Methodenartikel

Erzeugung, Verstärkung und Titration von rekombinanten Respiratory Syncytial Viren

DOI:

10.3791/59218

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4. April 2019

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1UMR 1173 Institut national de la santé et de la recherche médicale (INSERM), Université de Versailles St. Quentin, 2UR892 Institut national de la recherche agronomique (INRA), Unité de virologie et immunologie moléculaires, 3Assistance Publique–Hôpitaux de Paris (AP-HP), Hôpital Ambroise Paré, Laboratoire de Microbiologie

Korrespondierende Autoren: Marie-Anne Rameix-Welti <ma.welti@free.fr>

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Wir beschreiben eine Methode zur Erzeugung und Verstärkung genetisch modifiziert respiratory syncytial Viren (RSV) und eine optimierte Plaque-Assay für RSV. Wir veranschaulichen dieses Protokolls durch die Schaffung von zwei rekombinanter Viren, die Quantifizierung der RSV-Replikation ermöglichen bzw. live-Analyse des RSV Einschlusskörperchen und Einschlusskörperchen-assoziierten Granulat Dynamik.

Zusammenfassung

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Der Einsatz von rekombinanten Viren ist entscheidend in der Basis- oder angewandte Virologie geworden. Reverse Genetik ist nachgewiesen worden, werden eine extrem leistungsfähige Technologie, sowohl virale Replikationsmechanismen zu entschlüsseln und zu studieren antivirale Medikamente oder Impfstoffe Entwicklungsplattform vorsehen. Den Bau und die Manipulation von einem reverse genetische System für einen negativ-Strang RNA-Virus wie ein respiratory syncytial Virus (RSV), allerdings bleibt zart und erfordert spezielles Know-how. Der RSV-Genom ist eine Single-Strang, negativen Sinn RNA von ca. 15 kb, die als Vorlage für die virale RNA-Replikation und Transkription dient. Unser reverse Genetik-System nutzt eine cDNA-Kopie des RSV lange Belastung Humangenoms (HRSV). Diese cDNA sowie cDNAs Codierung virale Proteine der komplexen Polymerase (L, P, N und M2-1) befinden sich in einzelnen Expressionsvektoren unter T7 Polymerase Steuersequenzen. Die Transfektion dieser Elemente in BSR-T7/5 Zellen, die stabil T7 Polymerase ausdrücken, ermöglicht die zytoplasmatischen Replikation und Transkription der rekombinanten RSV zu gentechnisch veränderten Virionen. Eine neue RSV, die an der Zelloberfläche und in der Kultur Überstand des BSRT7/5 vorliegt, ist versammelt, um menschliche HEp-2 Zellen für virale Verstärkung zu infizieren. Zwei oder drei Runden der Verstärkung sind erforderlich, um virale Bestände mit 1 x 106 bis 1 x 107 Plaque-bildenden Einheiten (PFU) / mL. Methoden für die optimale Ernte, Einfrieren und Titration der viralen Bestände sind hier ausführlich beschrieben. Wir illustrieren das Protokoll hier vorgestellten durch die Schaffung von zwei rekombinanter Viren bzw. Ausdruck freies grünes fluoreszierendes Protein (GFP) (RSV-GFP) oder viralen M2-1 mit GFP (RSV-M2-1-GFP) verschmolzen. Wir zeigen, wie mithilfe von RSV-GFP um RSV-Replikation und der RSV-M2-1-GFP viralen Strukturen sowie virale Proteindynamik in lebenden Zellen visualisieren mit Videomikroskopie Techniken zu quantifizieren.

Einleitung

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Menschlichen RSV ist die führende Ursache der Hospitalisierung für akute Infektion der Atemwege in Säuglinge weltweit1. RSV ist darüber hinaus mit einer erheblichen Krankheitslast bei Erwachsenen vergleichbar mit Grippe, mit die meisten Krankenhausaufenthalt und Sterblichkeit in der ältere2Belastung verbunden. Gibt es keine Impfstoffe oder spezifische antivirale Medikamente noch gegen RSV, aber vielversprechende neue Medikamente sind in Entwicklung3,4. Die Komplexität und die Schwere der Techniken der Quantifizierung der RSV Multiplikation erschweren die Suche na....

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Protokoll

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1. materielle Vorbereitung

  1. Zelle Medien zu kaufen (reduzierte Serum Medien, minimale unerlässlich [MEM] 10 x MEM und Dulbecco modifizierten Adlers Medium [DMEM]), Transfection Reagens und mikrokristalline Cellulose (siehe Tabelle der Materialien).
  2. Erhalten folgenden Vektoren für reverse Genetik: die genomische Vector(s) und die Codierung des N-Proteins und der Polymerase komplexe Proteine Expressionsvektoren. Die genomischen Vektoren enthalten das volle cDNA Genom der RSV-GLP (p-RSV-GFP) und der RSV-M2-1GFP (p-RSV-M2-1GFP) stromabwärts von Bakteriophagen T7-RNA-Polymerase (T7 Pol) Veranstalter. Die Expressionsvektoren (bezeichnet a....

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Ergebnisse

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In dieser Arbeit beschrieben, ein detailliertes Protokoll zur Herstellung rekombinanter RSV-Viren mit dem Ausdruck eines fluoreszierenden Proteins (Abbildung 2). Im pRSV-GFP wurde das GFP-gen zwischen dem P und M gen eingeführt, wie für die Kirsche gen zuvor veröffentlichte Arbeit21beschrieben. In pRSV-M2-1-GFP das M2-gen war unangetastet gelassen und ein zusätzliches Gen Kodierung für M2-1-GFP zwischen SH und G Gene1.......

