Beeinträchtigung der Endothelzellen und glialen Barrieren des Referats neurovaskuläre während experimentelle Autoimmune Enzephalomyelitis In Vivo Visualisierung

Zusammenfassung

Hier präsentieren wir Ihnen Protokolle, um die Beeinträchtigung der neurovaskuläre Einheit während experimentelle autoimmune Enzephalomyelitis in vivo zu untersuchen. Wir gezielt auf Durchlässigkeit der Blut - Hirn-Schranke und Gelatinase Tätigkeit in Leukozyte Migration über die Glia Limitans ermitteln.

Zusammenfassung

Die neurovaskuläre Einheit (NVU) besteht aus mikrovaskuläre Endothelzellen bilden die Blut - Hirn-Schranke (BBB), einer endothelialen Basalmembran mit eingebetteten Perizyten und die Glia Limitans komponiert von parenchymatösen Basalmembran und astrocytic Ende-Feed den abluminalen Aspekt des zentralen Nervensystems (ZNS) Mikrogefäßen umarmen. Neben der Aufrechterhaltung CNS steuert Homöostase der NVU Immunzelle Menschenhandel in das ZNS. Während der Tumorüberwachung des ZNS können niedrige Anzahl von aktivierten Lymphozyten die endotheliale Barriere überqueren, ohne BBB Dysfunktion oder klinische Krankheit zu verursachen. Im Gegensatz dazu kann bei Neuroinflammation wie z. B. Multiple Sklerose oder seine Tiermodell experimentelle autoimmune Enzephalomyelitis (EAE) eine große Anzahl von Immunzellen die BBB und anschließend die Glia Limitans erreicht schließlich die CNS Parenchym durchqueren zum klinischen Erkrankung. Immunzelle Migration in das CNS-Parenchym ist somit ein zweistufiger Prozess, der eine sequentielle Migration über die Endothelzellen und glialen Barriere der NVU beschäftigt verschiedene molekulare Mechanismen beinhaltet. Wenn ihre Passage über die endotheliale Barriere, T-Zellen begegnen ihr cognate Antigen auf perivaskuläre Antigen-präsentierenden Zellen ihre lokale Reaktivierung löst weitere Mechanismen, die die fokale Aktivierung des Gelatinases, die die T-Zellen, die Glia-Schranke, und geben die CNS Parenchym ermöglicht. So erlaubt die Bewertung BBB Permeabilität sowohl MMP-Aktivität in räumliche Korrelation zu Immunzelle Akkumulation im ZNS bei EAE Verlust der Integrität der Endothelzellen und glialen Barrieren der NVU angeben. Wir zeigen hier wie induzieren EAE bei C57BL/6 Mäusen durch aktive Immunisierung und anschließend BBB Permeabilität in-vivo mit einer Kombination von exogenen Fluoreszenz Tracer analysieren. Weiter zeigen wir, wie zu visualisieren und Gelatinase Aktivität in EAE Gehirnen von in-situ Zymogaphy gekoppelt an immunofluorescent Färbungen von BBB Keller Membranen und CD45 + eindringenden Immunzellen zu lokalisieren.

Einleitung

Das zentrale Nervensystem (ZNS) koordiniert alle Körper und geistige Funktionen bei Wirbeltieren und CNS Homöostase ist essentiell für eine ordnungsgemäße Kommunikation von Nervenzellen. CNS-Homöostase ist gerechtfertigt durch die neurovaskuläre Einheit (NVU), schützt das ZNS aus dem veränderten Milieu den Blutstrom. Die NVU besteht aus CNS mikrovaskuläre Endothelzellen, die biochemisch einzigartig und die Blut - Hirn-Schranke (BBB) in kontinuierlichen Übersprechen mit Perizyten, Astrozyten und Neuronen Komponenten der extrazellulären Matrix (ECM) zu etablieren, über zwei ausgeprägte Keller Membranen¹. Der endothelialen Basalmembran, Ensheathes....

Protokoll

Alle Studien wurden durchgeführt in den Leitlinien nach der schweizerischen Gesetzgebung über den Schutz der Tiere und durch das Veterinäramt des Kantons Bern in der Schweiz angenommen wurden (Erlaubnis Zahlen: BE 31/17 und werden 77/18).

1. Gehäuse von C57BL/6 Mäusen in spezifischen Erreger frei (SPF) Bedingungen

1. Hausmäuse in einzelnen belüftete Käfige mit einem 12/12 h hell-dunkel-Zyklus. Nahrung und Wasser Ad Libidum. Um mikrobiologische Qualität der Mäuse zu überwachen, wurde die experimentelle Kohorte vierteljährliche Systemüberwachung durch schmutzige Bettwäsche Wächter nach FELASA Empfehlungen¹³.

