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Methodenartikel

Direkter Einspritzung von Lentivirale Vektor zeigt mehrere motorische Bahnen im Rückenmark Ratte

8.4K Ansichten

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DOI:

10.3791/59160

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15. März 2019

 ,  ,  ,  , 
1Shriner's Pediatric Research Center, Temple University

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Dieses Protokoll zeigt Injektion von Doppelthebel transportable viralen Vektoren in Ratte Rückenmark Gewebe. Der Vektor wird an der Synapse aufgegriffen und zum Zellkörper von Neuronen Ziel transportiert. Dieses Modell eignet sich für retrograde Tracing wichtige spinalen Bahnen oder gezielt Zellen für Gen-Therapie-Anwendungen.

Zusammenfassung

Einführung der interessierenden Proteine in Zellen im Nervensystem ist schwierig wegen angeborenen biologischen Barrieren, die den Zugriff auf die meisten Moleküle beschränken. Injektion direkt ins Rückenmark Gewebe umgeht diese Barrieren, den Zugang zum Zellkörper oder Synapsen, wo Moleküle eingebaut werden können. Kombination von viralen Vektoren Technologie mit dieser Methode ermöglicht die Einführung von Zielgenen in Nervengewebe zum Zwecke der Gentherapie oder Trakt Ablaufverfolgung. Hier ist ein Virus entwickelt für hocheffiziente retrograder Transport (HiRet) an den Synapsen der Propriospinal Interneuronen (PNs) den spezifischen Verkehr zu Nervenzellen im Rückenmark und Hirnstamm Kerne fördern eingeführt. PNs-Targeting nutzt die zahlreichen Verbindungen erhalten sie von motorischen Bahnen wie die Rubrospinal und Reticulospinal Flächen sowie deren Verschaltung untereinander im gesamten Rückenmarkssegmente. Repräsentative Ablaufverfolgung konstitutiv aktiv grün fluoreszierendes Protein (GFP) zeigt High Fidelity Details der Zellkörper, Axone und dendritischer Dorne in thorakalen PNs und Reticulospinal Neuronen in die pontine Formatio Bildung der HiRet Vektor mit. HiRet integriert in Hirnstamm Wege und PNs sondern zeigt Alter abhängigen Integration in kortikospinalen Trakts Neuronen. Zusammenfassend lässt sich sagen ist Rückenmark Injektion mittels virale Vektoren eine geeignete Methode für die Einführung der interessierenden Proteine in Nervenzellen gezielt Tracts.

Einleitung

Virale Vektoren sind wichtige biologische Hilfsmittel, die genetisches Material in Zellen um defekte Gene, Upregulate wichtigen Wachstumsmärkten Proteine kompensieren oder fertigen Marker-Proteine, die die Struktur und die synaptischen Verbindungen von hervorheben einführen können Ihre Ziele. Dieser Artikel konzentriert sich auf direkte Einspritzung eines hocheffizienten Doppelthebel transportable Lentivirale Vektors ins Rückenmark Ratte um großen motorischen Bahnen mit fluoreszierenden Ablaufverfolgung zu unterstreichen.  Diese Methode eignet sich auch sehr für axonalen Regeneration und nachwachsen Studien zur Einführung von interessierender Proteine in unterschiedlichen Populationen von Neuronen und wurde verwendet, um Neuronen für funktionale Zuordnung Studien1,2zum Schweigen zu bringen.

Viele anatomische Details der spinalen motorischen Bahnen wurden aufgeklärt durch Direkteinspritzung Studien mit klassischen Tracer wie BDA und Fluoro-Gold3,4,5,6,7 , 8. diese Tracer gelten als Goldstandard aber können gewisse Nachteile wie Aufnahme durch beschädigte Axone oder Axone in Durchgang in der weißen Substanz umgibt eine Injektion Seite9,10,11 . Dies könnte zu Fehlinterpretationen der Weg Konnektivität und möglicherweise ein Nachteil in Regeneration Studien wo könnte Farbstoff Absorption durch beschädigte oder abgetrennten Axone verwechselt werden, für die Regeneration der Fasern während der späteren Analyse12.

Lentivirale Vektoren sind in Gentherapiestudien, beliebt, da sie stabile, langfristige Ausdruck in neuronalen Populationen13,14,15,16,17,18 bieten ,19. Jedoch traditionell verpackte Lentivirale Vektoren können haben begrenzte retrograden Transport und Reaktion des Immunsystems bei auslösen können in Vivo4,20,21. Ein hocheffizientes retrograder Transport Vektor bezeichnet HiRet wurde produziert von Kato Et Al. durch Ändern der Virushülle mit ein Tollwut-Virus Glykoprotein, einen Hybrid-Vektor erstellen, der retrograder Transport22,23verbessert.

