oder C) und den Erntezeitpunkt (Anzahl der Minuten nach dem Befall) angemessen zu identifizieren.
  4. Bereiten Sie Petri-Gerichte in Schritt 3.1.1 gewählt.
    1. Legen Sie eine sterile Filterpapierscheibe in jede der 30 Petrischalen ab Schritt 3.1.1. Fügen Sie steriles Wasser hinzu, um die Scheiben zu befeuchten; lassen Sie nicht zu, dass überschüssiges Wasser in der Schale pool. Platzieren Sie jedes Gericht in jedem der sechs Kreise in jeder Platzierungsvorlage.
    2. Positionieren Sie drei Kartoffelpflanzen neben jeder Platzierungsvorlage. Stellen Sie sicher, dass die Pflanzen alle das gleiche Alter und die relative Größe haben.

4. Durchführen von Befall

HINWEIS: Eine Erntezeitpunkt-/Platzierungsvorlage wird gleichzeitig eingerichtet.

  1. Entfernen Sie die oberen beiden größenangepassten Blätter von jeder Pflanze mit steriler Schere und legen Sie ein Blatt in die Kontrolle Petrischale und eines in die befallene Petrischale für jede Pflanze (A, B und C). Führen Sie diesen Prozess so schnell wie möglich durch.
  2. (Optional) Übertragen Sie die Platzierungsvorlage auf den Kameraständer, um ein "vor dem Befall" Bild zu erfassen.
  3. Übertragen Sie Larven so schnell wie möglich mit Soft Touch Forceps auf jede befallene Schale. Stellen Sie den Timer für die gewünschte 'Befallzeit' ein.
    HINWEIS: Der Zeitraum, in dem Larven das Blattgewebe verbrauchen, ist die "Befallszeit". Dies ist etwas, das empirisch mit ein paar Testblättern/Larven vor Beginn des tatsächlichen Befalls bestimmt werden kann. Die gewählte "Befallszeit" sollte für alle befallenen Blätter konsistent sein.
    HINWEIS: Larven sollten mit Vorsicht durch Soft-Touch-Zangen behandelt werden. 2. bis 4. Instern kann sanft von ihrem Horn oder Mittelteil erfasst werden.
  4. Beobachten Sie die Fütterung, um sicherzustellen, dass alle Larven fressen. Larven sollten je nach Fütterungsverhalten hinzugefügt/entfernt werden. Halten Sie die Deckel auf den Petri-Gerichten so weit wie möglich.
    HINWEIS: Pro Blatt können mehrere Larven verwendet werden.
  5. Entfernen Sie Larven von den Blättern am Ende der Befallszeit. Starten Sie den Timer für die Erntezeit.
  6. (Optional) Übertragen Sie die Platzierungsvorlage auf den Kameraständer, um das Bild "nach dem Befall" zu erfassen.
    HINWEIS: Alle sechs Blätter in der Platzierungsvorlage werden zur jeweiligen Erntezeit geerntet.

5. Ernteblätter

  1. Jedes Blatt am Ende jedes Erntezeitpunkts in das entsprechende beschriftete Rohr geben und sofort einfrieren, indem man das Rohr in Flüssigkeit N2abgibt. Lagern Sie das geerntete Pflanzengewebe bei -80 °C bis zur Isolierung der RNA.
  2. Wiederholen Sie die Schritte 4-u20125.1 für jeden Erntezeitpunkt.

6. Verarbeitung von Blattgewebe für die Genexpressionsanalyse

  1. Das gefrorene Blattgewebe zu einem Pulver mit einem Mikroschädling mahlen.
  2. Isolieren Sie die gesamte RNA und den Prozess zur Genexpression, wie zuvor beschrieben22.

7. (Optional) Abschätzung der Blattschäden

  1. Schätzen Sie den Prozentsatz der Blattschäden visuell oder berechnen Sie die Blattfläche in den Vor- und Nachbefallbildern.
  2. Messen Sie die Blattfläche mit Software-Tools (z.B. Phenophyt)23.
  3. Berechnen Sie aus Blattflächenmessungen den Schadensprozentsatz als
    % Schaden = [(Blattfläche vor – Blattfläche nach)/Blattfläche vor] x 100.

