Ausdruck, Solubilisierung und Reinigung der eukaryotischen Borat-Transporter

Summary

Hier präsentieren wir ein Protokoll, um auszudrücken, solubilisieren und mehrere eukaryotischen Borat-Transporter mit Homologie zur SLC4 Transporter Familie mit Hefe zu reinigen. Wir beschreiben auch einen chemische Vernetzung Assay zur Beurteilung der gereinigten Homomeric Proteine für Multimeric Montage. Diese Protokolle können für andere anspruchsvolle Membranproteine angepasst werden.

Abstract

Die gelöste Stoff Träger 4 (SLC4) Familie von Proteinen heißt die Bikarbonat-Transporter und beinhaltet das archetypische Protein Anion Exchanger 1 (AE1, auch bekannt als Band 3), das am häufigsten vorkommende Membranprotein in den roten Blutkörperchen. Die SLC4 Familie ist homolog mit Borat-Transporter, die in Pflanzen und Pilzen charakterisiert wurden. Es bleibt eine große technische Herausforderung zu äußern und Membran-Transportproteine zur Homogenität in Mengen geeignet für strukturelle oder funktionelle Studien zu reinigen. Hier beschreiben wir detaillierte Verfahren für die Überexpression von Borat-Transporter in Saccharomyces Cerevisiae, Isolation von Hefe Membranen, Solubilisierung des Proteins durch Waschmittel und Reinigung von Borat Transporter homologe von S. Cerevisiae, Arabidopsis Thalianaund Oryza Sativa. Wir beschreiben auch ein Experiment, um Multimerization Homomeric Transporter assay Vernetzung Glutaraldehyd. Unsere generalisierten Verfahren können angewendet werden, um alle drei Proteine und Wirksamkeit optimiert worden. Viele der hier entwickelten Strategien sowohl für das Studium der anderen anspruchsvollen Membranproteine einsetzbar.

Introduction

Die Schwierigkeiten bei der Beschaffung ausreichender Menge gereinigtes Membranprotein bleibt ein kritischer Engpass bei der Verfolgung von strukturellen und funktionellen Studien über Rezeptoren, Ionenkanäle und Transportern. Viele Protokolle gibt es für mäßig hohen Durchsatz Pipelines zu den Bildschirm und finden Kandidaten Membranproteine, die gut genug ausdrücken ermöglichen weitere in-vitro- Studien^1,2,3,4 . In der Regel sind Proteine mit ein N oder C-terminale grün fluoreszierenden Proteins (GFP) und Ausdruck Niveaus werden überwacht durch Fluoreszenz-Gel oder durch Fluoreszenz-Detektion Größe Ausgrenzung Chromatographie (FSEC)⁵. Solche Ansätze ermöglichen die Selektierung der Membran-Protein-Kandidaten in hohe mit dem Ausdruck ihrer Proteine, moderate oder geringe Proteine, zum Ausdruck zu bringen oder Proteine, die schlecht oder überhaupt nicht zum Ausdruck bringen. Dieser Ansatz funktioniert gut, wenn das Versuchsdesign ist zu untersuchen, große Anzahl von Kandidaten-Gene mit der Absicht auswählen, welches Protein am besten zum Ausdruck bringt. Allerdings ist in einigen Fällen ein experimenteller Ansatz ausgesagt, auf das Studium einen bestimmten Membranprotein, das schwierig sein kann, wenn das Protein Ausdruck Niveaus im Bereich mittlerer oder niedriger sind. Darüber hinaus können manchmal in diesen Fällen Ausdruck Ebenen nur minimal erhöht werden durch eine Änderung des Konstrukts über Trunkierungen, thermostabilizing Mutationen oder Codon Optimierung. Es ist daher manchmal notwendig, Membran-Protein Expression und Reinigung Protokolle für Membranproteine optimieren, die nur mäßig gut ausdrücken.

Die SLC4 Familie von Transportern umfasst die Bikarbonat-Transporter Anion Exchanger 1 (auch bekannt als Band 3), das am häufigsten vorkommende Membranprotein in roten Blutkörperchen⁶und ein wesentlicher Treiber der Zellatmung. Die SLC4 Familie ist homolog mit Borat-Transporter, die kritisch sind in Pflanzen und haben gezeigt, dass eine ähnliche Struktur Anion Exchanger 1 sowie Natrium-gekoppelten SLC4 Transporter^{7,8,9 aufweisen ,10}. Hier berichten wir über optimierte Protein Expression und Reinigung Protokolle mit S. Cerevisiae , drei verschiedene Borat-Transporter in Hefe und Pflanzen gefunden zu reinigen. Wir zeigen im Detail wichtige Schritte, die wir zur Optimierung der Ausbeute und Effizienz der Reinigungen zur Homogenität. Darüber hinaus berichten wir über eine chemische Vernetzung Assay mit Glutaraldehyd um Multimeric Montage dieser Transporter im Zusammenhang mit einem gereinigten Protein-Reinigungsmittel-Lipid-Komplex zu überwachen. Das vernetzende Experiment helfen Homolog und Reinigungsmittel Eignung beurteilen durch die Beurteilung des Multimeric Zustand der Oligomere Transporter nach der Reinigung.

