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Methodenartikel

Konvektion Verbesserte Lieferung von optogenetischen Adeno-assoziierten Viral vektor an den Cortex von Rhesus Macaque unter Anleitung von Online-MRT-Bildern

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DOI:

10.3791/59232

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23. Mai 2019

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1Departments of Bioengineering, University of Washington, 2Washington National Primate Research Center, 3Department of Electrical and Computer Engineering, University of Washington, 4Department of Physiology and Center for Integrative Neuroscience, University of California, San Francisco

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Hier zeigen wir Magnetresonanz (MR)-geführte Konvektions-verstärkte Abgabe (CED) von viralen Vektoren in den Kortex als effizienten und vereinfachten Ansatz zur Erzielung optogenetischer Expression über große kortikale Bereiche im Makakenhirn hinweg.

Zusammenfassung

In der Optogenetik von nicht-menschlichen Primaten (NHP) ist die Infektion großer kortikaler Bereiche mit viralen Vektoren oft eine schwierige und zeitaufwändige Aufgabe. Hier zeigen wir die Verwendung von Magnetresonanz (MR)-geführte Konvektions-verstärkte Abgabe (CED) optogenetischer viraler Vektoren in primäre somatosensorische (S1) und motorische (M1) Kortiken von Makaken, um eine effiziente, weitverbreitete kortikale Expression von lichtempfindliche Ionenkanäle. Adeno-assoziierte virale (AAV) Vektoren, die das rot verschobene Opsin C1V1 kodieren, das mit gelbem fluoreszierendem Protein (EYFP) verschmolzen ist, wurden unter MR-geführtem CED in den Kortex von Rhesusmakaken injiziert. Drei Monate nach der Infusion bestätigte die epifluoreszierende Bildgebung große Regionen optogenetischer Expression (>130 mm2) in M1 und S1 in zwei Makaken. Darüber hinaus konnten wir zuverlässige lichtevokierte elektrophysiologische Reaktionen aus den exzessierten Bereichen mit mikroelektrokortikographischen Arrays aufzeichnen. Spätere histologische Analysen und Immunflecken gegen den Reporter ergaben eine weit verbreitete und dichte optogenetische Expression in M1 und S1, die der Verteilung entspricht, die durch epifluoreszierende Bildgebung angezeigt wird. Diese Technik ermöglicht es uns, innerhalb eines kürzeren Zeitraums mit minimalen Schäden im Vergleich zu den herkömmlichen Techniken Expression über große Bereiche des Kortex zu erhalten und kann ein optimaler Ansatz für die optogenetische Virusabgabe bei großen Tieren wie NHPs sein. Dieser Ansatz zeigt ein großes Potenzial für die Manipulation neuronaler Schaltkreise auf Netzwerkebene mit Zelltyp-Spezifität in Tiermodellen, die evolutionär nah am Menschen sind.

Einleitung

Optogenetik ist ein leistungsfähiges Werkzeug, das die Manipulation der neuronalen Aktivität und die Untersuchung von Netzwerkverbindungen im Gehirn ermöglicht. Die Implementierung dieser Technik bei nicht-menschlichen Primaten (NHPs) hat das Potenzial, unser Verständnis von groß angelegter neuronaler Berechnung, Kognition und Verhalten im Primatengehirn zu verbessern. Obwohl die Optogenetik in den letzten Jahren erfolgreich in NHPs implementiert wurde1,2,3,4,5,6,eine Herausforderung, die Forscher gesicht endiebe hohe Ausdrucksniveaus über große Hirnbereiche bei diesen Tieren. Hier bieten wir einen effizienten und vereinfachten Ansatz, um ein hohes Maß an optogenetischer Expression über große Bereiche des Kortex in Makaken zu erreichen. Diese Technik hat großes Potenzial, aktuelle optogenetische Studien an diesen Tieren inKombination mit modernsten Aufnahmen 8,9 und optischestimulation10 Technologien zu verbessern.

