Methodenartikel

Biologische Probenvorbereitung durch Hochdruck gefrieren, Mikrowellen-gestützte Kontrastverstärkung und minimale Harz einbetten für Volume Imaging

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DOI:

10.3791/59156

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19. März 2019

 ,  , 
1Electron Microscopy Core Unit, Max Planck Institute of Experimental Medicine, 2Center Nanoscale Microscopy and Molecular Physiology of the Brain (CNMPB)

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Hier stellen wir Ihnen ein Protokoll für die Kombination von zwei Probe-Verarbeitungstechniken, Hochdruck, Einfrieren und Mikrowellen-gestützte Probenverarbeitung, gefolgt von minimal Harz für die Datenerfassung mit fokussierten Ion Beam Rasterelektronenmikroskop (FIB-SEM) einbetten. Dies wird gezeigt, mit einer Maus tibiale Nerven Probe und Caenorhabditis Elegans.

Zusammenfassung

Das beschriebene Beispiel Präparationstechnik wurde entwickelt, um die beste Qualität der Ultrastrukturforschung Erhaltung mit dem am besten geeigneten Kontrast für die bildgebende Modalität in fokussierten Ion Beam Rasterelektronenmikroskop (FIB-SEM) kombinieren, die verwendet wird, um zu erhalten Stapel von aufeinander folgenden Bildern für die 3D Rekonstruktion und Modellierung. Hochdruck Einfrieren (HPF) in der Nähe von native bauliche Erhaltung ermöglicht, sondern die anschließende Einfrieren Substitution oft bietet ausreichenden Kontrast, speziell für ein größeres Exemplar, nicht die für qualitativ hochwertige Bildgebung im SEM für 3D notwendigen benötigt wird Wiederaufbau. Daher werden in diesem Protokoll nach dem Einfrieren Substitution, zusätzliche kontrastierenden Schritte bei Raumtemperatur durchgeführt. Obwohl diese Schritte in der Mikrowelle durchgeführt werden, ist es auch möglich, traditionelle Bank Verarbeitung erfordern längere Inkubationszeiten zu folgen. Die anschließende Einbettung in minimalen Mengen von Harz ermöglicht schneller und präziser Ausrichtung und Vorbereitung im FIB-SEM Dieses Protokoll eignet sich besonders für Proben, die Vorbereitung von Hochdruck Einfrieren für eine zuverlässige Ultrastrukturforschung Erhaltung aber erhalten keinen ausreichenden Kontrast während der Freeze-Ersatz für Volumen Bildgebung mit FIB-SEM In Kombination mit der minimalen Harz Einbettung bietet dieses Protokoll einen effizienten Workflow für den Erwerb von qualitativ hochwertigen Volumendaten.

Einleitung

Hochdruck-Einfrieren ist die Probe Vorbereitung Methode der Wahl für den Erhalt qualitativ hochwertige Ultrastrukturforschung Konservierung, die den nativen Zustand einer Probe viel besser als herkömmliche Zubereitungsmethoden mit chemischen Fixierung1darstellt. Diese Cryo-Vorbereitung-Methode eignet sich für Proben wie Markhaltige Maus Gewebe2 und strenge Anforderung für den Einsatz des Modellorganismus Caenorhabditis Elegans3. Nach dem Einfrieren Substitution und Harz einbetten werden diese Proben in der Regel von Transmissions-Elektronenmikroskopie (TEM) oder Elektron Tomographie (ET) analysiert. Wenn größere Mengen mit FIB-SEM oder serielle Block-Gesicht Bildgebung für hochauflösende große 3D-Rekonstruktionen, in unserer Erfahrung, die richtige Bildgebung durch SEM oft durch den Mangel an Kontrast beeinträchtigt abgebildet werden müssen. Im FIB-REM wird das Bild in der Regel durch den Nachweis des rückgestreuten Elektronen aus der primären Elektronenstrahl aufgezeichnet. Die Ausbeute an rückgestreute Elektronen ist proportional zu den Gehalt an Schwermetallen in der Probe. Daher wurden Protokolle Volume imaging um den Kontrast zu verbessern durch zusätzliche Heavy-Metal-Imprägnierung speziell für. Solche Methoden basieren auf chemisch festen Proben und wenden Sie eine Kombination von Osmium ausgefällt Thiocarbohydrazide Osmium ausgefällt4, wie beschrieben von Knott Et Al.5, für serielle Block-Gesicht und Rasterelektronenmikroskopie Ionenstrahl konzentriert. Änderungen, einschließlich der Verwendung von Formamid und Pyrogallol6 oder Blei Aspartat-7 wurden erfolgreich für verschiedene bildgebende Verfahren angewendet.