Ergebnisse

Bewertung der klinische Verlauf der EAE bei C57BL/6 Mäusen sollte eine Krankheit Kurve wie in Abb. 2A und Änderungen in der Maus Körpergewicht wie dargestellt in Abbildung 2 bdargestellt führen. C57BL/6 Mäusen immunisiert mit MOGaa35-55 in der Regel beginnen Krankheitssymptome rund um 10-12. Tag nach der aktiven Immunisierung (Abbildung 1A) zu entwickeln. Immunisierten Mäusen zeigen in der Regel vorübergehend sinken des Körpergewich.......

Diskussion

Hier präsentieren wir Ihnen ein Protokoll überwachen EAE in weiblichen C57BL/6 Mäusen zu induzieren. Frauen werden bevorzugt ausgewählt, und es gibt eine Inzidenz von Frauen: Männer 3:1 im MS. Zur Beurteilung der Schwere der EAE, wir haben eine 3-Punkt-Wertungsblatt nutzen. EAE Schweregrad wird in der Regel in Bezug auf den Schweregrad der motorischen Funktionsstörungen bewertet. Mäuse mit fortgeschrittenen Stadien der EAE, d.h. ausstellen eine Punktzahl über 2 geopfert werden sollte, um unnötiges Leiden der Tiere zu ver.......

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
AMCA Anti-Kaninchen-Antikörper	Jackson ImmunoResearch	111-156-045	Lagern bei 4 ° C; vor Licht schützen
Anti-CD45 Antikörper (30F11)	Pharmingen	07-1401	Bei 4 > C
Anti-Laminin Antikörper	DAKO	Z0097	Bei 4 & Grad lagern; C
Zuchtfutter	z.B. PROVIMI KLIBA SA	3336
Individuell belüftete Käfige, Blue Line Typ II oder III	z.B. Tecniplast	1145T, 1285L
BSA Fraktion V	Applichem	A1391	Bei 4 & deg lagern; C
Kaltgelatine	Sigma-Aldrich	G 9391
Coplin Glas + Gestell	z.B. Carl Roth GmbH + Co. KG	H554.1; H552.1
Cy3 Anti-Ratten-Antikörper	Jackson ImmunoResearch	111-156-144	Bei 4 ° lagern; C; Schutz vor Licht
Deckgläser 24 x 40 mm # 1	z.B. Thermo Scientific	85-0186-00
Dextran Alexa Fluor 488 (10.000 MW)	z.B. Molekulare Sonden	D22910	Lagerung bei -20 & Grad; C; vor Licht schützen
Dextran Texas Red (3000 MW)	Invitrogen	D3328	Bei -20 ° lagern C; vor Licht schützen
EnzChek Gelatinase/Kollagenase Assay Kit	Thermo Fisher Wissenschaftlich; EnzCheck	E12055	Bei -20 > lagern C; schützen vor Licht
Weibliche C57BL/6J Mäuse (8-12 Wochen)	z.B. Janvier Labs		Weibchen, 8-12 Wochen
Gefrierbox für Histologie-Objektträger	z.B. Carl Roth GmbH + Co. KG	2285.1
18G x 1½ ’ ’ (1,2 mm x 40 mm) Injektionsnadel	z.B. BD, BD Microlance 3	304622
27G x ¾ ’ ’ – Nr. 20 (0,4mm x 19mm) Injektionsnadel	z.B. BD, BD Microlance 3	302200
30G x ½ ’ ’ (0,3 mm x 13 mm) Injektionsnadel	z.B. BD, BD Microlance 3	304000
unvollständig Freund' s Adjuvans (IFA)	z.B. Santa Cruz Biotechnology	sc-24648	Store at 4° C
Erhaltungsnahrung	z.B. PROVIMI KLIBA SA	3436
MOGaa35-55 Peptid	z.B. GenScript		Store bei -80 >
C Objektträger (Superfrost Plus )	Thermo Scientific	J1800AMNZ
Mycobacterium tuberculosis H37RA	z. B. BD	231141	Lagern bei 4 > C
NaCl 0,9 %	B. Braun	3535789
O.C.T. Verbindung (Tissue-Tek )	Sakura	4583
Omnican 50 30G x ½ ’ "	B. Braun	9151125S
Paraformaldehyd	Merck	30525-89-4
Pertussis toxin	z.B. List biological laboratories, Inc.	180	Lagern bei 4 Grad; C
Poly(vinylalkohol) (Mowiol 4-88)	Sigma-Aldrich	81381
Proteasehemmer EDTA-frei (Roche)	Sigma-Aldrich	4693132001	Bei 4 > lagern; C
abweisender Stift z.B. DAKO Pen	z.B. DAKO	S2002
Siegelfolie z.B. Parafilm M	z.B. Sigma-Aldrich	P7793
Kieselgel	z.B. Carl Roth GmbH + Co. KG	9351.1
Maschenschere	F.S.T	15012-12
Spritze 1 ml	z.B. PRIMO	62.1002
Spritze 10 ml	z.B. CODAN Medical ApS	2022-05
Verdampfersystem Univentor 400	UNO. Bv