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Methodenartikel

Beeinträchtigung der Endothelzellen und glialen Barrieren des Referats neurovaskuläre während experimentelle Autoimmune Enzephalomyelitis In Vivo Visualisierung

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DOI:

10.3791/59249

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26. März 2019

 , 
1Theodor Kocher Institute, University of Bern

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Hier präsentieren wir Ihnen Protokolle, um die Beeinträchtigung der neurovaskuläre Einheit während experimentelle autoimmune Enzephalomyelitis in vivo zu untersuchen. Wir gezielt auf Durchlässigkeit der Blut - Hirn-Schranke und Gelatinase Tätigkeit in Leukozyte Migration über die Glia Limitans ermitteln.

Zusammenfassung

Die neurovaskuläre Einheit (NVU) besteht aus mikrovaskuläre Endothelzellen bilden die Blut - Hirn-Schranke (BBB), einer endothelialen Basalmembran mit eingebetteten Perizyten und die Glia Limitans komponiert von parenchymatösen Basalmembran und astrocytic Ende-Feed den abluminalen Aspekt des zentralen Nervensystems (ZNS) Mikrogefäßen umarmen. Neben der Aufrechterhaltung CNS steuert Homöostase der NVU Immunzelle Menschenhandel in das ZNS. Während der Tumorüberwachung des ZNS können niedrige Anzahl von aktivierten Lymphozyten die endotheliale Barriere überqueren, ohne BBB Dysfunktion oder klinische Krankheit zu verursachen. Im Gegensatz dazu kann bei Neuroinflammation wie z. B. Multiple Sklerose oder seine Tiermodell experimentelle autoimmune Enzephalomyelitis (EAE) eine große Anzahl von Immunzellen die BBB und anschließend die Glia Limitans erreicht schließlich die CNS Parenchym durchqueren zum klinischen Erkrankung. Immunzelle Migration in das CNS-Parenchym ist somit ein zweistufiger Prozess, der eine sequentielle Migration über die Endothelzellen und glialen Barriere der NVU beschäftigt verschiedene molekulare Mechanismen beinhaltet. Wenn ihre Passage über die endotheliale Barriere, T-Zellen begegnen ihr cognate Antigen auf perivaskuläre Antigen-präsentierenden Zellen ihre lokale Reaktivierung löst weitere Mechanismen, die die fokale Aktivierung des Gelatinases, die die T-Zellen, die Glia-Schranke, und geben die CNS Parenchym ermöglicht. So erlaubt die Bewertung BBB Permeabilität sowohl MMP-Aktivität in räumliche Korrelation zu Immunzelle Akkumulation im ZNS bei EAE Verlust der Integrität der Endothelzellen und glialen Barrieren der NVU angeben. Wir zeigen hier wie induzieren EAE bei C57BL/6 Mäusen durch aktive Immunisierung und anschließend BBB Permeabilität in-vivo mit einer Kombination von exogenen Fluoreszenz Tracer analysieren. Weiter zeigen wir, wie zu visualisieren und Gelatinase Aktivität in EAE Gehirnen von in-situ Zymogaphy gekoppelt an immunofluorescent Färbungen von BBB Keller Membranen und CD45 + eindringenden Immunzellen zu lokalisieren.

Einleitung

Das zentrale Nervensystem (ZNS) koordiniert alle Körper und geistige Funktionen bei Wirbeltieren und CNS Homöostase ist essentiell für eine ordnungsgemäße Kommunikation von Nervenzellen. CNS-Homöostase ist gerechtfertigt durch die neurovaskuläre Einheit (NVU), schützt das ZNS aus dem veränderten Milieu den Blutstrom. Die NVU besteht aus CNS mikrovaskuläre Endothelzellen, die biochemisch einzigartig und die Blut - Hirn-Schranke (BBB) in kontinuierlichen Übersprechen mit Perizyten, Astrozyten und Neuronen Komponenten der extrazellulären Matrix (ECM) zu etablieren, über zwei ausgeprägte Keller Membranen1. Der endothelialen Basalmembran, Ensheathes der abluminalen Aspekt der BBB Endothelzellen birgt eine hohe Anzahl von Perizyten und besteht aus Laminin α4 und Laminin α5, neben anderen ECM-Proteine-2. Im Gegensatz dazu der parenchymatösen Basalmembran besteht aus Laminin α1 und α2 Laminin und ist umgeben von astrocytic Ende-Füße. Die parenchymatösen Basalmembran zusammen mit den Astrozyten Ende-Füßen komponiert die Glia Limitans, die das CNS neuronale Netz aus dem Liquor cerebrospinalis gefüllt perivaskuläre oder Subarachnoidalraum Räume3segregiert. Durch die einzigartige Architektur der NVU unterscheidet sich Immunzellen in das ZNS Menschenhandel aus, dass in peripheren Geweben da es einen zweistufiger Prozess mit den Immunzellen erfordert, zuerst die endotheliale BBB und anschließend die Glia Limitans zur Verletzung Das CNS-Parenchym zu erreichen.