Das Protokoll hier zur Verfügung gestellten verbindet die Cryo-Vorbereitung der Proben von HPF und Einfrieren Substitution mit anschließender Mikrowellen-gestützte Verarbeitung für verbesserten Kontrast mit Thiocarbohydrazide/Osmium ausgefällt in Aceton bei Raumtemperatur. Wir demonstrieren dies auf die Markhaltige Nervus Tibialis von Mäusen und in Caenorhabditis Elegans, die Proben repräsentieren, die Hochdruck Einfrieren für qualitativ hochwertige Ultrastrukturforschung Erhaltung erfordern. Darüber hinaus zeigt es, wie, nach Austrocknung und Infiltration, die Proben mit als wenig Harz wie möglich eingebettet sind. Dieses minimale Harz einbetten8 ermöglicht schnellere Angriffe auf die Struktur von Interesse und reduziert den Zeitaufwand für die Probenverarbeitung, einschließlich weniger Zeitaufwand für die Aufdeckung des Interessenbereichs mit dem Ionenstrahl. Nach der Durchführung weitere Probe vorbereitende Schritte in das Mikroskop, imaging und Fräsen der Probe kontinuierlich erfolgt, um einen Stapel von Bildern zu erwerben. Für die 3D Visualisierung wird Bildverarbeitungs-Software (IMOD) verwendet, um Teile des Datasets zu rekonstruieren.

Unseren Workflow wird beschrieben, wie das am besten geeignete kontrastierenden Proben für das Volume Imaging mit Ultrastrukturforschung Erhaltung durch HPF und Einfrieren Substitution kombiniert werden kann. Dies ist nützlich für Proben, die streng Cryo-Vorbereitung erfordern. Anwendungen beschränken sich auf kleine Proben, die von HPF vorbereitet werden kann. In Proben von anderer Art, z. B. Pflanzenmaterial oder Mikroorganismen erfordert dieses Protokoll Anpassung.

Protokoll

Alle Experimente, einschließlich Proben von Tieren, die hier beschrieben wurden durch die institutionelle Animal Care und die unteren sächsischen Landesamt für Verbraucherschutz und Lebensmittel Sicherheit (LAVES) genehmigt.

1. Hochdruck Einfrieren und Einfrieren substitution

  1. Der Nervus Tibialis aus einer Maus (z. B. C57Bl6N, 12 Wochen, weiblich)9zu sezieren.
  2. Der Nervus Tibialis in einem Tropfen von 20 % Polyvinylpyrrolidon (1 g PVP in 5 mL) in Phosphat gepufferte Kochsalzlösung (PBS) Tauchen und 2 mm lange Stücke schneiden. Dann legen Sie sie in einen Metall Probenträger (Typ A, 0,2 mm Tiefe) mit feinen Pinzette. Fügen Sie einen anderen flachen Träger (Typ B) überzogen mit einer dünnen Schicht von Hexadecan als Deckel und legen Sie diese Assembly in die Probe-Patrone.
  3. Einige C. Elegans ausgesetzt in einem Tropfen von 20 % Rinderserumalbumin (BSA) in M9 zu übertragen (siehe Tabelle der Materialien) mit einer Einweg-Kunststoff-Pipette in die Metallträger (Typ A). Dann fügen Sie eine zweite Karriere als Deckel obenauf (Typ B) und montieren Sie die Patrone.
  4. Für beide Proben, fahren Sie mit den folgenden: Hochdruck Einfrieren der Probe Träger Baugruppen eins nach dem anderen in die dreiteilige Patrone in der Verladestation der Hochdruck Tiefkühltruhe geladen. Der Prozess-Taste laut Bedienungsanleitung des Herstellers.
    Hinweis: Beide Arten von Proben können in der nachfolgenden Einfrieren Substitution gemeinsam verarbeitet werden.
  5. Legen Sie die Proben in Cryovials mit 2 mL gefrorene 0,1 % Gerbsäure in Aceton. Führen Sie die Übertragung in ein Bad aus flüssigem Stickstoff ohne Verschütten von flüssigem Stickstoff in die Fläschchen. Übertragung der Cryovials in eine automatische Einfrieren Ersatz Einheit10 bei-90 ° C eingestellt und das Programm starten.
    Hinweis: Die Proben sind gehalten bei-90 ° C 100 h. Gerbsäure, bevor Osmification als Beize verwendet wird, um die Aufnahme von Osmium ausgefällt11zu erhöhen.
  6. Waschen Sie manuell die Proben 3 X 30 min mit 2 mL Aceton bei-90 ° C in der Freeze Ersatz Einheit.
  7. Lassen Sie die Proben in 2 mL 2 % Osmium ausgefällt, 0,1 % Uranyl Acetat in Aceton für anhaltende Färbung in der automatischen Einfrieren Ersatz Einheit für 7 h bei-90 ° C.
    Achtung: Osmium ausgefällt ist giftig und sollte unter einem Abzug gehandhabt werden, und Schutzausrüstung getragen werden sollte.
    Hinweis: Das Einfrieren Ersatz Gerät hebt automatisch die Temperatur bis-20 ° C bei 5 ° C/h. Die Proben werden bei-20 ° C 16 h in der Freeze Ersatz Einheit gehalten. Die Temperatur wird automatisch auf 4 ° C bei 10 ° C/h erhöht werden.
  8. Tauschen Sie die Osmium ausgefällt Lösung mit Aceton aus, wenn die Temperatur 4 ° c erreicht hat Entfernen Sie die Cryovials aus dem Einfrieren Ersatz Gerät.