Dieses Protokoll setzt voraus, dass der gewünschte Transporter in ein Plasmid 2 µ abgeleitet unter induzierbaren Kontrolle des Veranstalters für die Expression in S. CerevisiaeGAL1 geklont wurde. Für diese Verfahren wurde DNA Kodierung in voller Länge Wildtyp Borat Transporter Saccharomyces Cerevisiae Bor1 verwendet (ScBor1)¹¹, Arabidopsis Thaliana Bor1 (AtBor1)¹²und Oryza Sativa Bor3 (OsBor3)¹³ . Der C-Terminus in jedes Konstrukt wird mit einem 10-His-Tag angehängt und ein Thrombin-Spaltstelle eingefügt zwischen den Transporter und den 10-His-Tag um seine Entfernung zu ermöglichen, wenn gewünscht. Das Protokoll wird auch davon ausgehen, dass das Plasmid bereits in die DSY-5 Ausdruck Belastung von S. Cerevisiae komplette zusätzliche Selektivmedien (CSM) fehlt Histidin umgewandelt wurde.

Protocol

1. Vorbereitung von Medien und wichtige Puffer

1. Bereiten Sie durch Zugabe von 200 g Galaktose und deionisiertes Wasser auf ein Gesamtvolumen von 500 mL 500 mL 40 % Galaktose vor. Verwenden Sie eine heiße Platte oder in der Mikrowelle zu einer erhöhten Rate von Galaktose in Lösung. Sterilfilter mit einem Vakuumfiltration Apparat, bestehend aus einen 0,2 µm Filter oben mit einer sterilen Glasflasche verbunden.
   Hinweis: Alle Medien-Lösungen werden mit deionisiertes Wasser zubereitet.
2. Bereiten Sie durch Zugabe von 200 g Glucose und Wasser zu einem Gesamtvolumen von 500 mL 500 mL 40 % Glukose vor. Autoklav zu sterilisieren.
3. Zugeben Sie in jedem der vier 2 L Flaschen 0,4 g komplette Ergänzung Mischung ohne Histidin (CSM-HSI), 3,35 g Hefe Stickstoff mit Ammoniumsulfat (YNB + Stickstoff) und 475 mL Wasser. Autoklaven. Fügen Sie 25 mL 40 % Glukose, eine endgültige Glukosekonzentration von 2 % zu erreichen.
4. Hinzufügen einer Glasflasche, 50 g Pepton und 25 g Hefeextrakt und 375 mL Wasser. Autoklaven. Hinzugeben Sie 125 mL 40 % Galaktose zu geben 5 x Hefe Pepton (YP) Lösung mit 10 % Galaktose.
5. Hinzufügen, um eine 250 mL Flasche 0,04 g CSM-HSI, 0,335 g YNB + Stickstoff und Wasser bis 47,5 mL. Autoklaven. Fügen Sie 2,5 mL 40 % Glukose zu 50 mL der CSM-HSI + YNB + 2 % Glukose.
6. Bereiten Sie 1 L 1M Tris pH 7.0 121,14 g Tris Basis mit 800 mL Wasser vermischen. Fügen Sie konzentrierten Salzsäure hinzu, bis der pH-Wert 7,0 erreicht. Ein finales Volumen von 1 L Wasser hinzufügen und einen 0,2 µm-Filter durchlaufen.
7. Bereiten Sie 500 mL 0,5 M Ethylenediaminetetraacetic Acid (EDTA) pH 8.0 73,06 g EDTA mit 400 mL Wasser vermischen. Hinzufügen von Natriumhydroxid Pellets bis EDTA aufgelöst hat und der pH-Wert 8.0 erreicht. Ein finales Volumen von 500 mL Wasser hinzufügen und einen 0,2 µm-Filter durchlaufen.
8. Bereiten Sie 100 mL 100 mM Phenylmethanesulfonyl Fluorid (PMSF vor) durch das Mischen von 1,74 g PMSF mit 200 Beweis Ethanol. Shop bei-20 ° C.
9. Bereiten Sie 225 mL 2 x Perle Waschpuffer bestehend aus 50 mM Tris pH 7,0, 1,4 M NaCl, 20 % Glycerin und 1 mM EDTA pH 8.0 vor.
10. Bereiten Sie 100 mL Puffer Größe Ausgrenzung Chromatographie (S200 Puffer) bestehend aus 20 mM 4-Morpholinoethanesulfonic Säure-Hydrat (MES) pH 6,5, 100 mM NaCl, 2 % Glycerin und 0,03 % n-Dodecyl-Beta-D-Maltopyranoside (DDM vor).
11. Bereiten Sie 100 mL Membran Wiederfreisetzung Puffer bestehend aus 50 mM Tris pH 7,0, 500 mM NaCl, und 10 % Glycerin.
12. Bereiten Sie 10 mL eines 3 x SDS-PAGE laden Farbstoff durch Mischen von 3 mL 20 % Sodium Dodecyl Sulfat (SDS), 3 mL Glycerin, 2,4 mL 1M Tris pH 6.8, 0,03 g Bromophenol Blue und 1,6 mL 2-Mercaptoethanol vor.