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Diskussion

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Hier präsentieren wir eine Methode zur Rettung des rekombinanten RSV aus fünf Plasmide und ihre Verstärkung. Die Fähigkeit zu manipulieren, das Genom der Viren revolutioniert Virologie-Forschung, um Mutationen zu testen und ein zusätzliches Gen oder ein tagged viral Protein ausdrücken. Der RSV haben wir beschrieben und als ein Beispiel in diesem Artikel ist ein Virus mit dem Ausdruck ein Reportergen, RSV-GLP (unveröffentlicht) und drückt eine M2-1-Protein mit einem GLP-Tag12verschmolzen. RSV-Rettu.......

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Offenlegungen

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Die Autoren haben nichts preisgeben.

Danksagungen

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Die Autoren danken Dr. Qin Yu von AstraZeneca R & D Boston, MA, USA, für die Bereitstellung der AZD4316 Droge. Die Autoren sind dankbar für die Cymages-Plattform für den Zugriff auf die ScanR Olympus Mikroskop, das durch unterstützt wurde aus der Region Ile-de-France (DIM eine Gesundheit) gewährt. Die Autoren erkennen Unterstützung von INSERM und der Universität Versailles Saint-Quentin.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
35 mm & Mikroschale für die Bildgebung lebender ZellenIbidi81156
A549ATCCATCC CCL-185
Avicel RC-591FMC BioPolymerAvicel RC-591Technische und weitere Informationen zu Avicels finden Sie unter http://www.fmcbiopolymer.com. Bei Raumtemperatur lagern. Das Protokoll in Schritt 4 ist für dieses Reagenz optimiert.
BSRT7/5nicht im Handel erhältlichSiehe Referenz 22. Buchholz et al. 1999
Kristallviolette LösungSigmaHT90132
Fluoreszenzmikroskop für BeobachtungenOlympusIX73 Olympus Mikroskop
Fluoreszenzmikroskop für die VideomikroskopieOlympusScanR Olympus Mikroskop
HEp-2ATCCATCC CCL-23
HEPES ≥ 99,5%SigmaH3375
L-Glutamin (200 mM)ThermoFisher Scientific25030024
LIPOFECTAMINE 2000 REAGENZThermoFisher Scientific11668019Protokoll in Schritt 2.3. ist für dieses Reagenz optimiert.
MEM (10x), ohne GlutaminThermoFisher Scientific11430030
GlutaMAX SupplementThermoFisher Scientific41090-028
MgSO4 ReagenzPlus, ≥ 99,5 %SigmaM7506
Opti-MEM I Reduziertes SerummediumThermoFisher Scientific51985-026
Wässrige Paraformaldehyd-Lösung, 32 %, EM-QualitätElektronenmikroskopieSciences 15714
Penicillin-Streptomycin (10.000 U/ml)ThermoFisher Scientific15140122
Plasmidenicht im Handel erhältlichSiehe Referenz 21. Rameix-Welti et al., 2014
Siehe, Saw RockerVWR444-0341
Si RNA, GAPDHDharmaconON-TARGETplus siRNA
, D-001810-10-05		SMARTpool und 3 von 4 einzelnen siRNAs, designed by Dharmacon.
Si RNA IMPDH2DharmaconON-TARGETplus siRNA IMPDH2 Pool- Human
L-004330-00-0005		SMARTpool aus 4 einzelnen siRNAs, entworfen von Dharmacon.
Individuelle Referenzen und Sequenzen
J-004330-06: GGAAAGUUGCCCAUUGUAA;
J-004330-07: GCACGGCGCUUUGGUGUUC;
J-004330-08: AAGGGUCAAUCCACAAAUU;
J-004330-09: GGUAUGGGUUCUCGAUG;
Si RNA RSV NDharmaconON-TARGETplus benutzerdefinierte siRNAUUCAGAAGAACUAGAGGCUAU und UUUCAUAAAUUCACUGGGUUA
SiRNA NTDharmaconON-TARGETplus Non-targeting Pool
SiRNA TransfektionsreagenzDharmaconDharmaFECT 1 Ref: T-2001-03Protokoll in den Schritten 5.1 und 5.1.2 sind für dieses Reagenz optimiert.
Natriumbicarbonat 7,5% LösungThermoFisher Scientific25080094
SpektrofluorometerTecanTecan unendlich M200PRO
MEM, , , , , ,

Referenzen

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  1. Shi, T., et al. Global, regional, and national disease burden estimates of acute lower respiratory infections due to respiratory syncytial virus in young children in 2015: a systematic review and modelling study. The Lancet. 390 (10098), 946-958 (2017).
  2. Falsey, A. R., Hennessey, P. A., Formica, M. A., Cox, C., Walsh, E. E.

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Schlagwörter

Rekombinantes Respiratorisches Synzytial VirusReverse Genetik SystemAmplifikation von VirusstocksPlaque Titrations AssayBSR T7 5 ZellenHEp 2 ZellinfektionGFP Fluoreszenz TrackingMikrokristalliner Cellulose OverlayVirusernte durch EinfrierenPlaque bildende Einheiten

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