(2) Mikrowellen-gestützte Verarbeitung

Hinweis: Führen Sie die folgenden Schritte bei Raumtemperatur12 mit einem Temperatur-Regeleinheit, um die Temperatur stabil zu halten (siehe Tabelle der Materialien).

  1. Lassen Sie die Kappen von den Reaktionsgefäßen geöffnet während der Verarbeitung in der Mikrowelle.
  2. Das Metall Probenträger aus den Cryovials herausnehmen Sie und die Proben aus dem Metallträger mit feinen Pinzette oder einer Nadel, wobei die Proben eingetaucht in Aceton in einer Schale von Uhrglas (150 mm).
  3. Übertragen Sie die Proben in 2 mL Reaktionsgefäße mit feinen Pinzette oder einer Pipette und waschen mit 1 mL Aceton viermal für 40 s bei 250 w.
    Achtung: Thiocarbohydrazide ist giftig und sollte unter einem Abzug gehandhabt werden, Schutzausrüstung getragen werden sollte.
  4. Färben Sie Proben mit 1 mL 1 % Thiocarbohydrazide in Aceton für 14 min bei 150 W um den Kontrast zu erhöhen. Zum Ausführen der Färbung pipette die Thiocarbohydrazide-Lösung in das Reaktionsgefäß, platzieren Sie das Rohr in die Mikrowelle und stellen Sie das Programm auf eine Leistung von 150 W (mit der Vakuum-Funktion eingeschaltet) für 2 min/2 min aus, für insgesamt 14 min durchlaufen. Starten Sie die Mikrowelle.
    Hinweis: Thiocarbohydrazide reagiert mit Osmium ausgefällt, die während der Frost-Substitution angewendet wurde. Es bildet eine Brücke, so dass mehr Osmium ausgefällt auf der ursprünglichen Osmium ausgefällt Seiten13hinterlegt werden.
  5. Waschen Sie die Proben 4 X mit 1 mL Aceton für 40 s bei 250 W. Pipette das Aceton in ein Reaktionsgefäß, legen Sie das Rohr in der Mikrowelle, und wählen Sie 250 W für 40 S. Start der Mikrowelle.
  6. In 1 mL 2 % Osmium ausgefällt in Aceton für 14 min. 150 W. Pipette Osmium ausgefällt Lösung in ein Reaktionsgefäß färben, legen Sie das Rohr in die Mikrowelle und stellen Sie das Programm auf eine Leistung von 150 W (mit der Vakuum-Funktion eingeschaltet) für 2 min/2 min aus , für insgesamt 14 min durchlaufen. Starten Sie die Mikrowelle.
  7. Waschen Sie die Proben 4 X mit 1 mL Aceton für 40 s bei 250 W (wie in Schritt 2.5).
  8. Infiltrieren mit 1 mL steigenden Konzentrationen des Harzes in Aceton (siehe Tabelle der Materialien) von 25 %, 50 %, 75 %, 90 %, 100 % und 100 % für 3 min bei 250 W. Pipette das Harz in einem Reaktionsgefäß, platzieren Sie das Rohr in die Mikrowelle und stellen Sie das Programm auf eine Kraft Leve l 250 W (mit der Vakuum-Funktion eingeschaltet) 3 Minuten beginnen die Mikrowelle.

3. minimale Harz einbetten8

  1. Nehmen Sie den Nervus Tibialis und C. Elegans aus das Reaktionsgefäß mit einem Zahnstocher und Stelle sie auf ein Stück Plastik zu Filmen (siehe Tabelle der Materialien).
  2. Verwenden Sie die Zahnstocher um zu schieben um die Probe auf die Kunststoff-Folie bis keine verbleibenden Harz erkannt wird. Verwenden Sie eine Halogen-Lampe für Heizung (siehe Tabelle der Materialien), so dass das Harz dünnflüssiger wird und kann leichter entfernt werden. Ort der Halogenlampe nahe genug, um das Harz (wobei Sie darauf achten, nicht Hände zu verbrennen) erwärmen.
  3. Polymerisieren Sie die Proben für mindestens 48 Stunden bei 60 ° C auf die Kunststoff-Folie im Ofen.