2. die Überexpression von Borat-Transporter in S. cerevisiae

1. Impfen drei transformierte Hefe Kolonien in 50 mL CSM-HSI + YNB + 2 % Glukose Medien und schütteln über Nacht bei 190 u/min bei 30 ° C.
2. Am nächsten Tag ein Spektralphotometer verwenden, um festzustellen, die optische Dichte bei einer Wellenlänge von 600 nm (OD₆₀₀) und auf einer OD₆₀₀ 0,01 vier 2 L Flaschen, die jeweils 500 mL CSM-HSI enthalten impfen + YNB + 2 % Glukose Medien.
3. Schütteln Sie bei 190 u/min bei 30 ° C für 30 h erlauben die Zellen verbrauchen alle Glukose und wachsen, um eine hohe Dichte.
   Hinweis: Eine längere Wachstumszeit Ergebnisse in größeren Zelle ergibt, größere geernteten Membran Erträge und letztlich größeres gereinigtes Protein ergibt.
4. Ausdruck durch Zugabe von 125 mL 5 X YP Medien ergänzt mit 10 % Galaktose für eine endgültige Induktion-Konzentration von 2 % Galaktose zu induzieren. Schütteln Sie bei 190 u/min bei 30 ° C 16 h.
5. Ernte-Zellen durch Spinnen bei 4.000 X g für 15 min. Aufschwemmen der Zellen in 100 mL kaltem Wasser.
   Hinweis: an dieser Stelle Zellen können eingefroren werden bei-80 ° C auf unbestimmte Zeit oder die Vorbereitung kann in Zelle Lysis und Membran Ernte weiter. Wir ernten in der Regel 40-45 g Zellen.

3. Gewinnung von Hefe Membranen

1. Hinzu kommt die Zelle Wiederfreisetzung 11,25 mL 1M Tris pH 7,0, 0,45 mL 0,5 M EDTA und 2,25 mL 100 mm PMSF, Letzteres, von denen zwei als Protease-Inhibitoren wirken. Fügen Sie Wasser zu einem Endvolumen von 225 mL, die Ergebnisse in eine Zelle Wiederfreisetzung Puffer von 50 mM Tris pH 7,0, EDTA, 1 mM und 1 mM PMSF hinzu.
   Hinweis: Wenn mit gefrorenen Zellen Zellen gründlich, ca. 1 h bei Raumtemperatur auftauen lassen, weil wenn sie teilweise eingefroren bleiben, lyse durch Wulst schlagen widerstehen wird.
2. Fügen Sie die Zelle Wiederfreisetzung in einen 450 mL Metall-Kanister für Bead schlagen. Krönen Sie das restliche Volumen mit kalten 0,5 mm Glasperlen.
3. Eine Perle-Prügel-Kammer mit dem Rotor montieren und Tauchen in ein Eisbad. Führen Sie sechs 1 min Impulsen, getrennt durch 2 min Ruhezeiten der lysate Überhitzen zu vermeiden.
4. Montieren Sie einen Vakuumfiltration Apparat, indem mit einem Kunststoff Einweg Flasche Top Filter geschraubt in einer Glasflasche. Die Filtration Membran zu entfernen, da die verbleibenden Kunststoff Gerät die Perlen erfasst werden kann, wobei lysate übergeben. Trennen Sie die Perlen von der lysate Gießen Sie den Inhalt der Wulst schlagen Kammer auf die Assembly beim Anlegen des Vakuums.
5. Waschen Sie die Wulst schlagen Kammer mit 225 mL eines 2 x Waschpuffer, die 50 mM Tris pH 7,0, 1 mM EDTA, 1 mM PMSF, 1,4 M NaCl und 20 % Glycerin enthält. Leeren Sie den Inhalt der Kammer auf die Perlen zu waschen.
   Hinweis: Die Wäsche gibt einem Endvolumen von ~ 450 mL lysiert Zellen und deutlich erhöht geernteten Membran ergibt. Die Endkonzentrationen sind 50 mM Tris pH 7,0, 1 mM EDTA, 1 mM PMSF, 10 % Glycerin und 700 mM NaCl, und der primäre Zweck der Erhöhung der Salzkonzentration soll helfen, periphere Membranproteine distanzieren.
6. Spin-down der Zelle lysate für 15 min bei 15.000 X g. Gießen Sie den Überstand in Polycarbonat-Flaschen und Spin für 1 h bei 135.000 X g in einer Ultrazentrifuge Membranen zu sammeln.
   Hinweis: Wenn eine Ultrazentrifuge nicht verfügbar ist, können Membranen von Spinnen für 3 h bei 53.000 X g, eine Kraft gesammelt werden, die im Boden Modell Zentrifugen erreicht werden kann.
7. Verwerfen Sie den Überstand und wiegen Sie die Flaschen mit dem Membran-Pellets. Die Membran-Pellets in etwa 35 mL Membran Wiederfreisetzung Puffer mit 50 mM Tris pH 7,0, 500 mM NaCl, und 10 % Glycerin Aufschwemmen und ein Glas Douncer hinzufügen. Wiegen Sie die leere Zentrifuge Röhren um die Masse der Membranen geerntet zu bestimmen.
   Hinweis: In eine effiziente Membran-Ernte, das Gewicht der Membranen entspricht etwa 20 % wird das Gewicht der Zellen für die Membran-Ernte verwendet. Dieses Protokoll gibt typische Zelle Ertrag von 40-45 g, und so erwarten wir ebenfalls eine Rendite von 8-9 g Membranen.
8. Dounce Homogenisieren der Membranen und Aliquot in 50 mL konische Röhrchen, die nun auf unbestimmte Zeit bei-80 ° c gespeichert werden kann
   Hinweis: Für dieses Experiment sind in der Regel zwei Aliquote gemacht, erlauben zwei separate Protein-Reinigungen von einem ursprünglichen Zelle Vorbereitung durchgeführt werden.