Multiple Sklerose (MS) ist eine häufige schwere Erkrankung des ZNS, in denen eine große Anzahl der zirkulierenden Immunzellen geben Sie die CNS und Neuroinflammation, Demyelinisierung und fokal Verlust von BBB Integrität4verursachen. Verlust der Integrität der BBB ist eine frühe Markenzeichen von MS, wie durch die Anwesenheit von Gadolinium Kontrast Verbesserung der Läsionen im ZNS als visualisierte durch Magnetresonanz-Bildgebung (MRI)5angezeigt. Leukozyte Extravasation in das ZNS tritt auf der Ebene der postcapillary Venolen; Allerdings bleiben die genauen Mechanismen beteiligt Immunzelle Diapedese der BBB Basalmembran und anschließend die glialen Barriere um erkundet zu werden. Experimentelle autoimmune Enzephalomyelitis (EAE) dient als Tiermodell für MS und hat maßgeblich zu unserem aktuellen Wissen über die Pathogenese der MS. Zum Beispiel wurde mit dem EAE-Modell entdeckt, dass Leukozyte Extravasation in einem mehrstufigen Prozess erfolgt, wie z. B. eine anfängliche Capture und Rollen Schritt durch Selectins und Mucin-ähnliche Moleküle wie z. B. P-Selektin Glykoprotein Liganden (PSGL) -1 vermittelt, gefolgt von Integrin-abhängige feste Verhaftung und kriechen von T-Zellen auf BBB Endothelzellen zu freizügigen Seiten für Diapedese6.

Wenn T-Zellen die endotheliale BBB und der endothelialen Basalmembran überquert haben, müssen sie ihre cognate Antigen auf Makrophagen oder dendritischen Zellen strategisch lokalisiert in den Leptomeningeal oder perivaskuläre Räumen begegnen. Diese Interaktion induziert Schwerpunkt Produktion von Pro-inflammatorischen Mediatoren diesen Auslöser die folgenden Mechanismen für CNS-Gewebe-Invasion von Immunzellen über die Glia Limitans7,8,9erforderlich. Fokale Aktivierung von Matrix-Metalloproteinasen (MMP) -2 und MMP-9 ändert Chemokin Aktivierung und induziert Abbau der extrazellulären Matrix Rezeptoren auf Astrozyten Ende-Füße, eine Voraussetzung für Immune Zelle Migration über die Glia Limitans in der CNS Parenchym und Beginn der klinischen Symptome von EAE10,11zu induzieren.

Kombiniert Erkennung des ZNS infiltrieren Immunzelle mit BBB liefert Leckage und Gelatinase Tätigkeit in CNS Gewebeschnitten wertvolle Informationen über die Funktionsfähigkeit der Endothelzellen und glialen Barriere im Rahmen des Neuroinflammation. Zum Beispiel haben wir vor kurzem untersucht den konstitutiven Verlust der endothelialen tight Junction Molekül Knoten Adhäsionsmolekül (JAM)-B Menschenhandel Immunzellen in das ZNS im Zusammenhang mit EAE. Im Vergleich zu gesunden Wildtyp C57BL/6 Mäusen, gesunde Marmelade-B-defizienten Wurfgeschwistern zeigte keine Beeinträchtigung der BBB Integrität über endogene als auch exogene Tracer12Durchlässigkeit in-vivo-Tests belegen. Im Rahmen der EAE JAM-B-defizienten C57BL/6 Mäusen zeigte verbesserte Krankheitssymptome, die wurde im Zusammenhang mit entzündlichen Zelle Überfüllung in den Leptomeningeal und perivaskuläre Räume12. Dieses Phänomen untersuchen wir zugewiesen in Situ Zymography zur Identifizierung von Gelatinase Aktivität um zu testen, ob mangelnde Gelatinase Aktivität in den JAM-B-defizienten Mäusen möglicherweise verantwortlich für die reduzierte Zahl der Immunzellen in der Lage zu durchbrechen die Glia Limitans12.

Angesichts der Verfügbarkeit von veränderten verschiedenen gentechnisch Maus Modelle fehlen, z. B. verschiedene BBB tight Junction-Moleküle, die Änderungen in der BBB-Funktion verursachen könnten Methoden für die Untersuchung von BBB Integrität wichtig sind. Darüber hinaus könnte neu entwickelte Medikamente auf NVU Barrieren auswirken. Hier zeigen wir wie bei C57BL/6 Mäusen durch aktive Immunisierung mit Myelin Oligodendrozyt Glykoprotein (MOG) induzieren EAE-Peptid aa35-55 in komplette Freund Adjuvantien. Wir erklären dann wie Immunzelle Infiltration über die NVU Endothelzellen und glialen Barrieren hinweg zu lokalisieren und in-vivo Endothelzellen und glialen Barriereintegrität durch in-situ Detektion von exogenen Tracer und Gelatinase Aktivität, bzw. zu studieren.

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Protokoll

Alle Studien wurden durchgeführt in den Leitlinien nach der schweizerischen Gesetzgebung über den Schutz der Tiere und durch das Veterinäramt des Kantons Bern in der Schweiz angenommen wurden (Erlaubnis Zahlen: BE 31/17 und werden 77/18).

1. Gehäuse von C57BL/6 Mäusen in spezifischen Erreger frei (SPF) Bedingungen

  1. Hausmäuse in einzelnen belüftete Käfige mit einem 12/12 h hell-dunkel-Zyklus. Nahrung und Wasser Ad Libidum. Um mikrobiologische Qualität der Mäuse zu überwachen, wurde die experimentelle Kohorte vierteljährliche Systemüberwachung durch schmutzige Bettwäsche Wächter nach FELASA Empfehlungen13.
  2. Verwendung Ohr Schläge, 8-12 Wochen alten weibliche C57BL/6 Mäusen individuell zu markieren.