Retrograde Ablaufverfolgung stellt einen Vektor in den synaptischen Raum eines Ziel-Neurons, so dass sie von dieser Zelle Axon aufgegriffen und zum Zellkörper transportiert werden. Erfolgreiche Transport von HiRet wurde von neuronalen Synapsen in die Gehirne von Mäusen und Primaten23,24 und vom Muskel in Motoneuronen22nachgewiesen. Dieses Protokoll zeigt die Injektion in die Lendenwirbelsäule Rückenmark, gezielt an den synaptischen Terminals Propriospinal Interneuronen und Hirnstamm Neuronen. PNs Empfangs-Verbindungen aus vielen verschiedenen spinalen Bahnen und können so genutzt werden, um gezielt eine vielfältige Bevölkerung von Nervenzellen im Rückenmark und Hirnstamm. Beschriftete Neuronen in dieser Studie stellen Schaltungen innervieren Motoneuron Pools in Bezug auf Megalosauridae Motorik. Robuste Kennzeichnung sieht in Rückenmark und Hirnstamm, einschließlich High Fidelity Details dendritischer Dorne und Axon Klemmen. Wir haben diese Methode auch in früheren Studien innerhalb des zervikalen Rückenmarks verwendet, um Propriospinal und Hirnstamm Reticulospinal Wege25beschriften.

Dieses Protokoll zeigt Injektion von viralen Vektoren in der Lendenwirbelsäule Rückenmark einer Ratte. Wie im Film 1, richtet sich der Schnitt durch die Identifizierung des L1-Wirbels befindet sich an der letzten Rippe. Dies dient als ein kaudalen Wahrzeichen für einen ca. 3-4 cm Schnitt, die Muskulatur über das Rückenmark L1-L4 verfügbar macht. Laminektomien der dorsalen Aspekte der Wirbel T11 T13 durchgeführt und eine abgeschrägte Glasnadel richtet sich 0,8 mm seitlich von der Mittellinie und 1,5 mm abgesenkt tief in der grauen Substanz, Virus zu injizieren.

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Protokoll

Alle folgenden chirurgischen und tierischen Versorgung Verfahren haben die Tier Pflege und Nutzung Ausschuss der Temple University gebilligt.

1. präoperative Vorbereitungen

  1. Bereiten Sie gezogenem Glas Nadeln für virale Injektion ein paar Tage vor der Operation mit 3,5 Nanoliter Kapillare Glaspipetten für Nanoliter Injektoren entwickelt. Ziehen Sie jede Pipette auf eine zweistufige Nadel Puller gemäß den Anweisungen des Herstellers, zwei Nadel Vorlagen zu erstellen.
  2. Verfeinern Sie die Spitze der Nadel Vorlagen durch das abschneiden ca. 1-2 mm überschüssige Glas mit Microscissors. Maßnahme ungefähre Maschenweite unter dem Mikroskop mit einer Kalibrierung Objektträger, Nadeln mit 30-40 µm Öffnungen zu isolieren.
  3. Mit der Nadel positioniert bei 30 Grad mithilfe einer Mikropipette Schweißkantenformer um einen Tipp mit einer 30-40 µm Blende und eine abgeschrägte Winkel von 45° zu erstellen. Breite der Blende mit der Nonius-Skala auf der Kalibrierungs-Dias zu überprüfen. Die Glasnadel mit einer Spritze mit einer flexiblen Nadel Anlage Schmutz wegspülen und markieren Sie die Nadel in regelmäßigen Abständen mit einem schwarzen Marker durchlaufen Sie Wasser und Ethanol.
  4. Legen Sie die Nadeln in einer bedeckten Petrischale zuvor mit 70 % igem Ethanol gereinigt und für 30 min. in eine biologische Sicherheit Haube unter UV-Licht sterilisiert.
  5. Bereiten Sie HiRet Lentivirus, indem eine angemessene Lautstärke aus der Tiefkühltruhe unmittelbar vor dem Eingriff.
    Hinweis: Eine angemessene Lautstärke umfasst den Betrag, der für die Injektion (1 µL pro Injektion x Anzahl der Injektionen) plus eine kleine Menge extra Volumen, zum pipettieren und laden Verluste zu berücksichtigen. Transportieren Sie und lagern Sie das Virus auf Eis bei Nichtgebrauch.
  6. Bereiten Sie den Injektor durch Einstecken in die Mikropumpe und platzieren es in einem Mikromanipulator mit einem Nonius-Skala.
  7. Für die Vorbereitung der Glasnadel, sorgfältig laden einen farbigen Farbstoff wie rotes Öl mit einer Spritze mit einer flexiblen Nadel ausgestattet. Stellen Sie sicher, dass keine Luftblasen in der Nadel bleiben. Verwenden Sie aseptischen Technik zu, beim Umgang mit der Nadelöhrs, und Berührung der Spitze unterlassen.
  8. Glas Nadel in den Injektor, um sicherzustellen, dass die Nadel korrekt in die Unterlegscheiben sitzt, Injektor GAP fest verschraubt ist und Stahl Injektor Nadel erstreckt sich ca. ¾ der Länge der Glasnadel. Virus kann in die Nadel in einem späteren Schritt geladen werden.