(4) Solubilization und Reinigung des Proteins

1. Ein Becherglas fügen Sie hinzu, rühren Bar und 150 mg n-Dodecyl-β-D-Maltopyranoside (DDM) pro g Membran verwendet wird. Seien Sie stets Protein auf dem Eis oder bei 4 ° C.
   Hinweis: DDM ist hygroskopisch und sollte in ein Glas mit Trockenmittel bei-20 ° C Wenn nicht in Gebrauch gespeichert werden. Darüber hinaus ist es üblich, zwischen 4 – 5 g der Membranen in eine Reinigung, eine nennenswerte Menge an reines Protein zu erhalten zu verwenden.
2. Auftauen von Membranen und bringen zu einem Endvolumen von 15 mL pro g Membran Membran Wiederfreisetzung Puffer mit 1 mM PMSF und 20 mM Imidazol pH 8.0 ergänzt. Das Becherglas mit DDM Membranen hinzu und rühren Sie für 1 h bei 4 ° C.
   Hinweis: Die DDM-Konzentration werden 1 % w/V, aber es ist für die Solubilisierung von Membranproteinen kritischer bewusst von der Masse der Reinigungsmittel pro g Membran hinzugefügt werden.
3. Spinnen Sie für 25 min bei 135.000 X g bei 4 ° C zu Pellets nicht solubilisiert Material. Filtern Sie den Überstand durch eine 5 µm-Spritze-Filter.
4. Lastsatz die Probe durch die peristaltischen Pumpe für einen Durchfluss von 1 mL/min auf eine 1 mL immobilisierten Nickel Affinität Säule equilibriert in 20 mM Tris pH 7,0, 500 mM NaCl, 10 % Glycerin, 20 mM Imidazol pH 8.0 und 0,05 % DDM.
   Hinweis: Für die unteren mit dem Ausdruck ihrer Proteine, verbesserte Reinheit und Erträge beobachtet mit 1 mL statt 5 mL Spalte und Nickel anstelle von Kobalt-Ionen für die Affinitätschromatographie.
5. Waschen Sie die Spalte mit 10 Spalte Bände einer Waschpuffer mit 20 mM Tris pH 7,0, 500 mM NaCl, 10 % Glycerin, 80 mM Imidazol pH 8.0 und 0,05 % DDM.
   Hinweis: Die Imidazol-Konzentration, die für ein 10-sein-tagged Proteins während Waschungen verwendet werden kann ist höher als allgemein geschätzt und zu verbesserten Reinheit führt.
6. Das Protein in den Puffer mit 20 mM Tris pH 7,0, 200 mM NaCl, 10 % Glycerin, 300 mM Imidazol pH 8.0 und 0,05 % eluieren DDM. Sammeln Sie das Eluat in zehn 1 mL Fraktionen zu und führen Sie auf einem 4-20 % Tris-Glycin SDS-PAGE Gel zusammen mit solubilisiert lysate und waschen-Fraktionen.
7. Pool Gipfel Brüche, in der Regel etwa 5-6 mL und konzentrieren sich auf 500 µL oder weniger Volumen in einem 50 kDa cutoff Konzentrator in einer Benchtop-Zentrifuge bei 4 ° c gekühlt
   Hinweis: 500 µL ist eine typische maximale Größe Ausgrenzung Chromatographiesäulen (SEC) injiziert. An dieser Stelle das Protein kann auf unbestimmte Zeit bei-80 ° C gelagert werden oder fahren Sie auf die Sek.
8. Das Protein durch einen 0,2 µm Spin Spaltenfilter filtern und Spritzen auf eine Spalte "Größe Ausgrenzung" (z. B. Superdex-200) in S200 Puffer equilibriert: 20 mM Mes pH 6,5, 100 mM NaCl, 2 % Glycerin und 0,03 % DDM.
   Hinweis: Für die nachfolgenden Glutaraldehyd Vernetzung Assay, muss der Pufferung Agent kein primäres Amin enthalten. SEC ist eine Gelegenheit, Puffer, falls erforderlich, austauschen, wie hier geschehen, beim Austausch von Tris für Mes.
9. Führen Sie die Spitze Fraktionen auf ein 4-20 % Tris-Glycin SDS-PAGE gel. Fleck das Gel, pure Spitze Brüche zu sammeln und konzentrieren sich in einem 50 kDa-Cutoff-Konzentrator bei 4 ° c
10. Konzentration des Proteins zu bestimmen, durch Messung der Extinktion bei einer Wellenlänge von 280 nm und Shop auf unbestimmte Zeit bei-80 ° C.