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Ergebnisse

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Der Blattverbrauch definiert den Erfolg des Protokolls. Gesunde, genau inszenierte Larven sollten sofort nach der Platzierung auf der Blattoberfläche mit der Fütterung beginnen und die Fütterung sollte während der Befallzeit ziemlich konsistent fortgesetzt werden. In Video 1beginnt die Larve an der Spitze sofort nach der Platzierung zu kauen und hält eine konstante Rate während der Fütterung. Dies ist besonders wichtig, wenn frühe Genexpressionsereignisse nach dem Befall ...

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Diskussion

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Die Verwendung bestehender Methoden für pflanzenkräuterelfenbeinte Pflanzen ist nicht erforderlich, um das Ziel dieser speziellen Studie zu erreichen (d. h. eine Reihe von Kandidatengenen auf ihre Reaktion auf Densonfall zu untersuchen). Der offensichtliche Vorteil der losgelösten Blattverfeinerung ist die Verkürzung der Zeit, die es braucht, um Kräuter-Assays durchzuführen. Die sperrige Natur ganzer Pflanzen mit Clipkäfigen wird eliminiert und Tests werden früher durchgeführt, da Pflanzen, die noch 2 Wochen alt sind, zu...

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Offenlegungen

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Die Autoren haben nichts zu verraten.

Danksagungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Autoren danken Bob Farrar und Alexis Park für die Bereitstellung von Insekten, die in dieser Studie verwendet werden, und für ihre Expertise in der Larveninszenierung. Weiterer Dank an Michael Blackburn und Saikat Ghosh für die kritische Überprüfung des Manuskripts.

Die Erwähnung von Handelsnamen oder kommerziellen Produkten in dieser Veröffentlichung dient ausschließlich der Bereitstellung spezifischer Informationen und impliziert keine Empfehlung oder Billigung durch das US-Landwirtschaftsministerium.

USDA ist Ein Anbieter von Chancengleichheit und Arbeitgeber.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Agar-ErsatzPhytoTechnology LaboratoriesG3251Produkt ist ein Gelzan-Containment-Gefäß
(6-, 12- oder 24-Well-Schale)Fisher Scientific 08-772-49, 08-772-50, 08-72-51Viele andere Firmen verkaufen diese Produkte
manduca Eier Carolina Biological Supply Company14388030-50 Eier
manduca Eier Great Lakes HornwormNA50, 100, 250 oder 500 Eier
Manduca LarvenCarolina Biological Supply CompanyAnfrage für spezifische Larven Anfragenfür
Manduca LarvenLakes Hornwurmfür spezifische Larven Anfragefür
Mikrozentrifugenröhrchen im Instar, 1,7 ml Thomas Scientific1158R22diese wurden in flüssigem N2 getestet und explodieren nicht
Murashige & Skoog (MS) Basalmedium mit VitaminenPhytoTechnology LaboratoriesM519zur Herstellung einer
Nährstoff-Agar-Mischungverwendet PhytoTechnology LaboratoriesM5825Produkt ist Murashige & Skoog Basal Medium mit Vitaminen, Saccharose und Gelzan
PapierfilterscheibenFisher Scientific 09-805AWhatman Circles-Kauf passend für Petrischale
Petrischale, 60X15 mm oder 100X15 mmFisher Scientific FB0875713A oder FB0875712Kaufgröße, die für
 jedeGröße B (nicht biologisch)schlägt Maine Farmer vor" s
Tauschtöpfe, 10"  Griffin Gewächshausbedarf, Inc.41PT1000CN2
Konservierungsmittel/BiozidPlant Cell TechnologyNAProdukt ist PPM (Plant Preservative Mixture)
Pflanzkartoffeln für explantische QuellenjederB-Größe (nicht biologisch)schlagen Maine Farmer vor s Austausch
Langzeitdünger (14-14-14 )anyNAOsmocote ist eine beliebte Markenmarke
Soft Touch PinzetteBioQuip4750
BodenmischungGriffin Greenhouse Supplies, Inc.65-51121Produkt ist ein steriles Kulturgefäß mit Sunshine LC1-Mix
 PhytoTechnology LaboratoriesC2100Magenta-Gefäß, PTL-100
SterilkulturgefäßFisher Wissenschaftlich ICN2672206Produkt ist MP Biomedicals Plantcon
im Stadium Great aus Vermehrungsmedium Kartoffelknollen in Blattgröße geeignet ist

Referenzen

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