2. Immunisierung von Mäusen C57BL/6

  1. Zubereitung von Lösungen14:
    1. Für komplette Freund Adjuvans (CFA), inaktiviert Mischung 30 mL unvollständig Freund-Adjuvans mit 120 mg frisch gestoßenen Hitze Mycobacterium Tuberculosis (H37RA) unter einem Abzug. Shop-Stammlösung bei 4 ° C.
    2. Für die MOGaa35-55-Peptid-Stammlösung MOGaa35-55-Peptid in sterilen PBS (4 mg/mL) auflösen und bei-80 ° c lagern
    3. Bereiten Sie die MOG-Emulsion:
      1. Verdünnen Sie CFA 1:2 mit MOG-Peptid-Stammlösung in ein 2 mL Reaktionscup.
      2. Versiegeln Sie die Reaktionscup mit dichten Film und auf einem Vortex-Mixer komplett bedeckt das Rohr mit Klebeband fixieren. Vortex-Emulsion für 4 h bei 4 ° C.
    4. Bereiten Sie Spritzen mit stabilen Emulsion:
      1. Nehmen Sie die Reaktionscup und schnell spin-down der Emulsion mit einem kleinen Tisch-Zentrifuge. Sammeln Sie Emulsion in eine Spritze mit einer Injektionsnadel 18 x 1½'' (1,2 x 40 mm).
      2. Nach der Anzahl der Mäuse die Emulsion Lautstärke in der Spritze (100 µL/Maus) und ersetzen Sie die 18 G-Nadel mit einer Injektionsnadel 27 x ¾'' (0,4 x 19 mm). Versiegeln Sie die Injektionsnadel befestigt an der Spritze mit Abdichtung Film.
    5. Für die Pertussis-Toxin (PTx)-Stammlösung auflösen 50 µg des lyophilisierten PTx in 500 µL PBS steril (100 ng/µL). Shop-Stammlösung bei 4 ° C.
    6. Mischen Sie für die Arbeitslösung PTx 97 µL steriler PBS mit 3 µL PTx-Stammlösung (300 ng/100 µL) pro Maus (für die intraperitoneale Injektion Verwendung einer 30 x ½'' (0,3 x 13 mm) Nadel).
  2. EAE Induktion
    1. C57BL/6 Mäusen mit Isofluorane mit einem Vaporizer zu betäuben. Anästhesie bei Mäusen zu induzieren, setzen Sie die Maus, um 4,5 % Isofluorane Sauerstoff in einer kleinen Inkubation Kammer bevor Sie die Maus auf eine Gesichtsmaske mit 2,1 % Isofluorane übertragen. Verwenden Sie eine Anästhesie-Einheit ausgestattet mit Heizkissen, um Unterkühlung der Maus zu verhindern.
    2. Narkotisierten Maus in der einen Hand zu beheben und 30 µL MOG35-55/CFA-Emulsion in Hinterbein Flanken zuerst subkutan injizieren (Abbildung 1:1 + 2; insgesamt 60 µL; linke Flanke 30 µL und Rechte Flanke 30 µL) in unmittelbarer Nähe zu den inguinalen Lymphknoten.
    3. Platzieren Sie den Mauszeiger auf dem Bauch und injizieren 20 µL MOGaa35-55/CFA-Emulsion in die Links und rechts weiche Fettgewebe an der Rute Wurzel (Abbildung 1:3 + 4; insgesamt 40 µL; rechts und links Schweif Wurzel 20 µL tail Wurzel 20 µL) und ein kleines Tröpfchen des MOGaa35-55/CFA-Emulsion Int o den Hals der Maus (Abbildung 1: 5).
    4. Injizieren Sie 100 µL PTx-Lösung in der Maus intraperitoneal. Halten Sie den Kopf der Maus unterhalb der Körpermitte Injektion in den Darm zu vermeiden.
    5. Wartung-Diät zu ersetzen (Extrudat Hauptnährstoffe: Rohprotein 18,5 %; Rohöl Fett 4,5 %; Rohfaser 4,5 %, Rohasche 6,5 %; Stärke 35 % metabolischer Energie: 13.1 MJ/kg), Zucht, Ernährung (Extrudat Hauptnährstoffe: Rohprotein 23,5 %, Rohöl Fett 5,5 %, Rohfaser 3 %; Rohasche 5,7 %; Stärke 36 %; metabolische Energie: 14,3 MJ/kg) um die Mäuse Essen der höheren Energiegehalt vor und während der erwarteten klinischen Erkrankung bieten.
    6. Entfernen Sie die Gesichtsmaske und übertragen Sie die Maus zu seinem Hause Käfig mit einem wärmenden Pad. Stellen Sie sicher, dass die Maus vollständig wach und bewegliche nach 10 Minuten ist.
    7. Wiederholen Sie die PTx Injektion (2.2.4) 48 h nach der ersten Behandlung.

3. Bewertung von EAE Mäusen

  1. Überprüfen Sie den Gesundheitszustand von EAE Mäusen jeden Morgen mit einem Blick in den Käfigen.
  2. Ergebnis EAE Mäusen jeden Nachmittag.
  3. Nehmen Sie jeden einzelnen Maus enthalten in der EAE-Experiment aus dem Käfig und prüfen Sie, ob das Heck Tonus hat, indem Sie ihn mit einem Finger nach oben bewegen. Eine gesunde Maus wird Schwanzspitze mithalten (die Rute hat eine Tonus). Wenn klinische EAE gestartet wurde, wird die Rute Tonus auch niedriger sein, sichtbar durch einen allmählichen Rückgang der Rute. Schließlich wird die Maus ihre Ladebordwand überhaupt nicht.
  4. Jeden einzelnen Maus in der EAE-Experiment auf der sauberen Bank aufgenommen und beobachten und dokumentieren das walking Verhalten. Siehe Tabelle 1-15 für die Bewertungskriterien für die Beurteilung der Schwere der Erkrankung (EAE-Score).
  5. Bewerten Sie und dokumentieren Sie das Gewicht jeder Maus in das Experiment einbezogen.
  6. Gewährleistung ausreichender Ernährung und Wasseraufnahme bis Mäuse Anzeige einer klinischen EAE Score von 1 liefern angefeuchteten Essen in einer Plastikschale auf den Boden des Käfigs und täglich zu aktualisieren.