5. Vernetzung Assay Glutaraldehyd

1. Vorbereiten einer 10 µL Reaktion durch das Mischen von 3 µL 0,5 mg/mL Protein in S200 Puffer, 5 µL S200 Puffer, 1 µL entweder Wasser oder 20 % Sodium Dodecyl Sulfat (SDS), gefolgt von 1 µL 1,5 % Glutaraldehyd.
   Hinweis: Dies wird eine 1 X Reaktion von 0,15 mg/mL Protein und 0,15 % Glutaraldehyd geben. Proben, die eine Vorbehandlung der SDS werden sind wichtige Negativkontrollen und gemischt und bei Raumtemperatur für 5 min vor dem Hinzufügen von Glutaraldehyd inkubiert.
2. Inkubieren Sie die Reaktion für 30 min bei Raumtemperatur. Beenden Sie die Reaktion durch Zugabe von 5µL 3 x SDS-PAGE Gel laden Farbstoff, der ein Übermaß an Tris-Puffer enthält, die das Glutaraldehyd stillt.
3. Laden Sie alle 15 µL auf 4-20 % Tris-Glycin SDS-PAGE Gel, das 1,5 µg Protein pro Bahn geladen wird. Führen Sie das Gel bei 200 V für 30 min. Fleck und bestimmen Sie das Ausmaß der Dimer Vernetzung durch Beweise für eine Band, die mit doppelt so groß wie das denaturierte Monomer ausgeführt wird.
   Hinweis: Eine Glutaraldehyd Titration und zeitlichen Verlauf können zuerst durchgeführt, um die besten Voraussetzungen für eine Homomeric-Transporter finden.

Results

Typische Gele für die eluierten Fraktionen aus Nickel Affinitätschromatographie zeigen alle drei Proteine teilweise gereinigt (Abb. 1A). Auf der rechten Seite der Leiter ist der lysate, die jeweils nicht zeigen einer signifikanten Band entspricht des Borat-Transporters, die typisch für Proteine, die nicht gut overexpress. Die 80 mM-waschen-Spur zeigt minimalen Verlust des 10-sein-tagged Proteins trotz der relativ hohen Imidazol-Konzentration. Bänder entsprechend der Borat-Transporter sind offensichtlich in eluierten Brüche und Brüche als die Masse des eluierten Proteins enthalten sind vor der Injektion auf die S200 Gel Filtration Säule konzentriert. In diesem Stadium werden die Proteine nicht ausreichend für viele nachgelagerte Anwendungen gereinigt, wie durch zusätzliche Bänder in der konzentrierte Probe vor der Injektion auf die S200-Säule (Abbildung 1B). Einspritzen der Probe auf die Spalte "Größe Ausgrenzung" zeigt jedoch eluierten Bruchteile von hoher Reinheit (Abbildung 1B-C). Chromatogramme und ihre entsprechenden Gele für jede der Borat-Transporter werden vorgestellt. Trotz der moderaten Reinheit der Proben nach der Elution von Affinitätschromatographie ist das Protein hochreines auf eluierenden aus der Gel-Filtration-Spalte. Entscheidend ist, zeigen die Chromatogramme jedes Protein, in erster Linie als ein einzelnes Monodisperse Peak mit wenig Eiweiß in das Hohlraumvolumen beibehalten zu migrieren. Ein stabiles und gefaltete Protein gibt in der Regel eine Monodisperse und symmetrische Peak, instabil, fehlgefaltete oder aggregierte Protein in der Regel mehrere asymmetrische Peaks oder einen großen Höhepunkt in dem Hohlraumvolumen geben wird. Es ist typisch für eine endgültige Ausbeute von etwa 2 mg gereinigtes Protein pro L Hefekultur für ScBor1 und ca. 1 mg gereinigtes AtBor1 und OsBor3 pro L Kultur zu erhalten. Diese Zahlen sind die Menge an Protein gereinigt aus einem aliquoten von 4-5 g Membranen, stammt aus einer Hälfte unserer ursprünglichen Zelle Vorbereitung.