(2) Anästhesie und chirurgische Baustellenvorbereitung

  1. Wiegen Sie das Tier auf eine digitale Waage. Nehmen Sie die präoperative Gewicht zu bestimmen, das Volumen der Narkose erforderlich und für die Überwachung des Gewichts nach der Operation zu ermöglichen. Weiblicher Sprague-Dawley Ratten ca. 200 – 250 g wurden in dieses Protokoll verwendet.
  2. Die Ratte mit Isofluran Inhalation oder ein injiziertes Ketamin/Xylazin-Lösung zu betäuben (k / x). Hier wird Ketamin intraperitoneal 67 mg/kg und Xylazin bei einer 6,7 mg/kg Dosierung gespritzt.
  3. Bestätigen Sie eine geeignete Narkose Flugzeug durch Kneifen den Fuß fest. Tritt reflexive Rückzug, warten Sie einige zusätzliche Minuten, bevor Sie fortfahren.
    Hinweis: Beachten Sie auch die Schnurrhaare, die Augen und die Atemfrequenz auf Anzeichen von Bewusstsein. Wenn die Schnurrhaare zucken, das Auge blinkt, wenn sanft berührt oder Atmung schnell und flach ist, warten Sie, bis die Narkose Ebene tiefer mit dem Protokoll vorzugehen ist. Auch diese Zeichen während der Operation Laminektomie und Injektion zu überwachen. Wenn das Tier eine flache Narkose Ebene angezeigt wird, Verwalten einer Auffrischungsimpfung von Ketamin nur gleich zu ½ der ursprüngliche k / x Dosierung.
  4. Rasieren Sie die Ratte entlang der dorsalen Mittellinie aus der Hüfte zu den minderwertigen Winkel der Scapulae. Ziehen Sie die Haut des Tieres für eine einfachere und präzisere Rasur straff.
  5. Ophthalmologische Salbe auf beide Augen anwenden.
  6. Gelten Sie antiseptisch zu den rasierten Bereich um die Website zu sterilisieren. Genießen Sie für die erste Peeling sterilem Gaze mit einer 5 %-Jod-Lösung und Wischen entfernt alle Haare und Schmutz. Folgen Sie dieser mit einem unidirektionalen Wisch mit steriler Gaze getränkt in 70 % igem Ethanol, so dass kein Bereich zweimal kontaktiert wird. Verwenden Sie die gleiche Technik mit abwechselnden Jod und Ethanol getränkten Gaze zweimal mehr.

3. chirurgische Feld und Instrument Vorbereitung

  1. Bereiten Sie eine Reihe von autoklaviert chirurgische Werkzeuge, die ein Skalpell, Rongeurs, Ratte Zahn Zange, Frühling Schere, Arterienklemmen, mittlerer Punkt gebogene Pinzetten und Retraktoren oder gewichteten Haken enthalten durch Auspacken die sterile Verpackung um einem sterilen Bereich zu erstellen.
  2. Öffnen Sie ein Paket von sterilen OP-Handschuhe und legen Sie die sterilen Handschuh-Packung auf den Tisch. Verwenden Sie diese als zusätzliches sterile Feld für die verwendeten Werkzeuge auf um die sterile Verpackung zu vermeiden.
  3. Legen Sie eine #10 Skalpellklinge auf den sterilen Bereich. Sichern Sie die Klinge zum Griff mit Arterienklemmen. Stellung sterile Kochsalzlösung, 4,0 Chromsäure Darmsaite Naht und Materialien zu kontrollieren wie einen linken, sterile Gaze, sterile Baumwolle Spitze Applikatoren (für Muskel blutet), oder Gelfoam oder Bonewax (für Knochen blutet) an einem zugänglichen Ort Blutungen.
  4. Rufen Sie das Tier und setzen Sie ihn auf einem sterilen Tuch ab. Legen Sie die Gaze unterhalb der Blase, Urin zu sammeln. Stützen Sie das Zielgebiet mit einem gerollten Handtuch unter den Bauch. Falls vorhanden, legen Sie eine chirurgische Heizkissen unter sterilen Tuch, vor allem für längere Verfahren.
    Hinweis: Sterilität ist während der Operation Überleben wichtig. Halten Sie eine Sprühflasche mit 70 % igem Ethanol zur Verfügung, um Sterilität der behandschuhten Händen und einem Einsatz Wulst Sterilisator Wenn Instrument Sterilität gefährdet ist, oder zwischen einzelnen Operationen zu erhalten.