4. Vorbereitung für FIB-SEM

  1. Ausschneiden der polymerisierten Proben zusammen mit Kunststoff-Folie mit einer Rasierklinge auf eine Größe passt der SEM-Stubs und legen sie auf die SEM-Stubs mit einem leitfähigen Silber Harz (siehe Tabelle der Materialien). Polymerisieren Sie wieder bei 60 ° C für mindestens 4 Stunden oder über Nacht.
  2. Sputter-Mantel die Proben auf das SEM mit Gold für 1 min bei 35 Stub mA mit einem Sputter Coater (Platin/Palladium kann auch verwendet werden, eine 10 nm dicke Schicht ist ausreichend) und legen Sie sie in die FIB-SEM

(5) Datenerfassung innerhalb der FIB-SEM

  1. Bild der Proben mit dem Sekundär-Elektronen-Detektor mit der Basis-Software das Mikroskop zu fahren (siehe Tabelle der Materialien). Die Probe sollte ausgerichtet werden, so dass die Region von Interesse (z. B. Mittelteil des Nervus Tibialis oder C. Elegans) in das Blickfeld ist.
    Hinweis: Um die Datenerfassung durchzuführen, kippen Sie die Bühne, um eine Position so, dass die Stichprobe der Ionenstrahl in einem 90° Winkel an einem geeigneten Arbeitsabstand (5 mm) zeigt in der so genannten Zufall der Ionen und Elektronen Strahl. Mit unserem Instrument, ist dies bei einer Bühne Neigung von 54 ° und 5 mm Arbeitsabstand erreicht.
  2. Um die richtige Position der Probe einzurichten, zentrieren Sie ein häufiges Merkmal bei 0° Neigung während der Bildgebung mit dem Sekundär-Elektronen-Detektor. Langsam Rezentrierung Tilt auf 54 ° c (5°, 20° 54°), das gleiche Objekt durch Verschieben der M-Achs.
  3. Finden Sie den Zufall Punkt durch eine Funktion bei der Bildgebung mit dem Sekundär-Elektronen-Detektor bei 54°, gefolgt, indem Sie die Funktion auf die zentrale Position im FIB-Modus zu zentrieren. Führen Sie dies durch die Anzeige des Fadenkreuzes in der SEM-Software, einen Hinweis auf das Zentrum zu haben. Zuerst fahren Sie die ausgewählte Stichprobe-Funktion in die Mitte des Bildbereichs mithilfe der Zentrum-Punkt-Funktion der SEM-Software. Dann Mitte der Funktion entlang der y-Achse durch Bewegen der Bühne in Z. Endgültige Versatz zwischen FIB und SEM ist mit die SEM Lichtstrahl Verschiebung korrigiert.
  4. Die advanced-Software zu öffnen (siehe Tabelle der Materialien) für die Aufzeichnung von 3D Datensätzen und folgen Sie den Software-Assistenten Schritt für Schritt.
  5. In der Region von Interesse, Kaution Kohlenstoff oder Platin (400 nm) auf den ROI durch die Erhebung von induzierten mit einer aktuellen 3 nA zu erlauben sogar Fräsen und Artefakte zu reduzieren.
    Hinweis: Durch das Zeichnen der Region von Interesse auf der Probenoberfläche abgebildet mit FIB (Breite, Höhe, Tiefe) gefräst werden, die Software berechnet und überlagert die Größen der verschiedenen Probe Vorbereitung Features, wie die Gräben zu fräsenden oder Fläche Platin/Kohlenstoff-Abscheidung. Auch vorsichtig von imaging-die Oberfläche der Probe mit zu hoher FIB Strömungen, da dies die Probenoberfläche beschädigen kann. Ein Strom von 50 pA reicht aus für die Bildgebung.
  6. Verwenden Sie die fokussierten Ionenstrahl einen Graben um die Region of Interest (ROI) mit einer 15/30 nA aktuelle aussetzen zu fräsen.
  7. Verwenden Sie die fokussierten Ionenstrahl Querschnitt mit einem 7 nA aktuelle Polieren.
  8. Nach Beendigung der Probenvorbereitung, richten Sie die folgenden bildgebenden Parameter: FIB Fräsparameter in der FIB Registerkarte "Setup" (FIB Fräsen aktuell); SEM imaging-Parameter in der Registerkarte "Setup" und das Bild tuning Parameter in der Registerkarte "SEM AutoTune" (führen Sie Autofokus und Autostigmation alle 60 min. 50 nm Pixelgröße, Verweilzeit 3, Zeile durchschnittlich 3). Optimieren Sie dies für jede Probe.
  9. Um zu verhindern, dass eine thermische Drift verursacht das Block-Gesicht, während des Laufs zu treiben, verlassen Sie den Raum für mindestens 2 h vor dem Start der Akquisition.
  10. Erwerben Sie das Dataset in eine ununterbrochene Mühle und erwerben Sie Modus mit einem 700 pA FIB aktuelle zu. Einsatz 1,5 kV (analytische Modus, 900 V) ESB-Detektor mit einer Netzspannung von 400 V erwerben Bilder mit 5 nm-Pixel-Größe mit der vorgerückten Software (siehe Tabelle der Materialien) und 50 nm Scheibendicke. Eine Bildaufnahme dauert ca. 1,5 min mit einer Verweilzeit von 6 µs.
  11. Starten Sie die Datenerfassung. Ein FIB-Bild auf das aktuelle Fräsen werden erworben, um sicherzustellen, dass die Probe nicht zu bewegen und die richtige Region von Interesse ist ausgewählt. Passen Sie bei Bedarf.