Konvektionsverstärkte Abgabe (CED) ist eine etablierte Methode der Lieferung von pharmakologischen Wirkstoffen und anderen großen Molekülen, einschließlich viraler Vektoren, an das zentrale Nervensystem11,12,13. Während herkömmliche Verabreichungsmethoden mehrere Infusionen mit geringem Volumen beinhalten, die über kleine Regionen des Gehirns verteilt sind, kann CED eine breitere und gleichmäßigere Agentenverteilung mit weniger Infusionen erreichen. Druckgetriebene Massenflüssigkeitsströme (Konvektion) während der Infusion ermöglichen eine breitere und gleichmäßig verteilte Transduktion des Zielgewebes bei der Bereitstellung viraler Vektoren mit CED. In neueren Studien haben wir die Transduktion und anschließende optogenetische Expression großer Bereiche der Primärmotor (M1) und somatosensorischen (S1) Kortika9 und Thalamus14 mit Magnetresonanz (MR)-geführtem CED nachgewiesen.

Hier skizzieren wir die Verwendung von CED, um eine optogenetische Expression über große kortikale Bereiche mit nur wenigen kortikalen Injektionen zu erreichen.

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Protokoll

Alle Verfahren wurden von der University of California, San Francisco Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) genehmigt und entsprechen dem Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Labortieren. Das folgende Verfahren wurde mit zwei erwachsenen männlichen Rhesusmakaken im Alter von 8 und 7 Jahren mit einem Gewicht von 17,5 kg bzw. 16,5 kg (Affe G und Affe J) durchgeführt.

HINWEIS: Verwenden Sie standardmäßige aseptische Techniken für alle chirurgischen Eingriffe.

1. Baseline Imaging

  1. Sedate und intubieren das Tier und halten Vollnarkose unter Isofluran (Konzentration zwischen 0 und 5% je nach Bedarf geändert, abhängig von Vitalsymptomen wie Atemfrequenz und Herzfrequenz). Überwachen Sie die Temperatur, Herzfrequenz, Sauerstoffsättigung, elektrokardiographische Reaktionen und den Endgezeiten-Teildruck von CO2 während des gesamten Verfahrens.
  2. Legen Sie das Tier in einen MR-kompatiblen stereotaxic-Rahmen (siehe Materialtabelle), in dem es während des gesamten Verfahrens verbleibt. Schließen Sie das Tier an eine tragbare MR-kompatible Isofluran-Maschine an und transportieren Sie es zum MRT-Scanner (3 T).
  3. Erfassen Sie Standard T1 (Flip-Winkel = 9°, Wiederholungszeit/Echozeit = 668,6, Matrixgröße = 192 x 192 x 80 , Scheibendicke = 1 mm) und T2 (Flip-Winkel = 130°, Wiederholungszeit/Echozeit = 52,5, Matrixgröße = 256 x 256 x 45, Scheibendicke = 1 mm) anatomische MR-Bilder als Ausgangslage Referenz und für die chirurgische Planung.
  4. Das Tier aus der Anästhesie bergen und in die Tierhaltung transportieren.
  5. Verwenden Sie die erfassten T1- und T2-Bilder, um die Platzierung der Kraniotomie zu bestimmen. Die Lage der Kraniotomie kann genau bestimmt werden, indem der kortikale Interessenbereich von MR mit dem Makaken-Gehirnatlas (Paxinos, Huang, Petride, Toga 2nd Edition) abgerechnet wird. Darüber hinaus können diese Basisbilder eine Schätzung für die Standorte der virusviralen Infusion liefern. Die hier gezeigten kortikalen Regionen sind M1 und S1.