4. In-vivo Durchlässigkeit assay

  1. Vorbereitung der Lösungen:
    1. Dextran Stammlösungen lösen sich auf 10 mg 10 kDa Dextran Alexa Fluor 488 sowie 3 kDa Dextran Texas Red in 500 µL 0,9 % Natriumchlorid-Lösung (20 mg/mL).
    2. Für die Dextran-Arbeitslösung nur vor Injektion Pipettieren 55 µL 10 kDa Dextran Alexa Fluor 488 auf Lager Lösung (20 mg/mL) auf ein Stück Film Abdichtung und 55 µL 3 kDa Dextran Texas Red-Stammlösung (20 mg/mL). Mischen Sie und sammeln Sie 100 µL in eine feine Einwegspritze (Endkonzentration 2 mg/100 µL).
    3. Kombinieren Sie für die 10 % Formaldehyd (PFA)-Stammlösung 10 g extra reines Pulver, 100 mL PBS und 200 µL 1N NaOH in ein sauberes Glasgefäß und Hitze bis zu genau 56 ° C unter Rühren mit einem Magnetrührer PFA; halten Sie bei 56 ° C für 30 min, bis die PFA vollständig gelöst ist; kühlen Sie lassen auf Raumtemperatur ab; pH auf 7,4 einstellen; und Filter durch einen Papierfilter. Shop bei - 20 ° C. Die Stammlösung kann weiter mit PBS verdünnt werden.
  2. Betäuben Sie kurz gesunden C57BL/6 Mäusen oder C57BL/6 Mäusen EAE mit Isofluran (die Maus wird für ca. 1 min sediert) leiden. Verwenden Sie ein automatisiertes System wie in Schritt 2.2.1 (Mäuse werden 4,5 % Isofluran in Sauerstoff in einer Induktion Kammer ausgesetzt und dann in eine Gesichtsmaske mit 2,1 % Isofluran übertragen).
  3. Platzieren Sie die narkotisierten Maus in Seitenlage auf dem Tisch, dann intravenös (z.B. Retro-Orbital) 100 µL der Fluoreszenz Tracer in der Maus zu injizieren, bevor die Maus aufwacht.
  4. Entfernen Sie die Gesichtsmaske sofort und stellen Sie sicher, dass die Maus vollständig wach und bewegliche nach der kurzen Narkose ist. Die Tracer für 15 min zirkulieren zu lassen.
  5. Fahren Sie fort mit Schritt 5.1.

(5) Perfusion von Mäusen

  1. Für in-vivo Durchlässigkeit Bewertung:
    1. Beginnen Sie das Verfahren 15 min nach Fluoreszenz Tracer Injektion durch Induktion Tiefe Isoflurane Narkose. Induzieren Tiefe Narkose bei Mäusen 2,3 % von Isofluran in Sauerstoff verwenden. Verwenden Sie die Pfote Rückzug Reflex um zu beurteilen, die Tiefe der Narkose (drücken Sie die Haut zwischen den Zehen, ein Fehlen der Flexion zeigt eine ausreichende Tiefe), und erforschen die Reflexe der Vordergliedmaße und die Megalosauridae bei Mäusen EAE unterzogen.
    2. Beheben Sie die Maus auf dem Rücken und sprühen Sie den Bauch mit Ethanol. Öffnen Sie Thorax mit einer Schere und entfernen Sie die Membrane. Öffnen Sie den rechten Vorhof des schlagenden Herzens mit einer Schere und durchspülen die Maus durch den linken Ventrikel des Herzens mit 10 mL PBS gefolgt von 10 mL 4 % PFA mit PBS-Puffer.
      Achtung: Um zu vermeiden, PFA einatmen, Durchspülen Sie die Maus in einer Dampfhaube.
    3. Fahren Sie mit Abschnitt 6.
  2. Für in Situ Zymography:
    1. Induzieren Sie Tiefe Isofluran-Narkose mit 2,3 % Isofluran in Sauerstoff in einer Maus EAE leiden, und prüfen Sie die Tiefe der Narkose wie in Schritt 5.1.1.
    2. Als nächstes befestigen Sie die Maus auf dem Rücken und sprühen Sie den Bauch mit Ethanol. Öffnen Sie Thorax mit einer Schere und entfernen Sie die Membrane. Öffnen Sie den rechten Vorhof des schlagenden Herzens mit einer Schere und durchspülen der Maus durch den linken Ventrikel des Herzens mit 20 mL PBS.
    3. Fahren Sie mit Abschnitt 6.