Das vernetzende Experiment zeigt, dass gereinigtes Homomeric Transporter können ihre Montage in Lösung leicht bewertet (Abbildung 2). Die Proben, die eine Vorbehandlung der SDS soll zeigen, dass Vernetzung abhängig von einer gefalteten Zustand in Lösung ist und Vernetzung daher tritt nicht auf, wenn Multimerization von einem rauen Reinigungsmittel gestört wird. Die dargestellten Ergebnisse zu unterscheiden, dass eines der drei Borat-Transporter, ScBor1, nicht dimerized ist, wenn unter diesen Bedingungen in DDM gereinigt, während die anderen beiden, AtBor1 und OsBor3, vernetzen und Dimerisierung zu zeigen. Es ist möglich zu sehen, dass nicht alle Protein vernetzen kann. In diesem Beispiel sind die Spuren von OsBor3 Monomer sichtbar, während AtBor1 bis zur Fertigstellung Vernetzungen. Das Ausmaß der Vernetzung richtet sich nach der Anzahl der Lysin-Reste in der Nähe zueinander, und es ist möglich, dass andere vernetzenden Reagenzien verschiedene Membranproteine effizient vernetzen können.

Abbildung 1 . Nickel-Affinität und Größe Ausgrenzung Chromatographie Reinigung für drei Borat Transporter. Jede vertikale Platte (A), (B) und (C) enthält Daten für ScBor1, AtBor1 und OsBor3. (A) Nickel Affinität Spalte. M ist eine Leiter Molekulargewicht Marker mit Gewichten im kDa angegeben auf der linken Seite. L das Roh lysate, und W 80 mM Imidazol waschen. Alle anderen nummerierten Bahnen entsprechen 1 mL Fraktionen mit 300 mM Imidazol eluiert. Balken oben Brüche zeigen die ausgewählt wurden, werden zusammengefasst und Wasser für Injektionszwecke auf die Säule konzentriert. (B) P zeigt konzentriertes Protein vor der Injektion auf die S200-Säule. Eluierten SEC Fraktionen sind auf der rechten Seite, mit Klammern verwendet, um Gel Gassen mit ihren Chromatogramm Brüche in (C) übereinstimmen. Das Hohlraumvolumen ist kurz nach 8 mL. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Abbildung 2 . Vernetzung Assay bewertet gereinigten Transporter für Multimeric Montage. Eine Leiter mit Molekulargewichten wird auf der linken Seite angezeigt. Vor allem anderen Bahnen wird angezeigt, welches Protein vorhanden ist und ob die Probe Glutaraldehyd hinzugefügt oder eine Vorbehandlung der SDS vor Glutaraldehyd Zugabe hatte. Pfeile zeigen die Positionen der Monomer- und Dimer für AtBor1 und OsBor3. ScBor1 ist ein kleiner Protein als AtBor1 und OsBor3 und läuft wie erwartet. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Discussion

Hier haben wir ausführliche Protokolle geteilt, die sich bei der Reinigung zur Homogenität von drei verschiedenen eukaryontischen Borat Transporter ergeben. Die hier vorgestellten Protokolle stammen aus anderen Protokolle für den Ausdruck des integralen Membranproteine in S. Cerevisiae^1,14, und unsere Optimierungen Ergebnis verbesserte Reinheit und verbesserte Erträge. Die Parameter optimiert hier gehören Zelle Kultur Wachstum Mengen und Zeiten, Wulst-schlagende Lyse Verfahren, Puffer Zusammensetzung während der Zelle Lysis und Proteinreinigung, Waschmittelmenge verwendet pro Gramm Membran, Metall-Ionen in Affinitätsreinigung zu identifizieren, Volumen der Affinität Spalte und die Umsetzung eines vernetzende Assays, Homolog und Reinigungsmittel Eignung zu bewerten, durch die Beurteilung des Multimeric Zustand der Oligomere Transporter. Die Protokolle sind erfolgreich für mehrere SLC4 homologe aus der Pflanzen- und Pilzarten. Eine Einschränkung aller Strategien für die Reinigung von integralen Membranproteinen ist, dass es gibt keine universelle Membrane Protein Reinigungsverfahren, die garantiert funktionieren. Es ist möglich, dass unsere Protokolle wahrscheinlicher sind, erfolgreich zu sein, für Proteine näher in Sequenz Identität und Struktur SLC4 Transporter, und damit Mitglieder der Familien SLC4, SLC23 und SLC26 könnte viel versprechende richtet sich an¹⁵. Ebenso die mehr evolutionär weit entfernt von der Borat-Transporter ist ein Membran-Transporter möglicherweise, desto wahrscheinlicher das Protokoll müssen anders, z. B. durch Variation Expressionssystems, Reinigungsmittel oder andere wichtige Parameter⁴.