(4) Freilegung der Wirbelsäule und Identifizierung der Laminektomie-Website

  1. Identifizieren Sie den Bereich, wo ein Hautschnitt erfolgt durch Drücken der Finger sanft an der letzten Rippe, die L1-Wirbel zu finden. Verwenden Sie dies als ein Wahrzeichen, machen Sie einen ca. 3-4 cm Hautschnitt mit einem #10 chirurgischen Skalpell endet nur schlechter als L1, den Muskel verfügbar zu machen. Halten Sie die Haut straff durch die Verbreitung von sanften und drücken Sie fest mit der Skalpellklinge um einen sauberen Schnitt zu gewährleisten.
  2. Schneiden und oberflächliche Fett mit Zange und Schere bei Bedarf zu verbreiten. (Je nach Ziel Wirbel, es kann oder keine große Fettpolster oberflächlich, um den Muskel).
  3. Gespür für die Dornfortsätze mit der flachen der Skalpellklinge oder einen Finger. Oft werden durch ein "V" der weißen Faszie auf beiden Seiten der Mittellinie Bereich skizziert. Machen Sie einen kleinen rostral Schnitt erlauben Raum sicher auf einem oberen Prozess mit Ratte Zahn Zange greifen, dann 2 lange, tiefe Einschnitte möglichst nahe an die Prozesse wie möglich zu machen. An der tiefsten Stelle des Schnittes kann die dorsale Oberfläche der Wirbel mit der Skalpellklinge zu spüren.
  4. Halten Sie die seitlichen Muskeln beiseite mit Retraktoren oder gewichteten Haken, um die Sichtbarkeit zu verbessern. Klar Muskeln rund um die Prozesse mit einem Skalpell, Feder Schere oder Rongeurs die Form des Kopfes zu bestimmen.
    Hinweis: Denken Sie daran, dass das Rückenmark nicht die volle Länge der Wirbelsäule als Rückenmark Gewebe hält bereits in der Entwicklung als Knochen wachsen erstreckt. Dies bedeutet, dass der Ziel spinaler Ebene unter einem anders benannten Wirbel sein kann.
  5. Suchen Sie die T11 und die angrenzenden T12 und T13 Prozesse.
    Hinweis: Unterstützung bei der Ausrichtung der richtigen Wirbelkörper Ebenen finden Sie in einer Ratte Rückenmark Atlas und frühere Studien skizziert Orientierungspunkte: die Maus, die hat eine sehr ähnliche Wirbelsäule Struktur6,33. Lassen Sie eine rostral Dornfortsatz wie T9 ungestört eine Mittellinie Wahrzeichen geben.

(5) Durchführung einer Laminektomie

  1. Sobald das Zielgebiet korrekt identifiziert wurde, führen Sie Laminektomien der dorsalen Aspekte der T11 T13. Sanft verteilt die Wirbel intervertebralen Bänder gute Seiten zum Einfügen von Rongeurs für den ersten Biss des Knochens sind an Dritte weiterzugeben. Halten Sie die Rongeurs in einer halb geschlossene Position Feinsteuerung zu erhöhen.
  2. Der Dornfortsätze und der dorsalen Aspekt der Wirbel zu entfernen, indem man kleine Snacks mit den Rongeurs. Achten Sie darauf, das Rückenmark schädigen oder stören die Dura. Mit der Ratte Zahn Pinzette helfen, ziehen heben Sie das Rückenmark vom Wirbel leicht an und verringern Sie die Tendenz, Rückenmark Gewebe zu schlagen.
  3. Deaktivieren Sie Knochen entfernt von der Mittellinie, sodass die Mittellinie Blutgefäß beobachtet werden kann. Lassen Sie ein Fenster, das eindeutig zeigt das Rückenmark Gewebe und ist frei von Verschmutzungen.
  4. Berühren Sie sanft das Rückenmark mit der Pinzette. Einige Tiere können reflexiv springen, auch wenn ihre Narkose Flugzeug tief ist. Wenden Sie ein paar Tropfen von einem betäubenden Mittel wie Lidocain direkt auf das Rückenmark zu verhindern, während das Injektionsverfahren springen an.
  5. Sichern Sie das Tier in einer spinalen Halterung durch stabilisierende Pinzette Dornfortsätze rostral und kaudalen zum Fenster Laminektomie Befestigung. Heben Sie den Bauch des Tieres mit dem spinalen Halter, um die Wirkung der Atembewegungen zu negieren. Dies erhöht Nadel Stabilität und entsprechende Tiefe der Injektion zu gewährleisten.

6. Laden Virus und Positionierung des Injektors

  1. Laden Sie Virus in den Injektor ca. 5 µL auf ein Stück Parafilm pipettieren und Positionierung der Nadelöhrs so, dass die Spitze in der Drop.
  2. Verwenden Sie die Mikropumpe, bis zu 4 µL des Virus mit einer Rate von 20 – 100 nL/s zurückzuziehen.
  3. Stellen Sie den Regler zu injizieren und lassen Sie eine kleine Menge des Virus von der Nadel um sicherzustellen, dass die Spitze der Nadel nicht verstopft ist. Wischen Sie überschüssiges Virus mit einem Labor-abwischen.
    Hinweis: Eine Hamilton-Spritze mit einer Stahlnadel kann als Alternative zu gezogenem Glaspipetten verwendet werden.
  4. Positionieren Sie der Mikromanipulator zu, so dass die Nonius-Skala sichtbar ist und positionieren Sie die Nadel auf der Mittellinie des Rückenmarks zu.
    Hinweis: Die Mittellinie kann manchmal durch ein großes Blutgefäß läuft auf der Vorderfläche des Rückenmarks befinden. Jedoch kann dies in einzelnen Ratten, und Mittellinie targeting sollte im Vergleich zu einer intakten Dornfortsatz bestätigt werden.
  5. Richten Sie die Nadel seitlich um 0,8 mm mit dem Nonius-Skala auf dem Mikromanipulator.
  6. Senken Sie die Nadel auf das Rückenmark, bis er einrücken, aber nicht durchstechen, die Dura. Mit einer schnellen Drehbewegung, Punktion der Dura mit der Nadel, bis es zu einer Tiefe von 1,5 mm versenkt hat.