6. Dissektion und Einfrieren der Gehirne

  1. Vorbereitung der Kühlung Bad:
    1. Füllen Sie einen flachen Dewar Behälter mit zerkleinerten Trockeneis und fügen Sie 2-Methylbutane (Isopentane hinzu), bis die Flüssigkeit ca. 1 cm oberhalb der Trockeneis-Packung erreicht. Decken Sie mit einem losen Deckel – z. B. eine Eiskübel-Abdeckung.
  2. Clip aus dem Kopf der perfundierten Maus mit einer scharfen Schere und Haut und Ohren mit einer kleineren Gruppe von Schere entfernen.
  3. Sorgfältig zu sezieren die Schädeldecke durch Schneiden aus dem Foramen Magnum nach vorne links und rechts ermöglichen upfold die Schädeldecke in das Gehirn. Dann sorgfältig herausheben der intakten Gehirns aus der Schädelbasis beim Durchtrennen der optischen Nerven mit einem flachen Metallspatel.
  4. Gehirn auf Alufolie legen und das Gehirn in drei Stücken (Frontalhirn, Mittelhirn, und Kleinhirn + Hirnstamm) indem man zwei koronale Schnitten schneiden.
  5. Füllen Sie ein Cryomold (25 x 20 x 5 mm) bis zum ersten Quartal mit optimaler Temperatur schneiden (O.C.T.) Matrix, legen Sie Gehirnscheiben mit der Vorderseite nach unten in die Cryomold der einzelnen Gehirn, und Gewebe komplett mit O.C.T. Matrix.
  6. Legen Sie die Cryomold mit dem Gewebe in eine horizontale Ausrichtung in der 2-Methylbutane Bad und stellen Sie sicher, dass das Gewebe von unten nach oben innerhalb von 1 Minute friert durch Eintauchen des gesamten Gewebe-Blocks in das Bad zu vermeiden.
  7. Übertragen Sie gefrorenes Gewebe bis-80 ° C für die Lagerung zu und fahren Sie mit Abschnitt 7.

7. Vorbereitung der gefrorene Gewebeschnitte

  1. Temperatur von tiefgefrorenem Gewebe von-80 ° C bis-20 ° C in den Kryostaten für 30 min Equilibrate.
  2. Das Cryomold und die Halterung auf dem Kryostat-Gewebe-Halter (eingestellt auf-15 ° C) Gewebe Block entfernen mit O.C.T. Matrix.
  3. Schneiden Sie die Kanten des Gewebes Blocks auf dem Halter des Kryostaten mit einem scharfen Skalpell, und Fang an zu schneiden in den Gewebe-Block von 20 µm Abschnitte mit den Kryostaten Messer entfernen, bis das Gewebe sichtbar ist.
  4. Für die Analyse von in-vivo BBB Permeabilität:
    1. Schnitt 6 bis 10 µm Gewebeschnitte, sammeln sie auf Objektträgern Adhäsion und Bild sofort in den Abschnitten mit einem Deckglas mit einem Fluoreszenzmikroskop abgedeckt.
    2. Darstellung der Blutgefäße im Gehirn (Achten Sie auf scharfe Grenzen nicht undichten Blutgefäße im Vergleich zur Fluoreszenz-Muster für undichte Blutgefäße beobachtet diffundieren) zu beurteilen. Als Positivkontrolle überprüfen Sie die Leckage des Tracers in das Stroma Circumventricular Organe oder choroid Plexus, die ein BBB fehlt.
  5. Für in Situ Zymography:
    1. Schneiden Sie 6 µm Gewebeschnitte mit einem Kryostat, sammeln sie auf Objektträgern Adhäsion und frieren Sie Gewebeschnitte bei-20 ° C in einer eisigen Box mit Silica-Gel im Deckel ein.