Das Protokoll nutzt das am häufigsten verwendete Affinität Tag in Proteinreinigung, His-Tag. Trotz der Anwesenheit von Verunreinigungen in den anfänglichen eluierten Fraktionen die Kombinationen von Nickel-Affinität, umfangreiche waschen und nachfolgende SEC Reinigung resultiert in hohem Grade gereinigten Protein. Ein 10-His-Tag ermöglicht die strengere Imidazol wäscht und so entferne mehr Hintergrund-Bindeproteine als Waschungen gestattet durch 8-HSI - oder 6-His-Tags entfernt werden können. Unsere Auswahl für sortenreine Fraktionen irren auf der konservativen Seite der meisten hochreines Gel Fraktionen, die Spitze SEC Fraktionen entsprechen. Endgültige Protein Erträge können durch Bündelung und Konzentration mehr Brüche gesteigert werden, wobei der Nachteil der etwas weniger reines Protein. Die hier vorgestellten Methoden ermöglicht die Reinigung des AtBor1 in Mengen, die für die Bestimmung der seine Kristall-Struktur-⁷, mit Reinigung unterschieden, bestehend aus der His-Tag abschneiden und den Austausch des Transporters in ein anderes geführt Waschmittel, Kristall Beugung⁷zu verbessern.

Unser Protokoll wirft wichtige Überlegungen bei der Auswahl von homologen und das Waschmittel verwendet zu lösen und sie zu reinigen. DDM ist eine gemeinsame erste Wahl für Waschmittel, denn es relativ mild, oft erfolgreich bei Gefäss-ist und in strukturelle und funktionelle Studien eine Vielzahl von Membranproteinen verwendet worden. Bestimmen, ob ein Waschmittel eine schlechte Auswahl für eine Membran ist, eine gängige Methode der Auswertung gibt ob das Protein einen einzigen Monodisperse Höhepunkt auf einem SEC-Chromatogramm, anstatt einen großen Höhepunkt in dem Hohlraumvolumen oder einen Bereich von Polydisperse Gipfeln, die zeigen Sie fehlgefaltete oder instabilen Proteins. Ein subtiler Aspekt wird durch unsere Reinigung des ScBor1 ausgelöst. Es reinigt in großen Mengen und sieht positive und Monodisperse auf einer SEC-Chromatogramm, was darauf hindeutet, dass es ein attraktives Ziel für strukturelle Studien sein könnte. Unsere Vernetzung Test zeigt jedoch, dass es ein Monomer wenn gereinigt ist. Es ist, zwar möglich, dass ScBor1 nativ als ein Monomer in der Zelle existieren könnte zeigen Studien, dass SLC4 Transporter und deren homologe Dimere^7,8,9,10sein dürften. Unsere Entwicklung des vernetzende Assays trat nach kristallisieren und die Struktur der AtBor1 zu lösen. Jedoch konnten wir ScBor1 im Vergleich zu AtBor1 mit der Vernetzung Test auswerten wertvolle Zeit und Forschung Bemühungen konnte für die Ausübung von AtBor1 anstelle von ScBor1, von denen die letztere letztlich gelang es nicht umgeleitet werden können Kristallisation und Beugung Experimente. Dieser Assay kann somit helfen, Forscher unterscheiden zwischen Homologen oder Reinigungsmittel zu verwenden, wenn strukturelle Studien verfolgt um Bedingungen zu priorisieren, in denen das Protein seine mutmaßlichen nativen Konformation unterhält. Darüber hinaus kann der Test verwendet werden, zu sondieren, welche Aminosäuren für Multimerization, von entscheidender Bedeutung sind, um Aminosäure Substitutionen finden, die die Multimerization-Schnittstelle und führen zu Monomeren verpflichten zu destabilisieren. Ein solcher Ansatz wurde verwendet, um die funktionelle Bedeutung der Homomeric Versammlung in Membran Transporter^16,17,18Sonde.