(7) Injektion von Virus ins Rückenmark

  1. Sobald die Nadel vorhanden ist, tritt Programm die Düse mit einer Geschwindigkeit von 400 nL/min bestätigen, dass Virus injizieren des Rückenmarks durch die Beobachtung der Fortschritte der Farbstoff Front. Es dürfen keine offensichtliche Leckage oder Vorwölbung des Rückenmarks Gewebes. Wenn Leckage beobachtet wird, kann dies manchmal durch die Reduzierung der Einspritzgeschwindigkeit auf 200 nL/min gelindert werden.
  2. Sobald die Injektion abgeschlossen ist, lassen Sie die Nadel in das Rückenmark für 2 – 5 min. (je nach Volumen injiziert) ruhen, Verbreitung des Virus zu erleichtern.
  3. Langsam ziehen Sie die Nadel heraus und bewegen auf die nächste Injektionsstelle. Injizieren Sie 1 µL des Virus in jedem der 6 gleichmäßig verteilte Standorte ca. 1 mm Abstand entlang der Länge des L1-L4 spinale Gewebes. Für jede Injektion kann die gleiche Nadel verwendet werden, solange es weiterhin ordnungsgemäß funktioniert.

(8) Wundversorgung Schließung und Post-operative

  1. Entfernen Sie das Tier aus der Wirbelsäule Halter und herausnehmen Sie Retraktoren oder Haken verwendet, um seitliche Muskel zu verbreiten. Stellen Sie sicher, dass die Wunde frei von allen Schmutz vor der Schließung.
  2. Den Muskel mit einer 4,0 Chromsäure Darmsaite Naht zu Naht. Schneiden Sie Naht Fäden in der Nähe des Knotens zur Wahrscheinlichkeit einer internen Hautreizungen zu verringern.
  3. Heften Sie die Haut mit 9 mm Wunde Clips geschlossen. Um für optimale Heilung zu ermöglichen, richten Sie die Kanten der Haut vor dem Heften.
  4. Legen Sie das Tier auf eine Wasser-Konvektion Erwärmung Pad und Monitor bis wach.
  5. Injizieren Sie 5 – 10 mL steriler Kochsalzlösung subkutan, Flüssigkeiten und ein Antibiotikum wie Cefazolin zur Vorbeugung von Infektionen wieder aufzufüllen. Wenn das Tier ist ambulant, legen Sie sie wieder zurück in seine Heimat Käfig und bieten erste Analgetika.  Die Ratten auf Anzeichen von Schmerzen und Qualen zu überwachen und nach Ihren IACUC genehmigte Verfahren zur Linderung von Schmerzen zu behandeln.

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Ergebnisse

Erfolgreiche Injektion und Transport von viralen Vektoren sollten Transduktion einer robusten Bevölkerung von einseitigen Nervenzellen im Rückenmark und in bestimmten Hirnstamm Kernen führen. Abbildung 1 zeigt Stereotype Etikettierung von Neuronen und Axonen im thorakalen Rückenmark und in die pontine Formatio Bildung der Hirnstamm bei vier Wochen nach der Injektion. GFP Ausdruck sieht in Neuronen in der grauen Substanz des thorakalen Rückenmarks auf der Seite ipsilateral...

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Diskussion

Genmanipulation von Neuronen im Gehirn und im Rückenmark hat Highlight sensorische, motorische und autonome Wege über fluoreszierende Tracing und nachwachsen Potenzial von neuronalen Traktaten nach Verletzungen27,28, gedient. 29 , 30 , 31 , 32 , 33. direkte Injektion von Doppelthebel transpo...

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Offenlegungen

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Danksagungen

Diese Arbeit wurde durch einen Zuschuss aus dem National Institute of Neurological Disorders und Schlaganfall R01 R01NS103481 finanziert und die Shriners Hospital für die pädiatrische Forschung gewährt SHC 84051 und SHC 86000 und dem Department of Defense (SC140089).