6. Daten-Visualisierung

  1. Öffnen Sie Bilder in Fidschi zu, indem man den Ordner mit den Bildern in Fidschi und wählen Sie Virtuellen Stapel aus.
  2. Schneiden Sie die Region mit dem Rechteck-Werkzeug (Bild > Zuschneiden).
  3. Invertieren Sie die Daten, um den traditionellen Übertragung Elektronenmikroskopie Kontrast mit Membranen zeigt sich in Dunkelheit zeigen (Bearbeiten > invertieren,).
  4. Verwenden Sie TrackEM214 (Fidschi15) zur Ausrichtung. Laden Sie die Daten in TrackEM2 (Datei > Neu > TrackEM2) indem Sie auf Layer. Nachdem alle Bilder geladen sind, richten Sie sie mit Multi-Layer-Mosaik-Funktion (mit der rechten Maustaste auf Bild > ausrichten > ausrichten mehrschichtige Mosaik). Nach dem ausrichten, werden die Bilder als einzelne Tiff-Dateien exportiert (mit der rechten Maustaste auf Bild > Exportieren > Make flachen Bild). Wählen Sie alle Bilder, die exportiert werden soll, und wählen Sie in Datei speichern.
  5. Für die Nachbearbeitung, verwenden eine Gaußsche Unschärfe (Prozess > Filter > Gaußsche Unschärfe; Sigma 2) und lokale Kontrastverstärkung (Prozess > Verbesserung lokaler Kontrast; CLAHE: Blocksize 127, Histogramm Lagerplätze 256, maximale Steigung 1,5), die in Fidschi zu glätten das Bild und erhalten ein besseres Signal-Rausch-Verhältnis angewandt werden.
  6. IMOD16 dient zum Ausführen einer manuellen Segmentierung und die Struktur von Interesse in 3D zu visualisieren. Öffnen Sie das Dataset in IMOD und Zeichenwerkzeuge auswählen (Special > Zeichenwerkzeuge), die manuelle Segmentierung durchzuführen. Verschiedene manuelle Tools lässt sich die Struktur des Interesses im gesamten Volumen (z. B. Join, Sculpt) folgen. Verwenden Sie Mikroskopie-Bild-Browser (MIB17) für semi-automatischen Segmentierung.

Ergebnisse

Der Workflow startet mit einer Probe (hier: ein frisch seziert Maus Nervus Tibialis) in Metall Träger für Hochdruck Einfrieren (Abbildung 1a) gestellt. Die Träger sind erholte sich von flüssigem Stickstoff (Abbildung 1 b) und in ein Einfrieren Ersatz Einheit auf der zugefrorenen ersten chemischen cocktail (Abbildung 1 c). Nachdem eine lange einfrieren Substitution Protokoll einschließlich der 2 % Osmium ausgefällt und 0,1 % Uranyl-Acetat, werden die Proben aus den Trägern bei Raumtemperatur (Abbildung 1-d) entfernt. Um den Kontrast weiter zu verbessern, werden die Proben auf Kunststoffrohre in der Mikrowelle (Abbildung 1e) verarbeitet werden übertragen. Die Vakuumkammer und Temperiergerät dienen zur Optimierung des Prozesses (Abb. 1f).

Um die minimale Harz einbetten können, Zahnstocher und Platten aus Kunststoff-Folie benötigt (Abbildung 2a). Sie sind nach infiltrieren die Proben mit Harz mit Hilfe der Mikrowelle, auf Kunststoff-Folie platziert und verschoben, bis kein Harz auf der Probenoberfläche übrig ist. Eine Halogen-Lampe dient dazu das restliche Harz abtropfen und lassen die Probe minimal eingebettet (Abbildung 2 b) auf die Kunststoff-Folie. Es sei darauf hingewiesen, dass mehr Harz von der Spitze der Stichprobe entfernt gut ist. Es sollte eine kleine Menge links unterhalb der Probe zu halten, auf dem Untergrund befestigt. Die Probe wird auf die Kunststofffolie polymerisiert geschnitten und montiert auf SEM Stub mit Silber leitfähigem Harz (Abbildung 2 c). Die Stub ist für mindestens 4 Stunden bei 60 ° C (Abb. 2d) polymerisiert. Die Komponenten sollten gründlich vermischt werden oder die Mischung nicht richtig polymerisieren kann. Um zu vermeiden, laden innerhalb der Rasterelektronenmikroskopie, ist die Stub Sputter mit Gold oder Platin/Palladium (Abbildung 2e) beschichtet.

Die Proben sind im FIB-REM platziert und mit einem Sekundär-Elektronen-Detektor auf die Region von Interesse (Abb. 3ae) abgebildet. Ein Ionenstrahl dient zum Entfernen von Material direkt vor der Region von Interesse, einen Querschnitt (Abb. 3 b-d, 3f-h) verfügbar zu machen. Standardprotokolle leiden häufig unter einem Mangel an Membran-Kontrast (Abb. 3 bf), während das erweiterte Protokoll einen starken Membran Kontrast (Abbildung 3 c-d, 3 g-h sieht).

