Intraventrikuläre Transplantation von engineered Neuronal Precursors for In Vivo Neuroarchitecture Studies

Simone Chiola; Manuela Santo; Antonello Mallamaci

doi:10.3791/59242

Methodenartikel

Intraventrikuläre Transplantation von engineered Neuronal Precursors for In Vivo Neuroarchitecture Studies

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DOI:

10.3791/59242

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11. Mai 2019

Simone Chiola¹ , Manuela Santo¹ , Antonello Mallamaci¹

¹Laboratory of Cerebral Cortex Development, SISSA

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Basierend auf der in vitro lentiviralen Entwicklung neuronaler Vorläufer, ihrer Co-Transplantation in Wilde-Gehirne und der gepaarten morphometrischen Auswertung von "Test"- und "Kontrollderivaten" ermöglicht diese Methode eine genaue Modellierung der In-vivo-Genkontrolle neokortikaler Neuronenmorphologie auf einfache und erschwingliche Weise.

Zusammenfassung

Die Genkontrolle der neuronalen Zytoarchitektur wird derzeit intensiv untersucht. Hier wird eine einfache Methode beschrieben, die entwickelt wurde, um die in vivo Genkontrolle der neokortikalen Projektionsneuronenmorphologie zu untersuchen. Diese Methode basiert auf (1) in vitro lentiviralen Engineering sernischen Vorläufern als "Test"- und "Kontrollzellen", (2) ihrer Co-Transplantation in Wild-Gehirne und (3) gepaarter morphometrischer Auswertung ihrer neuronalen Derivate. Konkret werden dafür E12.5 palliale Vorläufer von panneuronalen, genetisch gekennzeichneten Spendern eingesetzt. Sie sind so konzipiert, dass sie ausgewählte Promotoren und tetON/OFF-Technologie nutzen, und sie werden freihändig in neonatale Querventrikel transplantiert. Später, nach der Immunfluoreszenzprofilierung von Empfängergehirnen, werden Silhouetten transplantierter Neuronen in NeurphologyJ Open Source Software eingespeist, ihre morphometrischen Parameter extrahiert und die durchschnittliche Länge und der Verzweigungsindex berechnet. Im Vergleich zu anderen Methoden bietet diese drei Hauptvorteile: Sie ermöglicht die Erzielung einer feinen Kontrolle der Transgenexpression zu erschwinglichen Kosten, sie erfordert nur grundlegende chirurgische Fähigkeiten und liefert statistisch zuverlässige Ergebnisse bei der Analyse einer begrenzten Anzahl der Tiere. Aufgrund seines Designs reicht es jedoch nicht aus, die nicht zellautonome Kontrolle der Neuroarchitektur zu adressieren. Darüber hinaus sollte es vorzugsweise verwendet werden, um die Kontrolle der Neuritenmorphologie nach Abschluss der neuronalen Migration zu untersuchen. In ihrer gegenwärtigen Formulierung ist diese Methode exquisit abgestimmt, um die Genkontrolle der glutamatergen neokortikalen Neuronenarchitektur zu untersuchen. Unter Ausnutzung transgener Linien, die EGFP in anderen spezifischen neuronalen Zelltypen exemiten, kann es umfunktioniert werden, um die Genkontrolle ihrer Architektur zu adressieren.

Einleitung

Hier beschreiben wir eine einfache Methode, die wir entwickelt haben, um die in vivo Genkontrolle der neuronalen Zytoarchitektur zu sezieren. Basierend auf in vitro Engineering von neuronalen Vorläufern, ihre Transplantation in neonatale Gehirn und gepaart morphometrische Bewertung von "Test" und "Kontroll" Zellen, ermöglicht es, funktionelle Auswirkungen von Testgenen in der feinen Kontrolle der neuronalen Morphologie in einem schnell und erschwinglich. Um die In-vivo-Genkontrolle der neuronalen Architektur zu untersuchen, müssen drei wichtige technische Fragen angegangen werden: (1) Die Erreichung einer angemessen gemusterten Gen-of-Interest-Expression (GOI) und ein....