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
#10 SkalpellklingenRobozRS-9801-10Zur Verwendung mit dem Skalpell.
1-ml-SpritzenBecton, Dickinson and CompanyFür anästhetische IP-Injektionen, potenzielle Anästhesie-Auffrischungsimpfungen und Antibiotika-Injektionen.
10-ml-SpritzenBecton, Dickinson and Company309604Zur Injektion von Kochsalzlösung in das Tier nach der Operation.
4.0 Chromic Catgut NahtDemeTECHNN374-16Zur erneuten Bindung des Muskels während des Schließens.
48000 Mikropipette AnfaserWorld Precision Instruments32416Wird verwendet, um die Spitzen der gezogenen Glaskapillarrohre abzuschrägen, um funktionelle Glasnadeln zu formen.
5% JodlösungPurdue Products L.P.L01020-08Zur Verwendung bei der Sterilisation des Operationsfeldes.
70% EthanolN/AN/AFür die Sterilisation von neu präparierten Glasnadeln, Tiermodellen während der chirurgischen Vorbereitung und Chirurgenhänden während der Operation, sowie alle anderen geringfügigen Aufrechterhaltungen der Sterilität.
Anästhetikum (Ketamin/Xylazin-Lösung)Zoetis240048Um das Tier während der Operation in der richtigen Bewusstseinsebene zu halten.
Antibiotikum (Cefazolin)West-Ward PharmaceuticalsNPC 0143-9924-90Zur subkutanen Injektion zur Vorbeugung von Infektionen nach der Operation.
Bead-SterilisatorCellPoint5-1450Zur Wärmesterilisation von chirurgischen Instrumenten.
BonewaxFine Science Tools19009-00Zur Versiegelung von Knochen bei Knochenblutungen.
CauterizerFine Science Tools18010-00Zur Versiegelung von Arterien oder Venen, die während der Operation durchtrennt wurden, um übermäßigen Blutverlust zu verhindern.
DigitalwaageOkausREV.005Zum Wiegen des Tieres während der chirurgischen Vorbereitung.
Flexibler NadelaufsatzWorld Precision InstrumentsMF34G-5Zum Reinigen von Glasnadeln und zum Befüllen von Glasnadeln mit rotem Öl.
GelfoamPfizerH68079Zur Versiegelung des Knochens bei Knochenblutungen.
GlaskapillarrohreWorld Precision Instruments4878Für gezogene Glasnadeln - sollten für Nanoliter-Injektoren ausgelegt sein.
HaarschneiderOster111038-060-000Zum Reinigen der Operationsstelle von Haaren.
HämostatikaRobozRS-7231Für den allgemeinen Gebrauch in der Chirurgie.
KimwipesKimtech34155Für den allgemeinen Gebrauch in der Chirurgie.
Gebogene Zange mit mittlerem PunktRobozRS-5136Für den allgemeinen Einsatz in der Chirurgie.
Mikromanipulator mit einer Nonius-SkalaKanetecN/AFür präzises Zielen während der Operation.
MikroschereRobozRS-5621Zum Schneiden von Glasflüstern von frisch gezogenen Glaskapillarrohren.
Mikroskop mit Licht- und Nonius-Skala OkularLeitz WetzlarN/ADient zur Visualisierung und Messung der Abschrägung von gezogenen Glaskapillarrohren zu funktionsfähigen Glasnadeln.
Steuerung der MikroSpritzenpumpeWorld Precision Instruments62403Zur Steuerung der Injektionsrate.
Nanoliter 2000 Pumpenkopf-InjektorWorld Precision Instruments500150Zum kontrollierten Laden und Injizieren von Viren.
NadelabzieherNarishigePC-100Zum Erhitzen und Auseinanderziehen von Glaskapillarrohren zu Glasnadeln.
Ophthalamische SalbeDechra Veterinary ProductsRAC 0119Zum Schutz der Augen des Tieres während der Operation.
ParafilmBemisPM-996Zur Unterstützung des Ladens von Viren in den Nanoinjektor.
PrecisionGlide Nadeln (25G x 5/8)Becton, Dickinson and Company305122Zur Verwendung mit den 1-ml- und 10-ml-Spritzen, um die Injektion des Tiermodells zu ermöglichen.
RattenzahnzangeRobozRS-5152Zum Greifen von Dornfortsätzen.
Rotes ÖlN/AN/AZur Bereitstellung einer Front für die Visualisierung von Viren, die während der Injektion in das Gewebe eindringen.
RetraktorenRobozRS-6510Um die Operationswunde offen zu halten.
Rimadyl TablettenBio ServMP275-050Zur Schmerzbehandlung nach der Operation.
RongeursRobozRS-8300Zur Entfernung von Muskeln aus der Wirbelsäule während der Operation.
SkalpellklingengriffRobozRS-9843Zum Aufschneiden der Haut und des Fettpolsters eines Tiermodells während der Operation.
SchereRobozRS-5980Für den allgemeinen Einsatz in der Chirurgie.
Wundclips aus rostfreiem StahlCellPoint201-1000Zum Abbinden der Haut der Operationswunde während des Schließens.
Zange zum Entfernen von KlammernKent ScientificINS750347Um die Klammern zu entfernen, wenn sie falsch angebracht wurden.
Steriles TuchPhenix Research ProductsBP-989Um eine sterile Oberfläche für die Operation bereitzustellen.
Sterile Applikatoren mit WattespitzePuritan806-WCZum Aufsaugen von Blut in der Operationswunde unter Beibehaltung der Sterilität.
SterileGaze Covidien2146Zur Reinigung des Operationsbereichs und der chirurgischen Instrumente unter Beibehaltung der Sterilität.
Sterile KochsalzlösungBaxter Healthcare Corporation281324Zur Verwendung bei der Blutreinigung und zum Ersatz von Flüssigkeiten nach der Operation.
OP-HandschuheN/AN/AZur Verwendung durch den Chirurgen, um ein steriles Feld während der Operation zu erhalten.
Chirurgisches HeizkissenN/AN/AZur Aufrechterhaltung der Körpertemperatur des Tiermodells während der Operation.
OperationsmikroskopN/AN/AZur besseren Visualisierung der Operationswunde.
Chirurgisches KlammergerätKent ScientificINS750546Zum Auftragen der Klammern.
T/Pump Wärmetherapie-WasserpumpeGaymarTP500CZum Pumpen von warmem Wasser in das Wasserkonvektions-Wärmekissen.
Wasser-Konvektions-WärmekissenBaxter Healthcare CorporationL1K018Für den Einsatz im postoperativen Erholungsbereich, um die Körpertemperatur des bewusstlosen Tieres aufrechtzuerhalten.
Gewichtete HakenN/AN/AZum Offenhalten der Operationswunde.
309659