2. MR-kompatible Kammerimplantation

  1. Sedate und intubieren sie das Tier und pflegen Sie die Vollnarkose mit Standardanästhesieüberwachung wie in 1.1.
  2. Legen Sie das Tier in den MR-kompatiblen stereotaxic-Rahmen, in dem es während der gesamten Kammerimplantation und viralen Vektorabgabe verbleibt. Verbinden Sie das Tier mit einer tragbaren MR-kompatiblen Isofluran-Maschine.
  3. Erstellen Sie einen sagittalen Schnitt ca. 2 cm von der Mittellinie mit einer Länge von ca. 5 cm mit einem Skalpell.
  4. Entfernen Sie das darunter liegende Weichgewebe mit Aufzügen aus dem Schädel (siehe Tabelle der Materialien).
  5. Erstellen Sie eine kreisförmige Kraniotomie (2,5 cm Durchmesser), um die vorgeplanten Injektionsbahnen mit einem Trephin abzudecken (siehe Tabelle der Materialien).
    1. Senken Sie den Mittelpunkt des Trephins am Rand des Trephins vorbei. Erstellen Sie einen Einzug in der Mitte der geplanten Kraniotomie ausreichend tief im Schädel, um das Trephin mit dem einstellbaren Mittelpunkt des Trephins zu verankern. Seien Sie vorsichtig, um ein vollständiges Eindringen durch die Schädeltiefe zu vermeiden, da dies Schäden am darunterliegenden Neuronalgewebe verursachen könnte.
    2. Spülen Sie den Bereich regelmäßig mit Saline, je nach Bedarf, um die Gewebefeuchtigkeit während der gesamten Kraniotomie zu erhalten.
    3. Sobald die Mitte gemacht ist, senken Sie das Trephin auf den Schädel und drehen Sie das Trephin im Uhrzeigersinn und gegen den Uhrzeigersinn, während Sie Abwärtsdruck ausüben, bis die Knochenkappe mit Zangen entfernt werden kann. Seien Sie vorsichtig, um eine Beschädigung des darunter liegenden Gewebes mit dem Trephin zu vermeiden.
  6. Fädeleine eine feine Naht (Größe 6-0) durch die Dura in der Mitte der Kraniotomie und heben Sie die Dura, indem Sie sanft die Naht von der Oberfläche des Gehirns ziehen und ein Zelt in der Mitte der Kraniotomie bilden.
  7. Als nächstes punktieren Sie die Dura in der Nähe der Mitte des Zeltes mit feiner ophthalmologischer Schere, um zu vermeiden, dass das Gehirn beschädigt wird. Dann schneiden Sie die Dura von der Mitte bis zum Rand der Kraniotomie und weiter entlang der Kante mit feinen opthalmischen Schere.
  8. Montieren Sie die zylindrische, maßgeschneiderte CED MR-kompatible Kammer (Abbildung1; siehe Abschnitt 4 für Produktionsanleitungen) an den Schädel auf der Oberseite der Kraniotomie, um kanülaelle Unterstützung während der CED-Infusion zu bieten, so dass die Krümmung des Kammerflansches sich ausrichtet gut mit der Krümmung des Schädels.
  9. Befestigen Sie die Implantate am Schädel entweder mit Kunststoffschrauben und Dental-Acryl oder ein paar Titanschrauben.