Ein genereller Vorteil unserer Methode ist, dass Hefe gezeigt worden, um den Ausdruck von vielen anspruchsvollen Membranproteine der vielfältigen Funktion¹ermöglichen. Darüber hinaus fördern seine niedrigen Kosten und Wachstum Zeiten seine Zugänglichkeit für viele Forschungsanstrengungen, die möglicherweise weniger Ausdruck Strategien einsetzen, die Gewebekultur oder teure Wachstumsmedien erfordern. Die hier vorgestellten Verfahren sind relativ preiswert und in einer Woche, die was die Machbarkeit des Konzepts unterstreicht durchgeführt werden können. Umsetzung dieser Protokolle kann helfen, strukturelle und funktionelle Studien von anderen anspruchsvollen Membranproteinen zu ermöglichen.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-Mercaptoethanol	Sigma-Aldrich	M3148
4-Morpholinethansulfonsäurehydrat (MES)	Acros	172591000
Ä kta Pure 25 L FPLC	GE Healthcare	29018224
Amicon Ultra 15 mL, 50 kDa MWCO Konzentrator	Millipore	UFC905024	zur Konzentration von Nickelsäulenfraktionen
Amicon Ultra 4 mL, 50 kDa MWCO Konzentrator	Millipore	UFC805024	zur Konzentration von S200 Fraktionen
Bacto Pepton	BD Diagnostik	211677
Bacto Hefeextrakt	BD Diagnostik	288620
Erlenmeyerkolben aus Glas, 2L	Sigma-Aldrich	CLS44442L
Tischzentrifuge	Sorvall	Legend RT
Flaschenaufsatzfilter	Nalgene	595-4520	die Membran wird entfernt und zum Filtern von Glasperlen verwendet
Bromophenolblau	Sigma-Aldrich	114391
Komplette Ergänzungsmischung ohne Histidin	Sunrise Science	1006-100
D-Galactose	Sigma-Aldrich	G0750
D-Glucose	Sigma-Aldrich	RDD016
Ethanol, 200 Proof	Pharmco-Aaper	111000200
Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA)	Sigma-Aldrich	EDS-500G
Geltank SDS-PAGE System	Bio-Rad	1658004
Glasperlenschlagender Zelldisruptor	BioSpec	1107900
Glasperlen, 0,5 mm	BioSpec	11079105
Glutaraldehyd	Elektronenmikroskopie Sciences	16019	als 8%ige Lösung unter Stickstoff
Glycerin	Sigma-Aldrich	G7893
HiTrap IMAC FF Säule, 1 mL	GE Healthcare	17-0921-02	geladen mit Nickel
Salzsäure	Sigma-Aldrich	258148
Imidazol	Acros	12202
Instant Blue Gel-Färbung	Expedeon	ISB1L
JA-10 Rotor	Beckman	369687
JA-14 Rotor	Beckman	339247
Mikrozentrifugenröhrchen, 1,5 mL	Thermo Scientific	3451
Mikrozentrifuge, gekühlt	Fisher	13-100-676
Mini-Protean Tris-Glycin-Gele, 4-20%	Bio-Rad	456-1096
Minipuls 3 Schlauchpumpe	Gilson	F155005	zur Beladung der Affinitätssäule mit Lysat auf die Affinitätssäule
n-Dodecyl-beta-D-Maltopyranosid (DDM)	Inalco	1758-1350
Nickel(II)-sulfat-Hexahydrat	Sigma-Aldrich	227676
Orbital-Schüttelinkubator mit Temperaturregelung	New Brunswick	C24
p423 GAL1 Plasmid mit Borattransporter-Einsatz			von Autoren erhältlich
Phenylmethansulfonylfluorid (PMSF)	Acros	215740050
Polycarbonat-Ultrazentrifugenröhrchen	Beckman	355618
Polypropylenflaschen, 250 mL	Beckman	356011
Polypropylenflaschen, 500 mL	Beckman
Precision Plus Protein Kaleidoscope Standards	Bio-Rad	1610375
S. cerevisiae Expressionsstamm DSY-5			von den Autoren erhältlich
Natriumchlorid	Sigma-Aldrich	S7653
Natriumdodecylsulfat	Sigma-Aldrich	L3771
Natriumhydroxid	Sigma-Aldrich	S8045
Spin-Säule mit 0,2 & Mikro; m-Filter, 0,5 ml	Millipore-UFC30GV0S		zur Filterung von Proteinen vor der Injektion auf die S200-Säule
	Sterile Falcon-Röhrchen, 15	ml-Labor-Depot
sterile Falcon-Röhrchen, 50 ml-Labor-Depot-TLD431698
Superdex 200 10/300 GL-Säule	GE Healthcare	17-5175-01	für die SEC-Aufreinigung
Spritzenfilter, 5 μm; m	Pall	4650	zur Filterung des Lysats vor dem Laden der Affinitätssäule
Tris-Base	Sigma-Aldrich	T1503
Typ 70 Ti Rotor	Beckman	337922
Ultrazentrifuge	Beckman	L8-70M
YNB+Stickstoff ohne Aminosäuren	Sunrise Science	1501-500