Referenzen

  1. Wang, X., et al. Deconstruction of corticospinal circuits for goal-directed motor skills. Cell. 171 (2), 440-455 (2017).
  2. Kinoshita, M., et al. Genetic dissection of the circuit for hand dexterity in primates. Nature. 487 (7406), 235-238 (2012).
  3. Brichta, A. M., Grant, G. Cytoarchitectural organization of the spinal cord. The rat nervous system. Vol. 2, hindbrain and spinal cord. , Academic Press. (1985).
  4. Liang, H., Paxinos, G., Watson, C. Projections from the brain to the spinal cord in the mouse. Brain Structure & Function. 215 (3-4), 159-186 (2011).
  5. Rexed, B. The cytoarchitectonic organization of the spinal cord in the cat. The Journal of Comparative Neurology. 96 (3), 414-495 (1952).
  6. Schmued, L. C., Fallon, J. H. Fluoro-gold: A new fluorescent retrograde axonal tracer with numerous unique properties. Brain Research. 377 (1), 147-154 (1986).
  7. Veenman, C. L., Reiner, A., Honig, M. G. Biotinylated dextran amine as an anterograde tracer for single- and double-labeling studies. Journal of Neuroscience Methods. 41 (3), 239-254 (1992).
  8. Watson, C., Paxinos, G., Kayalioglu, G., Heise, C. Atlas of the rat spinal cord. The spinal cord. , 238-306 (2009).
  9. Brandt, H. M., Apkarian, A. V. Biotin-dextran: A sensitive anterograde tracer for neuroanatomic studies in rat and monkey. Journal of Neuroscience Methods. 45 (1-2), 35-40 (1992).
  10. Geed, S., van Kan, P. L. E. Grasp-based functional coupling between reach- and grasp-related components of forelimb muscle activity. Journal of Motor Behavior. 49 (3), 312-328 (2017).
  11. Reiner, A., Veenman, C. L., Medina, L., Jiao, Y., Del Mar, N., Honig, M. G. Pathway tracing using biotinylated dextran amines. Journal of Neuroscience Methods. 103 (1), 23-37 (2000).
  12. Steward, O., Zheng, B., Banos, K., Yee, K. M., et al. Response to: Kim et al., "axon regeneration in young adult mice lacking nogo-A/B." neuron 38, 187-199. Neuron. 54 (2), 191-195 (2007).
  13. Brown, B. D., et al. A microRNA-regulated lentiviral vector mediates stable correction of hemophilia B mice. Blood. 110 (13), 4144-4152 (2007).
  14. Lo Bianco, C., et al. Lentiviral vector delivery of parkin prevents dopaminergic degeneration in an alpha-synuclein rat model of parkinson's disease. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (50), 17510-17515 (2004).
  15. Malik, P., Arumugam, P. I., Yee, J. K., Puthenveetil, G. Successful correction of the human cooley's anemia beta-thalassemia major phenotype using a lentiviral vector flanked by the chicken hypersensitive site 4 chromatin insulator. Annals of the New York Academy of Sciences. 1054, 238-249 (2005).
  16. Pawliuk, R., et al. Correction of sickle cell disease in transgenic mouse models by gene therapy. Science. 294 (5550), 2368-2371 (2001).
  17. Wang, G., et al. Feline immunodeficiency virus vectors persistently transduce nondividing airway epithelia and correct the cystic fibrosis defect. The Journal of Clinical Investigation. 104 (11), R55-R62 (1999).
  18. Liang, H., Paxinos, G., Watson, C. The red nucleus and the rubrospinal projection in the mouse. Brain Structure & Function. 217 (2), 221-232 (2012).
  19. Abdellatif, A. A., et al. delivery to the spinal cord: comparison between lentiviral, adenoviral, and retroviral vector delivery systems. Journal of Neuroscience Research. 84 (3), 553-567 (2010).
  20. DePolo, N. J., et al. VSV-G pseudotyped lentiviral vector particles produced in human cells are inactivated by human serum. Molecular Therapy. 2 (3), 218-222 (2000).
  21. Higashikawa, F., Chang, L. Kinetic analyses of stability of simple and complex retroviral vectors. Virology. 280 (1), 124-131 (2001).
  22. Hirano, M., Kato, S., Kobayashi, K., Okada, T., Yaginuma, H., Kobayashi, K. Highly efficient retrograde gene transfer into motor neurons by a lentiviral vector pseudotyped with fusion glycoprotein. PLoS One. 8 (9), e75896(2013).
  23. Kato, S., et al. A lentiviral strategy for highly efficient retrograde gene transfer by pseudotyping with fusion envelope glycoprotein. Human Gene Therapy. 22 (2), 197-206 (2011).
  24. Kato, S., et al. Selective neural pathway targeting reveals key roles of thalamostriatal projection in the control of visual discrimination. The Journal of Neuroscience. 31 (47), 17169-17179 (2011).
  25. Sheikh, I. S., Keefe, K. M., et al. Retrogradely transportable lentivirus tracers for mapping spinal cord locomotor circuits. Frontiers in Neural Circuits. 12, 60(2018).