3. Virale Vektor-Lieferung

  1. Kurz nach der Implantation der MR-kompatiblen Kammer und dem Einsetzen des Kanüleninjektionsgitters (Abbildung 1A-B, Zusatzabbildung 1) in die Kammer füllen Sie das Gitter mit Kochsaline (0,9% NaCl) zur Visualisierung der Injektionsstellen über MR-anatomische Bilder und Füllen Sie die Kammerhohlräume mit nasssteriler resorbierbarer Gelatine, um die Feuchtigkeit des Gehirns aufrechtzuerhalten (Abbildung 1F).
  2. Bedecken Sie die Haut und den Zylinder mit einem sterilen antimikrobiellen Schneidvorschnitt, um die Sterilität der Zylinder während des Transports und MR-Infusionen aufrechtzuerhalten. Legen Sie eine Vitamin-E-Kapsel, um die Oberseite des Injektionsgitters für eine positive Identifizierung zu markieren.
  3. Während das Tier intubiert bleibt, lösen Sie das Endotrachealrohr aus dem Anästhesiekreislauf und befestigen Sie es wieder an einer tragbaren MR-kompatiblen Isofluranmaschine und transportieren Sie das Tier zum MRT-Scanner.
  4. Erfassen Sie T1-Bilder (Flip-Winkel = 9°, Wiederholungszeit/Echozeit = 668,6, Matrixgröße = 192 x 192, Scheibendicke = 1 mm, 80 Scheiben), um den Abstand vom oberen Rand des Injektionsrasters und der kortikalen Oberfläche zu berechnen. Die Vitamin-E-Kapsel ist in T1-Bildern deutlich sichtbar und sollte als Marker für die Oberseite des Injektionsgitters verwendet werden (Abbildung 2A). Verwenden Sie das Linealwerkzeug der MR-Bildgebungssoftware, um den Abstand zwischen der Oberseite des Injektionsrasters und der kortikalen Oberfläche zu messen.
  5. Erfassen Sie T2-Bilder (Flip-Winkel = 130°, Wiederholungszeit/Echozeit = 52,5, Matrixgröße = 256 x 256, Scheibendicke = 1 mm, 45 Scheiben), um die optimalen Kanülenführungen für jeden Standort basierend auf dem Zielort der Infusion zu bestimmen (Abbildung 2B-C). Wie bereits erwähnt, ist das Kanülengitter mit Einer Saline gefüllt, die in T2-Bildern am besten sichtbar ist. Mit der MR-Bildgebungssoftware scrollen Sie durch die koronalen und sagittalen Ebenen, um den Zielort der Infusion zu finden.
  6. Nachdem Sie den viralen Vektor für einige Stunden bei Raumtemperatur auftauen, mischen Sie den viralen Vektor mit dem MR-Kontrastmittel Gadoteridol (Verhältnis 250:1; 2mM Gd-DTPA, siehe Materialtabelle) durch Pipette oder Wirbelmischung.
    HINWEIS: Die vorgestellte Technik wurde auf AAV-Vektoren mit einem CamKIIa-Promotor getestet, der die Expression von C1V1 mit EYFP verschmolzen (AAV2.5-CamKII-C1V1-EYFP, Titer: 2,5 x 1012 Virusmoleküle/ml; siehe Tabelle der Materialien).
  7. Laden Sie das gemischte Virus in einen 0,2 ml Hochdruck-IV-Schlauch (siehe Materialtabelle).
  8. Richten Sie ein steriles Feld außerhalb des MR-Scanners ein, um die virale Infusionslinie vorzubereiten.
  9. Mit Hochdruck-IV-Schläuchen eine lange Verlängerungsleitung (ca. 3-5 Meter, je nach Standort der Infusionspumpe in Bezug auf die MR-Bohrung) an eine MR-kompatible 3 ml Spritze anschließen und mit Kochsaline grundieren.
  10. Schließen Sie das distale Ende der langen Verlängerungslinie an das proximale Ende des mit dem Virus beladenen 0,2 ml IV-Schlauches an und befestigen Sie die refluxresistente Kanüle mit einer 1 mm gestuften Spitze (Abbildung 2D; siehe Abschnitt 5 für Kanülenproduktionsanweisungen) an das distale Ende diese Baugruppe mit einem Klemmen-Katheterstecker (siehe Materialtabelle) (Abbildung 2E).
  11. Stellen Sie schließlich die Spritze in eine MR-kompatible Pumpe (siehe Materialtabelle). Stellen Sie den Pumpenregler in den Scanner-Kontrollraum, da er nicht MR-kompatibel ist.
  12. Wählen Sie anhand der zuvor erhaltenen anatomischen MR-Basisbilder die Position des Kanüleninjektionsgitters und die Einfügetiefe aus, die erforderlich sind, um die Zielinfusionsstelle zu erreichen. Markieren Sie die Einfügetiefe auf der Kanüle mit sterilem Klebeband.
  13. Beginnen Sie die Infusion mit einer Rate von 1 l/min und validieren Sie den Fluss der Flüssigkeit in der Infusionslinie visuell, indem Sie den Auswurf von Flüssigkeit aus der Kanülenspitze beobachten.
  14. Legen Sie die Kanüle manuell durch das Injektionsgitter in die Zieltiefe ein und halten Sie gleichzeitig den Durchfluss in der Infusionslinie aufrecht, da dadurch verhindert wird, dass das eingedrungene Gewebe die Kanüle während des Einsetzens verstopft.
  15. Erfassen Sie schnelle (2 Minuten) Blitz T1 gewichtete Bilder (Flip-Winkel = 30°, Wiederholungszeit / Echozeit = 3,05, Matrixgröße = 128 x 128, Scheibendicke = 1 mm, 64 Scheiben) für die Online-Überwachung der viralen Vektorinfusion.
  16. Nach der Infundierung von 10 L des Vektors, so dass genügend Viren in den MR-Scanner infundiert werden, erhalten Sie MR-Bilder, um die korrekte Kanülenplatzierung zu überprüfen, wie dies durch die beobachtete Ausbreitung des Virus offensichtlich ist. Wenn die Tiefe der eingelegten Kanüle falsch ist, passen Sie die Tiefe entsprechend an oder entfernen Sie langsam die Kanüle und versuchen Sie es erneut, wie in 3.12.
  17. Überwachen Sie die Infusion durch Anleitung von Online-MR-Bildern (Flash T1 gewichtet) und erhöhen Sie die Infusionsrate alle paar Minuten um 1 L/min Schritte auf 5 l/min Schritte (Abbildung 3A).
  18. Nachdem Sie ca. 40 l des viralen Vektors infundiert haben, beginnen Sie, die Infusionsrate um 1 L/min-Schritte zu reduzieren, und stoppen Sie die Infusion, nachdem 50 l injiziert wurden, und lassen Sie die Kanüle für 10 Minuten an Ort und Stelle.
  19. Entfernen Sie langsam die Kanüle aus dem Gehirn und bewegen Sie sich zum nächsten Ort. Wiederholen Sie die Schritte 3.9 bis 3.19 für jeden Standort.
  20. Bedecken Sie den Zylinder mit einem sterilen Vorhang am Ende der Injektionen, bevor tierische Transport. Dann transportieren Sie das Tier zurück in den Operationssaal.
  21. Entweder die MR-kompatible Kammer auspflanzen und den chirurgischen Schnitt schließen, indem sie die Knochenklappe und den darüber liegenden Muskel ersetzen und die Haut mit standardaseptischen Techniken nähen, oder ersetzen Sie die Kammer durch einen Titanzylinder und künstliche Dura (siehe Yazdan-Shahmorad et al. 20169) für neuronale Aufnahme und Stimulation.