Die EM-Daten (nach Post-Processing) sind mit IMOD, ein Bild Bearbeitung und Modellierung Programm visualisiert. Um zu erreichen, ein besseres Verständnis für die 3D-Informationen, virtuelle reslicing der Daten dient (Abb. 4a). Unterschiedliche Strukturen des Datasets manuell segmentiert sind (Abbildung 4 b-d).

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Abbildung 1: Hochdruck-Einfrieren, Einfrieren-Substitution und Mikrowellen-gestützte Verarbeitung. (a) Probe Träger mit der Maus Nervus Tibialis, bar 3 mm. (b) Probenträger mit der Maus Nervus Tibialis nach Hochdruck Einfrieren, Bar 3 mm. (c) für automatische Einfrieren Substitution (AFS) Skalierungseinheit mit Proben zu skalieren. Einschub: maßgeschneiderte Metallbehälter für bis zu 23 Probengefäße und zwei große Ampullen mit Chemikalien in der AFS. (d) Proben aus Träger in eine Glasschale in Aceton, skalieren bar 3 mm. (e) Proben in Reaktionsgefäßen in der Mikrowelle für die Verarbeitung gestellt werden. (f) Vakuum-Kammer und Temperatur-Kontrolle-Einheit der Mikrowelle. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

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Abbildung 2: minimale Harz einbetten und Vorbereitung für die FIB-REM (a) Kunststoff-Folie und Zahnstocher, die für die minimale Harz einbetten verwendet werden, entwässert Skala Bar 4 cm. (b) Nervus Tibialis Harz auf die Kunststoff-Folie, Skala Bar 250 µm. (c) Nervus Tibialis polymerisiert auf Kunststoff-Folie, dann schneiden und oben auf die SEM-Stub mit leitfähiges Harz Silber, Robbe bar 250 µm. (d) Muster auf der Oberseite der SEM-Stub, Skala polymerisiert bar 3 mm. (e) Proben mit Gold auf der SEM-Stub, Skala beschichtet bar 3 mm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

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Abbildung 3: Vorbereitung der Probe im FIB-SEM (ein und e) Sekundär-Elektronen-Bild im Inneren der FIB-SEM der Probe Oberfläche (a) Nervus Tibialis Skala bar 100 µm. (e) C. Elegans, Skala bar 2 µm. (b-d) und (f-h) Querschnitt durch Probe mit ESB-Detektor für die Bildgebung. (b und c) Nervus Tibialis skalieren bar 2 µm. (f und g) C. Elegans, Skala bar 1 µm und 200 nm. (b und f) Dargestellt sind die Ergebnisse der Hochdruck Einfrieren und Einfrieren Substitution ohne Verstärkung, während alle anderen Bilder Ergebnisse der erweiterten Einfrieren Substitution zeigen. (d und h) Detailliertes Bild der Probe mit der ESB-Detektor. (d) Nervus Tibialis, Skala bar 200 nm. (h) C. Elegans Skala bar 200 nm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

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Abbildung 4: Erfassung und Visualisierung von Bildern. (a) EM Daten in IMOD mit nahezu resliced x / Z / y/Z-Ebenen, Skala bar 2 µm. (b) segmentierte Axone auf EM Daten (blau), Remak Bündel (rot), Myelinscheiden (gelb und Orange) und Mitochondrien (türkis), skalieren bar 2 µm. (c und d) 3D-Modell, Skala bar 2 µm und 500 nm . Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Diskussion

Das Protokoll wurde entwickelt, um die optimale Konservierung und Kontrast zum seriellen Block-Gesicht Bildgebung mit einem FIB-SEM durchführen zu veranschaulichen Daher entschieden wir uns, Cryo-Immobilisation gefolgt von Post-Färbung mit Freeze Substitution und Mikrowellen-gestützte Verarbeitung anzuwenden. Daher ist dieses Protokoll beschränkt sich auf Stichproben, die klein genug für Hochdruck einfrieren. Die Größenbeschränkungen von 3 bis 6 mm in der Breite und Dicke von ~ 200 µm werden durch die Größe der Probenträger festgelegt, die die Größe der Stichprobe entspricht, die mit dieser Technik richtig eingefroren werden können. Dies ist relevant für die Maus-Nerv-Probe, da der Ischiasnerv zu groß im Durchmesser ist, in die 0,2 mm Träger passen, die erforderlich sind, um richtige Einfrieren zu gewährleisten. Daher empfiehlt sorgfältige Präparation eines kleineren Nerven wie der tibiale Nerv oder anderen dünnen Nerven wie die femorale Nerven. Da die Myelinscheide empfindlich zu dehnen ist, muss während der Präparation des Nervus frisch und lebensfähig geachtet werden, zu vermeiden, Umgang mit Artefakten. Im Allgemeinen sollten nur brauchbare Beispiele für Elektron mikroskopische Untersuchungen verwendet werden.