  26. Harrison, M., et al. Vertebral landmarks for the identification of spinal cord segments in the mouse. NeuroImage. 68, 22-29 (2013).
  27. Tang, X. Q., Heron, P., Mashburn, C., Smith, G. M. Targeting sensory axon regeneration in adult spinal cord. The Journal of Neuroscience. 27 (22), 6068-6078 (2007).
  28. Cameron, A. A., Smith, G. M., Randall, D. C., Brown, D. R., Rabchevsky, A. G. Genetic manipulation of intraspinal plasticity after spinal cord injury alters the severity of autonomic dysreflexia. The Journal of Neuroscience. 26 (11), 2923-2932 (2006).
  29. Liu, Y., Keefe, K., Tang, X., Lin, S., Smith, G. M. Use of self-complementary adeno-associated virus serotype 2 as a tracer for labeling axons: Implications for axon regeneration. PLoS One. 9 (2), e87447(2014).
  30. Chamberlin, N. L., Du, B., de Lacalle, S., Saper, C. B. Recombinant adeno-associated virus vector: Use for transgene expression and anterograde tract tracing in the CNS. Brain Research. 793 (1-2), 169-175 (1998).
  31. Filli, L., et al. Bridging the gap: A reticulo-propriospinal detour bypassing an incomplete spinal cord injury. The Journal of Neuroscience. 34 (40), 13399-13410 (2014).
  32. Williams, R. R., Pearse, D. D., Tresco, P. A., Bunge, M. B. The assessment of adeno-associated vectors as potential intrinsic treatments for brainstem axon regeneration. The Journal of Gene Medicine. 14 (1), 20-34 (2012).
  33. Smith, G. M., Onifer, S. M. Construction of pathways to promote axon growth within the adult central nervous system. Brain Research Bulletin. 84 (4-5), 300-305 (2011).
  34. Morcuende, S., Delgado-Garcia, J. M., Ugolini, G. Neuronal premotor networks involved in eyelid responses: Retrograde transneuronal tracing with rabies virus from the orbicularis oculi muscle in the rat. The Journal of Neuroscience. 22 (20), 8808-8818 (2002).
  35. Ugolini, G. Specificity of rabies virus as a transneuronal tracer of motor networks: Transfer from hypoglossal motoneurons to connected second-order and higher order central nervous system cell groups. The Journal of Comparative Neurology. 356 (3), 457-480 (1995).
  36. Gelderd, J. B., Chopin, S. F. The vertebral level of origin of spinal nerves in the rat. The Anatomical Record. 188 (1), 45-47 (1977).
  37. Inquimbert, P., Moll, M., Kohno, T., Scholz, J. Stereotaxic injection of a viral vector for conditional gene manipulation in the mouse spinal cord. Journal of Visualized Experiments. 73, e50313(2013).
  38. Carbajal, K. S., Weinger, J. G., Whitman, L. M., Schaumburg, C. S., Lane, T. E. Surgical transplantation of mouse neural stem cells into the spinal cords of mice infected with neurotropic mouse hepatitis virus. Journal of Visualized Experiments. 53, e2834(2011).
  39. Snyder, B. R., et al. Comparison of adeno-associated viral vector serotypes for spinal cord and motor neuron gene delivery. Human Gene Therapy. 22 (9), 1129-1135 (2011).
  40. Cronin, J., Zhang, X. Y., Reiser, J. Altering the tropism of lentiviral vectors through pseudotyping. Current Gene Therapy. 5 (4), 387-398 (2005).
  41. Reed, W. R., Shum-Siu, A., Onifer, S. M., Magnuson, D. S. Inter-enlargement pathways in the ventrolateral funiculus of the adult rat spinal cord. Neuroscience. 142 (4), 1195-1207 (2006).
  42. Mao, X., Schwend, T., Conrad, G. W. Expression and localization of neural cell adhesion molecule and polysialic acid during chick corneal development. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 53 (3), 1234-1243 (2012).
  43. Charles, P., et al. Negative regulation of central nervous system myelination by polysialylated-neural cell adhesion molecule. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (13), 7585-7590 (2000).
  44. Tervo, D. G., et al. A designer AAV variant permits efficient retrograde access to projection neurons. Neuron. 92 (2), 372-382 (2016).
  45. Tohyama, T., et al. Contribution of propriospinal neurons to recovery of hand dexterity after corticospinal tract lesions in monkeys. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (3), 604-609 (2017).
  46. Liu, Y., et al. A sensitized IGF1 treatment restores corticospinal axon-dependent functions. Neuron. 95 (4), 817-833 (2017).
  47. Kinoshita, M., et al. Genetic dissection of the circuit for hand dexterity in primates. Nature. 487 (7406), 235-238 (2012).

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