Verbesserte Hefe One-Hybrid Screens, Transkriptionsfaktor Bindung an menschliche DNA-Sequenzen zu identifizieren

Zusammenfassung

Hier präsentieren wir Ihnen eine erweiterte Hefe One-Hybrid screening Protokoll um den Transkriptionsfaktoren (TFs) zu identifizieren, die an einer menschlichen DNA-Region of Interest binden können. Diese Methode nutzt eine Hochdurchsatz-Screening-Pipeline, die die Bindung von Verhören kann > 1.000 TFs in einem einzigen Experiment.

Zusammenfassung

Die Sätze von Transkriptionsfaktoren (TFs), die jedem menschlichen Gens regulieren zu identifizieren, ist eine schwierige Aufgabe, die erfordert zahlreiche experimentelle und rechnerische Ansätze zu integrieren. Eine solche Methode ist die Hefe ein-Hybrid (Y1H) Assay, in welche, die Wechselwirkungen zwischen TFs und DNA-Regionen im Milieu der Nucleus Hefe mit Reporter-Gene getestet werden. Y1H-Assays umfassen zwei Komponenten: als "DNA-Köder" (z.B.., Promotoren, Enhancer, Schalldämpfer, etc.) und eine "TF-Beute," die auf Reporter Genaktivierung untersucht werden kann. Die meisten veröffentlichten Protokolle für die Durchführung von Y1H-Bildschirme basieren auf TF-Beute Bibliotheken oder Arrays in DNA-Köder Hefestämme zu verwandeln. Hier beschreiben wir eine Pipeline, verbesserte Y1H genannt (eY1H) Tests, wo TF-DNA-Wechselwirkungen verhört werden, bei der Paarung DNA-Köder-Stämme mit einer angeordneten Sammlung von TF-Beute Stämme mit einem high-Density-Array (HDA) Roboter-Plattform, mit der Vorführung in einem 1.536 Kolonie-Format. Dies ermöglicht eine drastische Zunahme der Durchsatz (60 DNA-Köder-Sequenzen gegen > 1.000 TFs dauert zwei Wochen pro Forscher) und Reproduzierbarkeit. Wir illustrieren die verschiedenen Arten von erwarteten Ergebnissen von Tests menschlichen Promotorsequenzen gegen eine Reihe von 1.086 menschlichen TFs, sowie Beispiele für Probleme, die während der Bildschirme und wie man sie beheben können.

Einleitung

Ein zentrales Problem im Bereich Biomedizin ist die Mechanismen Bestimmung jedes menschliche gen geregelt. Transkription ist der erste Schritt bei der Kontrolle der gen-Expression-Ebenen, und es wird durch Sätze von Transkriptionsfaktoren (TFs), die einzigartig für jedes Gen reguliert. Angesichts der Tatsache, dass Menschen für kodieren > 1.500 TFs^1,2, Ermittlung des vollständigen Satzes von TFs, die der Tätigkeit des einzelnen Gens Steuern bleibt eine offene Herausforderung.

Zwei Arten von Methoden können verwendet werden, um TF-DNA-Wechselwirkungen Karte: TF-zentriert und DNA-zent....

Protokoll

1. Vorbereitungen

1. SC −U −H Platten (150 mm Petrischalen)
   Hinweis: Diese Platten werden für den Anbau von DNA-Köder-Hefestämme verwendet werden.
   1. Auflösen der Drop-out-Mix, Hefe-Stickstoff-Basis (YNB), Adenin Hemisulfate und Ammoniumsulfat in 920 mL Wasser und pH 5.9 mit 5 M NaOH (ca. 1 mL pro Liter Medien; siehe Tabelle 2 für Komposition). Gießen Sie in eine 2 L Flasche und fügen Sie eine Stir Bar.
   2. In einem zweiten 2 L Kolben Agar zu 950 mL Wasser hinzufügen (fügen Sie eine Stir Bar Agar in den Autoklaven Überkochen führen wird).
   3. Autoklaven für 40 min bei 15 Psi auf einem flü....

Ergebnisse

Drei wesentliche Faktoren berücksichtigt werden, wenn Analyse ergibt sich aus eY1H Assays: Reporter Hintergrundaktivität des DNA-Köder-Stammes, die Stärke der Reporter Aktivität entsprechend TF-DNA-Wechselwirkungen und die Anzahl der positiven Kolonien. Der Reporter Hintergrundaktivität (d. h. Autoactivity) der DNA-Köder Belastung bezieht sich auf das Wachstum und die Farbe der Hefe Kolonien auf der Platte auslesen, auch in Abwesenheit des TF-Beute. Im Idealfall nicht Autoactive Stämme zeigen eine weiße oder helle braune.......