Mikrowellen-gestützte Verarbeitung und minimale Harz einbetten dienen zur Beschleunigung der Vorbereitungsprozess und Ausrichtung Prozesses. Die Mikrowellen-gestützte Verarbeitung Anwendung eines modifizierten OTO Protokoll4 dient zur Raumtemperatur chemische Fixierung. Eine Haushalt Mikrowelle erbringt nicht die gleichen Ergebnisse, da gibt es keine homogene Verteilung der Mikrowellen, seine Temperatur nicht kontrolliert und es gibt kein Vakuum, die angewendet werden können. Je kleiner ein Beispiel, das bessere Eindringen von Chemikalien; Daher werden die besten Ergebnisse durch kleinere Proben erreicht. Um Schäden zum Beispiel durch Überhitzung zu vermeiden, sind Temperaturregelung und Anwendung der minimal erforderliche Mikrowellenleistung entscheidend. Die Mikrowellen-gestützte Bearbeitungsschritte können auf der Bank ausgeführt werden, wenn keine Mikrowelle zur Verfügung, was zu längeren Bearbeitungszeiten führen wird. Direkt Zielstrukturen im SEM ist es entscheidend, wie viel Harz wie möglich von der Spitze der Stichprobe zu entfernen. Nach der Aufnahme eines Datasets, ist die Nachbearbeitung der raw-Daten notwendig, Dateigröße verringern und verbessert das Signal-Rausch-Verhältnis. Bildgebenden Verfahren in der modernen Volumen produzieren große Mengen an Daten. Um die Verarbeitung der Daten in ausreichend und schnell auszuführen, ist daher ausreichend RAM auf der Arbeitsstation erforderlich. Ausrichtung-Operationen benötigt mindestens zwei Mal so viel RAM wie die Dataset-Größe.

Dieses Protokoll wurde auf den Nervus Tibialis der Maus ebenso wie in C. Elegansgetestet. Hall Et Al. 12 verwendet einen ähnliche Verbesserung-Schritt nach ihrer Einfrieren-Ersatz auf der Bank für die Vorbereitung des C. Elegans. Für alle anderen Modellorganismus wie dem Zebrafisch sind Anpassungen des Protokolls wahrscheinlich notwendig. Eine mögliche Änderung besteht darin, die Zusammensetzung der Freeze-Substitution cocktail, wie z. B. durch Zugabe von Wasser zu ändern, für Kontrast Verbesserung18. Darüber hinaus die Dauer der Vertretung einfrieren muss zum Beispiel angepasst werden und entsprechend schnell einfrieren Substitution Protokoll19erheblich verkürzt werden. Eine Möglichkeit ist die Anwendung der Agitation für die Beschleunigung der Freeze Substitution Prozess20. Nach dem Einfrieren-Substitution sind weitere Modifikationen möglich, z. B. wiederholte Anwendung Chemikalien und Osmium ausgefällt21zu verstärken. Bei der Mikrowelle Verarbeitung können Temperatur, Inkubationszeiten und Energieeinstellungen variiert werden, um Ergebnisse für die jeweilige Probe zu optimieren.

Dieses Protokoll zeigt, dass eine solche Erweiterung kombiniert werden kann, mit anderen Einfrieren Substitution Protokolle und verschiedenen Arten von Proben wie von Halle12 beschrieben, die in einem FIB-SEM oder durch serielle Block-Gesicht Rasterelektronenmikroskopie abgebildet sind. Diese bildgebenden Verfahren erfordern verbesserte Kontrast, was für Transmissions-Elektronenmikroskopie weniger wichtig ist.

Offenlegungen

Keine Interessenkonflikte erklärt.

Danksagungen

Die FIB-SEM und A.S. (die Position des Operators FIB-SEM) sind die Cluster of Excellence und die Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) Research Center Nanoscale Mikroskopie und molekulare Physiologie des Gehirns (CNMPB) finanziert. Wir danken für die Bereitstellung von C. Elegans Proben. im Labor von Thomas Müller-Reichert Wir danken für die Teilnahme an dem Film Ulrich Weikert.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Instrumentation
Leica HPM100Leica
Automatic Freeze SubstitutionLeica
Labormikrowelle mit TemperiergerätTed Pella
EM ACE600 mit GoldtargetLeica
Crossbeam 540Zeiss
Halogenlampe 12 V/ 20 WOsram
BackofenVWR
Gefrieren
Rinderserum AlbuminSigma-AldrichA2153
M9Hausgemachtnach C. Elegans - Ein praktischer Ansatz I.A.Hope
HexadecenSigma-Aldrich52276
PolyvinylpyrrolidonSigma-AldrichP2307
Träger vom Typ AWohlwend GmbH#241
Träger vom Typ BWohlwend GmbH#242
SchlitzträgerWohlwend GmbH#446
Pasteur-Pipetten aus KunststoffVWR612-1684
PinzetteFST11200-10
Freeze substitution
Acetonwissenschaftliche Dienstleistungen10015
GerbsäureSigma-Aldrich403040
OsmiumtetroxidEMS19100
UranylacetatSPI-Chem02624-AB
AcetonEMS10015
ThiocarbohydrazidSigma-Aldrich223220
Nunc CryoTubesSigma-AldrichV7884-450EA
Uhrglasschalen, 150 mmVWR216-2189H
Eppendorf RöhrenEppendorf0030 120.094
Durcupan HarzSigma-Aldrich44610<
strong>MontageSEM-Stubs
Science ServicesE75200
AclarScience Services50425-10
Zahnstocher
FilterpapierVWR512-3618
leitfähiges SilberharzEMS12670-EEEPO-TEK EE 129-4
Software
BildaufnahmeZeissSmartSEM
BilderfassungZeissAtlas5 A3D
BildverarbeitungOpen SourceFidschihttp://fiji.sc/#download
BildvisualisierungOpen SourceIMODhttp://bio3d.colorado.edu/imod/

