Wichtige Endpunkte und proliferative Marker zur Beurteilung von kleinen Darmverletzungen und Anpassung mit einem Mausmodell der Chemotherapie-induzierten Mukositis

Summary

Hier stellen wir ein Protokoll zur Festlegung wichtiger Endpunkte und proliferativer Marker für kleine Darmverletzungen und kompensatorische Hyperproliferation unter Verwendung eines Modells der chemotherapieinduzierten Schleimhautitis vor. Wir demonstrieren die Detektion von sich vermehrenden Zellen mit einem zellzyklusspezifischen Marker und mit kleinem Darmgewicht, Kryptatiefe und Villushöhe als Endpunkte.

Abstract

Darmanpassung ist der natürliche Kompensationsmechanismus, der auftritt, wenn der Darm durch ein Trauma verloren geht. Die adaptiven Reaktionen, wie die Proliferation von Kryptazellen und die erhöhte Nährstoffaufnahme, sind entscheidend für die Erholung, aber schlecht verstanden. Das Verständnis des molekularen Mechanismus hinter den adaptiven Reaktionen ist von entscheidender Bedeutung, um die Identifizierung von Nährstoffen oder Medikamenten zu erleichtern, um die Anpassung zu verbessern. Verschiedene Ansätze und Modelle wurden in der gesamten Literatur beschrieben, aber eine detaillierte beschreibende Möglichkeit, die Verfahren im Wesentlichen durchzuführen, ist erforderlich, um reproduzierbare Daten zu erhalten. Hier beschreiben wir eine Methode zur Schätzung wichtiger Endpunkte und proliferativer Marker kleiner Darmverletzungen und kompensatorischer Hyperproliferation mit einem Modell der Chemotherapie-induzierten Schleimhautise bei Mäusen. Wir demonstrieren die Detektion von sich vermehrenden Zellen mit einem zellzyklusspezifischen Marker sowie mit kleinem Darmgewicht, Kryptatiefe und Villushöhe als Endpunkt. Einige der kritischen Schritte innerhalb der beschriebenen Methode sind die Entfernung und Das Wiegen des Dünndarms und das recht komplexe Softwaresystem, das für die Messung dieser Technik vorgeschlagen wird. Diese Methoden haben die Vorteile, dass sie nicht zeitaufwändig sind, und dass sie kostengünstig und einfach durchzuführen und zu messen sind.

Introduction

Darmanpassung ist der natürliche Kompensationsmechanismus, der auftritt, wenn der Darm aufgrund von Krankheit oder Operation verloren geht^1,2. Nach einem Trauma erfährt der Darm eine morphometrische und funktionelle adaptive Reaktion, die durch Dieproliferation von Kryptazellen und erhöhte Nährstoffaufnahme gekennzeichnet ist³. Dieser Schritt ist entscheidend für die Wiederherstellung, aber schlecht verstanden. Experimentelle Studien der darmadaptiven Reaktion konzentrierten sich auf die Veränderungen, die nach der kleinen Darmresektion bei Mäusen, Ratten und Schweinen auftreten, aber d....

Protocol

Alle beschriebenen Methoden wurden in Übereinstimmung mit den Leitlinien der dänischen Rechtsvorschriften über Tierversuche (1987) durchgeführt. Die Studien wurden mit Genehmigung der dänischen Tierversuchsinspektion (2013-15-2934-00833) und der lokalen Ethikkommission durchgeführt.

HINWEIS: Weibliche C57BL/6J-Mäuse (ca. 20 bis 25 g) wurden erhalten und untergebracht acht pro Käfig in Standard 12 h Licht, 12 h dunklen Zyklus mit freiem Zugang zu Wasser und Standard-Chow. Die Tiere mussten sich eine Woche lang akklimatisieren, bevor die Experimente begannen.

1. Induktion von Mukositis mit 5-Fluorouracil

1. ....

Results

Im ersten Experiment induzierten wir an Tag 0 eine Schleimhautise bei Mäusen und opferten jeden Tag fünf aufeinanderfolgende Tage lang eine Gruppe von Mäusen. Bei der Messung des SI-Gewichts stellten wir fest, dass dieser Parameter von Tag 2 bis Tag 4 abnahm, was auf einen Verlust der Enterozytenmasse hindeutet. Wir stellten außerdem fest, dass sich das SI-Gewicht an Tag 5 nicht wesentlich von Tag 0 (unbehandelte Mäuse) unterscheidet (Abbildung 1). Die durch .......

Discussion

Hier zeigen wir eine allgemein zugängliche Methode zur Untersuchung von SI-Verletzungen und Regeneration in einem Mausmodell. Es gibt eine Vielzahl präklinischer Tiermodelle für Darmverletzungen, aber es ist wichtig, dass wir verstehen, dass jedes Modell einzigartig ist und dass die Endpunkte geeignet sein müssen, um die Forschungsfrage zu beantworten. Dieses Modell eignet sich hervorragend, um das adaptive Ansprechen auf Verletzungen zu untersuchen, aber die Endpunkte sollten geändert werden, wenn das Modell als präklin.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
5-Fluorouracil	Hospira Nordic AB, Schweden	137853
Ketaminol® Tierarzt	Merck, New Jersey, USA	511485
Rompun® Tierarzt Xylazin	Rompunvet, Bayer, Leverkusen, Deutschland.
10% nautraler Formalinpuffer	Cell Path Ltd, Powys, Vereinigtes Königreich	BAF-5000-08A
HistoClear	National Diagnostics, Vereinigtes Königreich	HS-200
Pertex	HistoLab®, Schweden	840
BrdU	Sigma-Aldrich, Deutschland.	B5002
Tris/EDTA pH 9 Puffer	Thermofisher Scientific, Dänemark	TA-125-PM4X
Peroxid-Block	Ultravision Quanto Maus auf Maus Kit, Thermofisher Scientific, Dänemark	TL-060-QHDM
Nagetier Block Puffer	Ultravision Quanto Maus auf Maus Kit, Thermofisher Scientific, Dänemark	TL-060-QHDM
Monoklonaler Maus Anti-BrdU Antikörper	Thermofisher Scientific, Dänemark.	MA1-81890
Lab Vision Antikörper-Verdünnungsmittel OP Quanto	Thermofisher Scientific, Dänemark.	TA-125-ADQ
Meerrettichperoxidase	Ultravision Quanto Maus auf Maus Kit, Thermofisher Scientific, Dänemark	TL-060-QHDM
DAB Quanto Substrat	DAB Substrat Kit, Thermofisher Scientific, Dänemark	TA-125-QHDX
DAB Quanto Chromogen	DAB Substrat Kit, Thermofisher Scientific, Dänemark	TA-125-QHDX
Zen Lite Software (Blaue Ausgabe)	Carl Zeiss A/S		https://www.zeiss.com/microscopy/int/products/microscope-software/zen-lite.html
ImageJ Software	LOCI, Universität von Wisconsin		https://imagej.nih.gov/ij/