4. MR-kompatible Kammerproduktion

  1. Herstellung des Nylonkanülen-Injektionsgitters (Abbildung 1A-B) durch Bearbeitung nach den angegebenen Abmessungen (Zusatzabbildung 1).
  2. 3D drucken Sie den MR-kompatiblen Zylinder aus Acrylnitril Butadien-Styrol (ABS0-Kunststoff (Abbildung 1C-E) (siehe Zusatzdatei 1-3; siehe Materialtabelle für 3D-Drucker und Materialien).
    HINWEIS: Ein Entwurf unterhält ein festes Kanüleneinspritzgitter innerhalb des MR-kompatiblen Zylinders (Abbildung 1C), während ein anderes die Rotation des Rasters ermöglicht und den Einspritzbereich erweitert (Abbildung 1D-E).
  3. Gewinden Sie das Kanülen-Injektionsgitter und tippen Sie auf den entsprechenden Hohlraum der MR-kompatiblen Kammer, so dass beide Teile den gleichen Einfädeln aufweisen.
    HINWEIS: Jede Art von Gewindekannen kann verwendet werden, sofern beide Komponenten das gleiche Gewinde haben.
  4. Setzen Sie das Nylonkanüle-Injektionsgitter ein, indem Sie in das Gewindeloch des MR-kompatiblen Zylinders einschrauben.

5. Reflux-resistente Kanülenproduktion13

  1. Schneiden Sie einen 30 cm langen Kieselsäureschlauch mit 0,32 mm ID und 0,43 mm OD für den inneren Kieselsäureschlauch (siehe Materialtabelle) mit einer Rasierklinge.
  2. Schneiden Sie einen 7,5 cm langen und einen 5 cm langen Kieselsäureschlauch mit 0,45 mm ID und 0,76 mm OD für den äußeren Kieselsäureschlauch (siehe Materialtabelle).
  3. Halten Sie die 7,5 cm außenschläuche an den 30 cm innenschläuchemit Cyanoacrylat so fest, dass sich das Innenrohr 1 mm über das Außenrohr hinaus erstreckt, wodurch der refluxresistente Schritt (Abbildung 2D) wird. Um sicherzustellen, dass das Cyanoacrylat nicht in das Innere der Innenschläuche gelangt, legen Sie das Cyanoacrylat auf die Außenseite der Innenschläuche weit von der Kanülenspitze.
  4. Fügen Sie den 5 cm langen Kieselsäureschlauch an das andere Ende des Innenschlauchs ein, um ihn am Klemmen-Katheteranschluss zu befestigen (siehe Schritt 3.10).