Referenzen

  1. Studer, D., Humbel, B. M., Chiquet, M. Electron microscopy of high pressure frozen samples: bridging the gap between cellular ultrastructure and atomic resolution. Histochemistry and Cell Biology. 130 (5), 877-889 (2008).
  2. Möbius, W., Nave, K. -A., Werner, H. B. Electron microscopy of myelin: Structure preservation by high-pressure freezing. Brain Research. 1641, 92-100 (2016).
  3. Mancuso, J., Lich, B., McDonald, K. Three-Dimensional Reconstruction Methods for Caenorhabditis elegans Ultrastructure. Methods in Cell Biology. 96, 331-361 (2010).
  4. Deerinck, T. J., Bushong, E. A., Thor, A., Ellisman, M. H. NCMIR methods for 3D EM: A new protocol for preparation of biological specimens for serial block face scanning electron microscopy. , Available from: https://www.ncmir.ucsd.edu/sbem-protocol (2010).
  5. Knott, G., Rosset, S., Cantoni, M. Focussed Ion Beam Milling and Scanning Electron Microscopy of Brain Tissue. Journal of Visualized Experiments. (53), e2588(2011).
  6. Eberle, A. L., et al. High-resolution, high-throughput imaging with a multibeam scanning electron microscope. Journal of Microscopy. 259 (2), 114-120 (2015).
  7. Hua, Y., Laserstein, P., Helmstaedter, M. Large-volume en-bloc staining for electron microscopy-based connectomics. Nature Communications. 6, 1-7 (2015).
  8. Schieber, N. L., et al. Minimal resin embedding of multicellular specimens for targeted FIB-SEM imaging. Methods in Cell Biology. 140, (2017).
  9. Batt, J. A. E., Bain, J. R. Tibial nerve transection - a standardized model for denervation-induced skeletal muscle atrophy in mice. Journal of Visualized Experiments. (81), e50657(2013).
  10. Möbius, W., et al. Electron Microscopy of the Mouse Central Nervous System. Methods in Cell Biology. 96, 475-512 (2010).
  11. Hayat, M. A. Stains and Cytochemical Methods. , Plenum Press. New York and London. (1993).
  12. Hall, T. J., Hartweig, E., Nguyen, K. C. Q. OTO Fixation for SEM and Blockface Imaging. , Available from: http://www.wormatlas.org/EMmethods/OTOFix.htm (2018).
  13. Tapia, J. C., et al. High-contrast en bloc staining of neuronal tissue for field emission scanning electron microscopy. Nature Protocols. 7 (2), 193-206 (2012).
  14. Cardona, A., et al. TrakEM2 software for neural circuit reconstruction. PLoS ONE. 7 (6), (2012).
  15. Schindelin, J., et al. Fiji: An open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  16. Kremer, J. R., Mastronarde, D. N., McIntosh, J. R. Computer visualization of three-dimensional image data using IMOD. Journal of Structural Biology. 116 (1), 71-76 (1996).
  17. Belevich, I., Joensuu, M., Kumar, D., Vihinen, H., Jokitalo, E. Microscopy Image Browser: A Platform for Segmentation and Analysis of Multidimensional Datasets. PLoS Biology. 14 (1), 1-13 (2016).
  18. Walther, P., Ziegler, A. Freeze substitution of high-pressure frozen samples: The visibility of biological membranes is improved when the substitution medium contains water. Journal of Microscopy. 208 (1), 3-10 (2002).
  19. Mcdonald, K. L., Webb, R. I. Freeze substitution in 3 hours or less. Journal of Microscopy. 243 (3), 227-233 (2011).
  20. Reipert, S., et al. Agitation Modules: Flexible Means to Accelerate Automated Freeze Substitution. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. , (2018).
  21. Lešer, V., Drobne, D., Pipan, Ž, Milani, M., Tatti, F. Comparison of different preparation methods of biological samples for FIB milling and SEM investigation. Journal of Microscopy. 233 (2), 309-319 (2009).

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Fokussierter Ionenstrahl RasterelektronenmikroskopGefriersubstitutionOsmiumtetroxid F rbungThiocarbohydrazid BehandlungHarzpolymerisationProbenlokalisierung

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