8. in Situ Zymography kombiniert mit Laminin/CD45 Immunfluoreszenz-Färbung

  1. Bereiten Sie Lösungen:
    1. Bereiten Sie einbetten Lösung:
      1. Mischen Sie 6 g Glycerin (analysenrein), 2,4 g Poly (Vinyl-Alkohol), ddH2O 6 mL und 12 mL 0,2 M Tris-Puffer, pH 8, und rühren Sie (Magnetrührer) die Lösung für 4 h bei RT
      2. Übertragen Sie die Lösung auf eine 50 mL Zentrifugenröhrchen und 2 h bei RT ruhen lassen Inkubieren Sie anschließend die Lösung für 10 min bei 50 ° C (Wasserbad) und Zentrifuge für 20 min bei 2.700 x g bei Raumtemperatur.
      3. Den Überstand zu nehmen und Einfrieren in Aliquote bei-20 ° C.
    2. Bereiten Sie kalte Gelatine-Lösung:
      1. 0,1 g kalte Gelatine aus bovine Haut in 10 mL ddH2O auflösen.
      2. Lassen Sie es für mindestens 1 Tag einweichen und Aliquote bei 4 ° c lagern
    3. Bereiten Sie eiskalte Methanol (-20 ° C):
      1. Setzen Sie 100 % Methanol in einem Coplin Glas und kühlen Sie bis zu-20 ° C.
    4. 10 % Natrium-Azid Stammlösung vorbereiten:
      1. 10 mL ddH2O 1 g Natriumazid hinzu und bei Raumtemperatur lagern.
    5. Bereiten Sie 0,1 % Natrium-Azid funktionierende Lösung:
      1. Mix 99 µL des ddH2O mit 1 µL der Stammlösung 10 % Natrium-Azid.
    6. Lösen Sie 1 mg konjugierte Fluorescein Farbstoff abgeschreckt (DQ) Gelatine aus Schweinehaut in 1 mL der Lösung und Store 100 µL Aliquots lichtgeschützt bei 4 ° c arbeiten Natriumazid auf
    7. Auflösen von 30 mg 1,10-Phenanthroline-Monohydrat in 76 µL Ethanol und Speicher bei-20 ° C.
    8. Bereiten Sie 25 x Protease-Inhibitor-Lösung:
      1. 1 Tablette von EDTA-freie Protease-Inhibitor zu 2 mL ddH2O hinzufügen. Shop bei-20 ° C.
    9. Kurz vor dem Einsatz bereiten Sie Reaktionslösung (150 µL/Abschnitt):
      1. Zentrifugieren Sie 1 mg/mL-DQ-Gelatine-Lösung für 5 min bei 13.300 X g.
      2. Mix 127,2 µL ddH2O 15 µL 10-fach Puffer Reaktion (Gelatinase/Collagenase Assay Kit; siehe Tabelle der Materialien), 0,3 µL 20 mg/mL kalte Gelatine, 1,5 µL 1 mg/mL DQ Gelatine und 6 µL 25 x Protease-Inhibitor-Lösung.
    10. Kurz vor dem Einsatz bereiten Sie Phenantroline Negativkontrolle Reaktionslösung (150 µL/Abschnitt):
      1. Mix-125,2 µL ddH2O, 15 µL 10 x Reaktion Puffer, 0,3 µL 20 mg/mL kalte Gelatine, 1,5 µL 1 mg/mL DQ Gelatine, 6 µL 25 x Protease-Inhibitor EDTA frei und 2 µL 2 M 1,10-Phenantroline (MMP-Hemmer).
    11. Kurz vor dem Einsatz bereiten Sie kalte Gelatine (nicht fluoreszierend) Negativkontrolle Reaktionslösung (150 µL/Abschnitt):
      1. Mix 128,7 µL ddH2O, 15 µL 10-fach Puffer Reaktion und 0,3 µL 20 mg/mL kalte Gelatine 6 µL EDTA-frei 25 X Protease-Inhibitor.
    12. Bereiten Sie Primärantikörper cocktail für Gegenfärbung, zum Beispiel, 0,95 µg/mL polyklonale Kaninchen Anti-Laminin-Antikörper und 10 µg/mL polyklonale Ratte Anti-CD45 Antikörper in 1 % BSA mit PBS-Puffer, und bereiten Sie entsprechende Isotype Kontrolle Primärantikörper Cocktails.
    13. Bereiten Sie Sekundärantikörper Lösung, z. B. 7,5 µg/mL Cy3 Ziege Anti-Ratte + 15 µg/mL AMCA Anti-Kaninchen mit 1 % BSA mit PBS-Puffer (vor Licht schützen).
  2. Tauen Sie 6 µm nicht fixierten Gehirn Gewebeschnitte von EAE Mäusen in der eiskalten Kunststoffbox mit Silica-Gel im Deckel in einer Dampfhaube Retention von Wasser des Gewebes zu vermeiden und trennen 2 Gewebeschnitte auf einer Folie durch Zeichnen von Linien mit einem Wasser abstoßenden Stift
  3. Bereiten Sie Reaktionslösungen (Schritte 8.1.9-8.1.11), für 5 min bei 13.400 X g bei Raumtemperatur und vor warmen bis 37 ° C mit einem Wasserbad zentrifugieren.
  4. Rehydrieren Sie die Gewebeschnitte für 5 min bei 37 ° C mit 1 x Reaktion Puffer. 1 x Reaktion Puffer dann abgießen, die Gewebeschnitte Reaktionslösung Add-on und 4 h bei 37 ° c inkubieren Waschen Sie Objektträger in ddH2O 5 Mal.
  5. Beheben Sie Abschnitte für 5 min mit eiskalten Methanol bei-20 ° C zu und danach waschen Sie einmal mit PBS bei Raumtemperatur.
  6. 1 % BSA mit PBS-Puffer zu den Abschnitten hinzufügen und 20 min bei Raumtemperatur inkubieren (vor Licht schützen). Verwerfen Sie 1 % BSA mit PBS-Puffer aus den Abschnitten durch Umklappen der Folien auf Gewebe, Primärantikörper Cocktail hinzufügen und 1 h bei Raumtemperatur inkubieren (vor Licht schützen).
  7. Zweimal mit PBS waschen, Sekundärantikörper Cocktail hinzufügen und 1 h bei Raumtemperatur inkubieren (vor Licht schützen).
  8. Zweimal mit PBS waschen, montieren Sie die Folien mit Einbettung Lösung, montierten Teile über Nacht bei Raumtemperatur trocknen lassen (vor Licht schützen). Zu guter Letzt analysieren Sie gefärbten Gewebeschnitten mit einem Fluoreszenz-Mikroskop.

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Ergebnisse

Bewertung der klinische Verlauf der EAE bei C57BL/6 Mäusen sollte eine Krankheit Kurve wie in Abb. 2A und Änderungen in der Maus Körpergewicht wie dargestellt in Abbildung 2 bdargestellt führen. C57BL/6 Mäusen immunisiert mit MOGaa35-55 in der Regel beginnen Krankheitssymptome rund um 10-12. Tag nach der aktiven Immunisierung (Abbildung 1A) zu entwickeln. Immunisierten Mäusen zeigen in der Regel vorübergehend sinken des Körpergewich...