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Ergebnisse

Convection Enhanced Delivery (CED) unter MRT-Leitfaden

Die Ausbreitung des viralen Vektors wurde während der CED-Infusion unter Anleitung von Online-MR-Bildern überwacht (Abbildung 3A). In dieser Studie wurden S1 und M1 von zwei Affen ins Visier genommen (Abbildung 3B). Die dreidimensionalen Verteilungsvolumina wurden in einer Post-hoc-Analyse der MR-Bi...

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Diskussion

Hier skizzieren wir eine praktikable und effiziente Technik zur Erzielung einer großflächigen optogenetischen Expression in NHP primärssomatosensorischer und motorischer Kortex durch MR-geführte CED. Die Verwendung von MR-geführtem CED bietet erhebliche Vorteile gegenüber herkömmlichen Methoden der viralen Infusion im NHP-Gehirn. Ein solcher Vorteil ist die Fähigkeit, Expression über große Gebiete mit weniger erforderlichen Infusionen zu erreichen. Zum Beispiel, mit herkömmlichen Methoden, Mehrfachinjektionen von 1-2 l d...

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Offenlegungen

PNS hat finanzielles Interesse an Neuralink Corp., einem Unternehmen, das klinische Therapien mit Hilfe von Hirnstimulation entwickelt.

Danksagungen

Diese Arbeit wurde von American Heart Association Postdoctoral fellowship (AY), Defense Advanced Research Projects Agency (DARPA) Reorganization and Plasticity to Accelerate Injury Recovery (REPAIR; N66001-10-C-2010), R01. NS073940 und vom UCSF Neuroscience Imaging Center. Diese Arbeit wurde auch vom Eunice Kennedy Shiver National Institute of Child Health & Human Development der National Institutes of Health unter der Award-Nummer K12HD073945, dem Washington National Primate Research Center (WaNPCR, P51 OD010425) und das Center for Neurotechnology (CNT, ein Forschungszentrum der National Science Foundation Engineering Research Center unter Grant EEC-1028725). Wir danken Camilo Diaz-Botia, Tim Hanson, Viktor Kharazia, Daniel Silversmith, Karen J. MacLeod, Juliana Milani und Blakely Andrews für ihre Hilfe bei den Experimenten und Nan Tian, Jiwei He, Peter Ledochowitsch, Michel Maharbiz und Toni Haun für die technische Hilfe.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
0,2 mL Hochdruck-InfusionsschläucheSmiths Medical Inc., Dublin, OH, USA533640
0,32 mm Innendurchmesser, 0,43 mm Außendurchmesser QuarzglasschläuchePolymicro Technologies1068150027
0,45 mm Innendurchmesser, 0,76 mm Außendurchmesser QuarzglasschläuchePolymicro Technologies1068150625
AAV2,5-CamKII-C1V1-EYFPPenn Vector Core, Universität von Pennsylvania
ABS KunststoffStratasys, MN, USAABSplus-P430
Antimikrobielles Inzisionstuch3M6650EZIoban Drape
Dental AcrylHenry Schein, Inc.1013117Acryl-Haftvermittler
AufzügeVWR International, LLC.10196-564Langenbeck Elevator, breite Spitze
Feine NahtMcKesson Medical-Surgical Inc.
GadoteridolProhance, Bracco Diagnostics, Princeton, NJ0270-1111-04
Laser zur LichtstimulationOmicron-Laserage, DeutschlandPhoxX 488-60
MR kompatible 3 cc SpritzeHarvard Gerät, Holliston, MA, USA59-8377
MR Imaging SoftwarePixmeoOsiriX MD 10.0
MR-kompatibel PumpeHarvard apparat, Holliston, MA, USAHarvard PHD 2000
MR-kompatibler stereotaktischer RahmenKOPF1430M MRT
Perifix Clamp Style KatheteranschlussB-Braun, Bethlehem, PA, USAN/A
Kunststoffschrauben10-80 x 1/8NNylonschrauben
TitanschraubenCrist Instrument Co., Inc.6-YCX-0312Selbstschneidende Knochenschrauben
TrephineGerMedUSA Inc,SKU:GV70-42
uPrinter SE 3D-DruckerStratasys, MN, USAN/A
Vitamin E KapselPure Encapsulations, LLC.DE1
Nass sterile resorbierbare GelatinePfizer Inc.AZL0009034201Gelschaum
1034505 Kunststoff

Referenzen

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