Diskussion

Der hier beschriebene stark Roboter eY1H Paarung Screening Ansatz erhöht den Durchsatz um den Satz von TFs zu identifizieren, die an eine DNA-Region, im Vergleich zu früheren Bibliothek Screening oder angeordneten Screening Ansätze beruhen auf Umwandlung zu binden. Weiter, die TF-DNA-Wechselwirkungen von eY1H, die Tests sehr reproduzierbar sind, da 90 % der Interaktionen erkannt sind positiv für alle vier Kolonien pro TF getestet, und 90 % der Interaktionen testen in einem unabhängigen Bildschirm des gleichen Hefe DNA-Kö.......

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
3-Amino-1,2,4-triazol (3AT) ~95 % TLC	Sigma	A8056-100G	Kompetitiver Inhibitor für Produkte des HIS3-Gens
Adeninsulfat (Hemisulfat), Dihydrat	US Biologicals	A0865	Erforderlich für ein ordnungsgemäßes Hefewachstum
Agar Hohe Gelstärke - Bakteriologische Qualität	American International	Chemical AGHGUP	Nährmedien für das Hefewachstum
Ammoniumsulfat	US Biologicals	A1450	Stickstoffquelle in synthetischen Hefemedien
D+ Glukose wasserfrei	US Biologicals	G3050	Erforderlich für das Hefewachstum
Drop-Out-Mix minus His, Leu, Tryp und Uracil, adeninreich ohne Hefestickstoffbasis	US Biologicals	D9540-02	Synthetisches komplettes Medium für Hefewachstumsrand
erforderlich Multiparameter-pH-Messgerät	Hanna Instruments	HI2020-01	Zur Messung des pH-Werts von selektiven Medien
Flache Zahnstocher 750 ct	Diamant		Zum Streifen von Hefen auf Petrischalen
Glasperlen	Walter Stern	100C	Zum Vernichten von Hefe bei der Herstellung von Rasen
Glycerin ≥ 99%	Millipore Sigma	G9012-1L	Erforderlich für die Herstellung von gefrorenen Hefebrühen
L-Histidin	US Biologicals	H5100	Für die Selektion des Hefewachstums in selektiven
Medien L-Leucin	US Biologicals	L2020-05	Für die Selektion des Hefewachstums in selektiven
Medien L-Tryptophan	Sigma	T-0254	Für die Selektion des Hefewachstums in selektiven
Medien N, N-Dimethylformamid	Sigma	319937-1L	Zur Herstellung von X-Gal-Lösung
Omnipense Elite	Wheaton	W375030-A	Zum Dosieren präziser Medienmengen in Singer-Platten
Pepton, bakteriologisch	American International Chemical	PEBAUP	Proteinquelle, die für das Hefewachstum erforderlich
ist Petrischale, 150 mm x 15 mm	VWR	10753-950	Für den Anbau von Hefeködern für
Siebung PlusPlates	Singer Instruments	PLU-003	Zur Herstellung von rechteckigen Agarplatten zur Verwendung mit dem Singer Robot
Precision Niedertemperatur-BSB-Kühlinkubator	ThermoFisher Scientific	PR205745R	Zur Inkubation von Hefeplatten bei konstanter Temperatur
RePads 1.536 kurz	Singer Instruments	REP-005	Zur Übertragung des TF-Beute-Arrays, der Paarung der Hefe und der Übertragung der Hefe auf diploide Selektions- und Ausleseplatten
RePads 384 kurz	Singer Instruments	REP-004	Zur Übertragung des TF-Beute-Arrays von 384 auf das 1.536er Kolonieformat
RePads 96 lang Singer	Instruments	REP-001	Zur Übertragung des TF-Beute-Arrays vom Glycerinstamm auf die Agarplatte
RePads 96 kurz	Singer Instruments	REP-002	Zum Transfer von TF-Beute-Arrays vom Kolonieformat 96 auf 384
Singer HDA RoToR-Roboter	Singer Instruments		Für den Transfer von Hefe im Hochdurchsatz
Natriumhydroxid (Pellets/Certified ACS)	Fisher	S318-1	Zur Einstellung des pH-Werts von selektiven Medien
Natriumphosphat zweibasisches Heptahydrat	Santa Cruz Biotechnologie	sc-203402C	Erforderlich für die LacZ-Reporteraktivität auf X-gal
Monobasisches Natriumphosphat-Monohydrat	Santa Cruz Biotechnology	sc-202342B	Erforderlich für die LacZ-Reporteraktivität auf Röntgen
Uracil	Sigma	U0750-100G	Für die Selektion des Hefewachstums in selektiven Medien
X-gal (5-Brom-4-chlor-3-indoxyl-beta-Dgalactopyranosid)	Gold Biotechnology	X4281C100	β-Galactosidase färbt farbloses X-Gal blau, um Protein-DNA-Wechselwirkungen zu erkennen
Hefeextrakt	US Biologicals	Y2010	Nahrhaftes Medium für das Wachstum und die Vermehrung von Hefe
Hefe Stickstoff Base (Pulver) ohne AA, Kohlenhydrate und ohne AS	US Biologicals	Y2030	Erforderlich für ein kräftiges Hefewachstum

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