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Diskussion

Hier präsentieren wir Ihnen ein Protokoll überwachen EAE in weiblichen C57BL/6 Mäusen zu induzieren. Frauen werden bevorzugt ausgewählt, und es gibt eine Inzidenz von Frauen: Männer 3:1 im MS. Zur Beurteilung der Schwere der EAE, wir haben eine 3-Punkt-Wertungsblatt nutzen. EAE Schweregrad wird in der Regel in Bezug auf den Schweregrad der motorischen Funktionsstörungen bewertet. Mäuse mit fortgeschrittenen Stadien der EAE, d.h. ausstellen eine Punktzahl über 2 geopfert werden sollte, um unnötiges Leiden der Tiere zu ver...

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Offenlegungen

Keine Interessenkonflikte erklärt.

Danksagungen

Wir erkennen dankbar Lydia Sorokin, die ihre ursprüngliche in Situ Zymography Protokoll10 mit uns geteilt hat.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
AMCA Anti-Kaninchen-AntikörperJackson ImmunoResearch111-156-045Lagern bei 4 ° C; vor Licht schützen
Anti-CD45 Antikörper (30F11)Pharmingen07-1401Bei 4 > C
Anti-Laminin AntikörperDAKOZ0097Bei 4 & Grad lagern; C
Zuchtfutterz.B. PROVIMI KLIBA SA3336
Individuell belüftete Käfige, Blue Line Typ II oder IIIz.B. Tecniplast 1145T, 1285L
BSA Fraktion VApplichemA1391Bei 4 & deg lagern; C
KaltgelatineSigma-AldrichG 9391
Coplin Glas + Gestellz.B. Carl Roth GmbH + Co. KGH554.1; H552.1
Cy3 Anti-Ratten-AntikörperJackson ImmunoResearch111-156-144Bei 4 ° lagern; C; Schutz vor Licht
Deckgläser 24 x 40 mm # 1z.B. Thermo Scientific85-0186-00
Dextran Alexa Fluor 488 (10.000 MW)z.B. Molekulare SondenD22910Lagerung bei -20 & Grad; C; vor Licht schützen
Dextran Texas Red (3000 MW)InvitrogenD3328Bei -20 ° lagern C; vor Licht schützen
EnzChek Gelatinase/Kollagenase Assay Kit Thermo Fisher Wissenschaftlich; EnzCheckE12055Bei -20 > lagern C; schützen vor Licht
Weibliche C57BL/6J Mäuse (8-12 Wochen)z.B. Janvier LabsWeibchen, 8-12 Wochen
Gefrierbox für Histologie-Objektträgerz.B. Carl Roth GmbH + Co. KG2285.1
18G x 1½ ’ ’ (1,2 mm x 40 mm) Injektionsnadelz.B. BD, BD Microlance 3304622
27G x ¾ ’ ’ – Nr. 20 (0,4mm x 19mm) Injektionsnadelz.B. BD, BD Microlance 3302200
30G x ½ ’ ’ (0,3 mm x 13 mm) Injektionsnadelz.B. BD, BD Microlance 3304000
unvollständig Freund' s Adjuvans (IFA)z.B. Santa Cruz Biotechnologysc-24648Store at 4° C
Erhaltungsnahrungz.B. PROVIMI KLIBA SA3436
MOGaa35-55 Peptidz.B. GenScriptStore bei -80 >
C Objektträger (Superfrost Plus )Thermo ScientificJ1800AMNZ
Mycobacterium tuberculosis H37RAz. B. BD231141Lagern bei 4 > C 
NaCl 0,9 %B. Braun3535789
O.C.T. Verbindung (Tissue-Tek )Sakura4583
Omnican 50 30G x ½ ’ "B. Braun9151125S
ParaformaldehydMerck30525-89-4
Pertussis toxinz.B. List biological laboratories, Inc.180Lagern bei 4 Grad; C
Poly(vinylalkohol) (Mowiol 4-88)Sigma-Aldrich81381
Proteasehemmer EDTA-frei (Roche)Sigma-Aldrich4693132001Bei 4 > lagern; C
abweisender Stift z.B. DAKO Penz.B. DAKOS2002
Siegelfolie z.B. Parafilm Mz.B. Sigma-AldrichP7793
Kieselgelz.B. Carl Roth GmbH + Co. KG9351.1
MaschenschereF.S.T15012-12
Spritze 1 mlz.B. PRIMO62.1002
Spritze 10 mlz.B. CODAN Medical ApS2022-05
Verdampfersystem Univentor 400UNO. Bv

Referenzen

  1. Tietz, S., Engelhardt, B. Brain barriers: Crosstalk between complex tight junctions and adherens junctions. Journal of Cell Biology. 209, 493-506 (2015).
  2. Wu, C., et al. Endothelial basement membrane laminin alpha5 selectively inhibits T lymphocyte extravasation into the brain. Nature Medicine. 15, 519-527 (2009).
  3. Hannocks, M. J., et al. Molecular characterization of perivascular drainage pathways in the murine brain. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 38, 669-686 (2018).
  4. Kermode, A. G., et al. Breakdown of the blood-brain barrier precedes symptoms and other MRI signs of new lesions in multiple sclerosis. Pathogenetic and clinical implications. Brain. 113 (Pt 5), 1477-1489 (1990).
  5. Tommasin, S., Gianni, C., De Giglio, L., Pantano, P. Neuroimaging techniques to assess inflammation in Multiple Sclerosis. Neuroscience. , (2017).
  6. Lopes Pinheiro, M. A., et al. Immune cell trafficking across the barriers of the central nervous system in multiple sclerosis and stroke. Biochimica Biophysica Acta. 1862, 461-471 (2016).
  7. Bartholomaus, I., et al. Effector T cell interactions with meningeal vascular structures in nascent autoimmune CNS lesions. Nature. 462, 94-98 (2009).
  8. Kyratsous, N. I., et al. Visualizing context-dependent calcium signaling in encephalitogenic T cells in vivo by two-photon microscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114, E6381-E6389 (2017).
  9. Lodygin, D., et al. A combination of fluorescent NFAT and H2B sensors uncovers dynamics of T cell activation in real time during CNS autoimmunity. Nature Medicine. 19, 784-790 (2013).
  10. Agrawal, S., et al. Dystroglycan is selectively cleaved at the parenchymal basement membrane at sites of leukocyte extravasation in experimental autoimmune encephalomyelitis. Journal of Experimental Medicine. 203, 1007-1019 (2006).
  11. Song, J., et al. Focal MMP-2 and MMP-9 activity at the blood-brain barrier promotes chemokine-induced leukocyte migration. Cell Reports. 10, 1040-1054 (2015).
  12. Tietz, S., et al. Lack of junctional adhesion molecule (JAM)-B ameliorates experimental autoimmune encephalomyelitis. Brain, Behavior, and Immunity. 73, 3-20 (2018).
  13. Mähler Convenor, M., Berard, M., Feinstein, R., Gallagher, A., Illgen-Wilcke, B., Pritchett-Corning, K., Raspa, M. FELASA working group on revision of guidelines for health monitoring of rodents and rabbits. FELASA recommendations for the health monitoring of mouse, rat, hamster, guinea pig and rabbit colonies in breeding and experimental units. Lab Anim. 48 (3), 178-192 (2014).
  14. Bittner, S., Afzali, A. M., Wiendl, H., Meuth, S. G. Myelin oligodendrocyte glycoprotein (MOG35-55) induced experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) in C57BL/6 mice. Journal of Visual Experiments. , (2014).
  15. Tietz, S. M., et al. Refined clinical scoring in comparative EAE studies does not enhance the chance to observe statistically significant differences. European Journal of Immunology. 46, 2481-2483 (2016).
  16. Mendel, I., Kerlero de Rosbo, N., Ben-Nun, A. A myelin oligodendrocyte glycoprotein peptide induces typical chronic experimental autoimmune encephalomyelitis in H-2b mice: fine specificity and T cell receptor V beta expression of encephalitogenic T cells. European Journal of Immunology. 25, 1951-1959 (1995).
  17. Miller, S. D., Karpus, W. J. Experimental autoimmune encephalomyelitis in the mouse. Current Protocols in Immunology. 15, Chapter 15 Unit 14 (2007).
  18. Sobel, R. A., Tuohy, V. K., Lu, Z. J., Laursen, R. A., Lees, M. B. Acute experimental allergic encephalomyelitis in SJL/J mice induced by a synthetic peptide of myelin proteolipid protein. Journal of Neuropathology & Experimental Neurology. 49, 468-479 (1990).
  19. Westarp, M. E., et al. T lymphocyte line-mediated experimental allergic encephalomyelitis--a pharmacologic model for testing of immunosuppressive agents for the treatment of autoimmune central nervous system disease. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 242, 614-620 (1987).
  20. Klotz, L., et al. B7-H1 shapes T-cell-mediated brain endothelial cell dysfunction and regional encephalitogenicity in spontaneous CNS autoimmunity. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113, E6182-E6191 (2016).
  21. Tietz, S. M., et al. MK2 and Fas receptor contribute to the severity of CNS demyelination. PLoS One. 9, e100363(2014).
  22. Coisne, C., Mao, W., Engelhardt, B. Cutting edge: Natalizumab blocks adhesion but not initial contact of human T cells to the blood-brain barrier in vivo in an animal model of multiple sclerosis. Journal of Immunology. 182, 5909-5913 (2009).
  23. Korner, H., et al. Critical points of tumor necrosis factor action in central nervous system autoimmune inflammation defined by gene targeting. Journal of Experimental Medicine. 186, 1585-1590 (1997).
  24. Krueger, M., et al. Blood-brain barrier breakdown involves four distinct stages of vascular damage in various models of experimental focal cerebral ischemia. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 35, 292-303 (2015).
  25. Hawkins, B. T., Egleton, R. D. Fluorescence imaging of blood-brain barrier disruption. Journal of Neuroscience Methods. 151, 262-267 (2006).
  26. Graesser, D., et al. Altered vascular permeability and early onset of experimental autoimmune encephalomyelitis in PECAM-1-deficient mice. Journal of Clinical Investigation. 109, 383-392 (2002).
  27. Engelhardt, B., Sorokin, L. The blood-brain and the blood-cerebrospinal fluid barriers: function and dysfunction. Seminars in Immunopathology. 31, 497-511 (2009).
  28. Owens, T., Bechmann, I., Engelhardt, B. Perivascular spaces and the two steps to neuroinflammation. Journal of Neuropathology & Experimental Neurology. 67, 1113-1121 (2008).
  29. Sixt, M., et al. Endothelial cell laminin isoforms, laminins 8 and 10, play decisive roles in T cell recruitment across the blood-brain barrier in experimental autoimmune encephalomyelitis. Journal of Cell Biology. 153, 933-946 (2001).
  30. Grewal, I. S., et al. CD62L is required on effector cells for local interactions in the CNS to cause myelin damage in experimental allergic encephalomyelitis. Immunity. 14, 291-302 (2001).

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