Method Article

Probenvorbereitungsmethode des Raster- und Transmissionselektronenmikroskops für die Anhänge von Woodboring Beetle

DOI:

10.3791/59251

⸱

February 3rd, 2020

 ,  ,  ,  , 
1The Key Laboratory for Silviculture and Conservation of the Ministry of Education, School of Forestry, Beijing Forestry University, 2School of Forestry, Inner Mongolia Agricultural University, 3Institute of Medicinal Plant Development, Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College, 4School of Forestry, Fujian Agriculture and Forestry University

In This Article

Summary

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Zur Beobachtung der Ultrastruktur von Insektensensilla wurden in der Studie Raster- und Transmissionselektronenmikroskopie (SEM bzw. TEM) zur Probenvorbereitung vorgestellt. Tween 20 wurde in das Fixativ aufgenommen, um Probenverformungen in SEM zu vermeiden. Fluoreszenzmikroskopie war hilfreich, um die Schnittgenauigkeit in TEM zu verbessern.

Abstract

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Dieser Bericht beschrieb Probenvorbereitungsmethoden, die Raster- und Transmissionselektronenmikroskop-Beobachtungen, die durch die Vorbereitung von Anhängsel des Holzbohrkäfers Chlorophorus caragana Xie & Wang (2012) für beide Arten der Elektronenmikroskopie demonstriert wurden. Das Rasterelektronenmikroskopieprotokoll (SEM) basierte auf probenchemischer Fixierung, Dehydrierung in einer Reihe von Ethanolbädern, Trocknung und Sputterbeschichtung. Durch Zugabe von Tween 20 (Polyoxyethylen-Sorbitan-Laurat) zur Fixier- und Waschlösung wurde die Insektenkörperoberfläche des Holzbohrkäfers im SEM sauberer gewaschen. Die Probenvorbereitung der Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) in dieser Studie umfasste eine Reihe von Schritten, einschließlich Fixierung, Ethanoldehydrierung, Einbettung in Harz, Positionierung mittels Fluoreszenzmikroskopie, Schnittung und Färbung. Fixative mit Tween 20 aktiviert eindringen die Insektenkörperwand von Holzbohrkäfer leichter als es ohne Tween 20 gewesen wäre, und in der Folge bessere feste Gewebe und Organe im Körper, so ergab klare Transmission Elektronenmikroskop Beobachtungen von Insekten sensilla Ultrastrukturen. Der nächste Schritt dieser Vorbereitung war die Bestimmung der Positionen der Insektensensorilla in der im Harzblock eingebetteten Probe durch die Verwendung der Fluoreszenzmikroskopie, um die Präzision der Zielsensilla-Positionierung zu erhöhen. Dies verbesserte die Schnittgenauigkeit.

Introduction

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Die Rasterelektronenmikroskopie ist ein wichtiges Werkzeug in vielen Morphologiestudien, dass SEM Oberflächenstrukturen1,2zeigt. Der Reiz der Transmissionselektronenmikroskopie ist, dass sie verwendet werden kann, um eine breite Palette biologischer Strukturen im Nanometermaßstab zu untersuchen, von der Architektur der Zellen und der Ultrastruktur von Organellen bis hin zur Struktur makromolekularer Komplexe und Proteine. TEM zeigt innere Strukturen3,4,5.

Coleoptera ist die größte Insekteng....

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Protocol

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VORSICHT: Konsultieren Sie die Materialsicherheitsdatenblätter der Reagenzien, bevor Sie sie verwenden. Mehrere der bei der Probenvorbereitung verwendeten Chemikalien sind giftig, erbgutverändernd, krebserregend und/oder reprotoxisch. Verwenden Sie persönliche Schutzausrüstung (Handschuhe, Labormantel, Hose in voller Länge und Schuhe mit geschlossener Zehen) und arbeiten Sie unter einer Dunstabzugshaube, während Sie die Probe bearbeiten.

1. SEM Probenvorbereitung und Bildgebung

  1. Probenfixierung und -reinigung
    1. Arbeiten in einem Gebiet, in dem C. caragana auftreten, ziehen Erwachsene in Feldfallen mit Pflanzenlockmit....

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Results

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Mit Reinigungs- und Fixierlösung mit Tween 20 wurde ein saubereres SEM-Bild beobachtet als das ohne Tween 20 (Abbildung 3). Tween 20 Befestigungslösung drang in die Glutaraldehyd-Fixierlösung in das Gewebe ein. Die Mikrotubuli-Struktur war deutlich zu sehen. DAS TEM-Bild der internen Struktur der Probe wurde ohne Tween 20 verwischt (Abbildung 4).

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Discussion

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In diesem Artikel haben wir ein Probenvorbereitungsschema für die Raster- und Transmissionselektronenmikroskopie für Holzbohrkäfer vorgestellt. Anhand des Insektenanhängsals als repräsentatives Studienfach haben wir einige Verbesserungen gegenüber herkömmlichen Probenvorbereitungsmethoden gezeigt.

Das von der festen Oberfläche gelöste flüssige Öl wird zu kleinen Tröpfchen emulgiert, die gut dispergiert und im Waschmedium aufgehängt werden können, um die Rückablagerung auf der Oberfläche des Ob.......

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Disclosures

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Wir haben keinen Interessenkonflikt zu offenbaren.

Acknowledgements

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Wir schätzen die großzügige Unterstützung des Beijing Vocational College of Agriculture, des Institute for the Application of Atomic Energy (Chinese Academy of Agricultural Science), des Bioresearch Center of Beijing Forestry University und Professor Shan-gan Zhang vom Institut für Zoologie der Chinesischen Akademie der Wissenschaften. Diese Forschung wurde unterstützt durch national Key R&D Program of China (2017YFD0600103), die National Natural Science Foundation of China (Grant No. 31570643, 81774015), Forest Scientific Research in the Public Welfare of China (201504304), Inner Mongolia Agricultural University High-Level Talent Research Startup Plan (203206038) und....

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Anatomische LinseChongqing Auto Optical
Gesellschaft mit beschränkter Haftung		1425277
Carbon-KlebebandSPI Supplies, Division of Structure Probes, Inc.7311
TetrachlorkohlenstoffSigma56-23-5
KupfergitterGilderGridsG300
DinatriumhydrogenphosphatSinopharm Group chemisches Reagenz Co., LTD10039-32-4
EthanolJ.T. Baker64-17-5
Flache EinbettformenHyde Venture (Beijing) Biotechnology Co., Ltd.70900
FluoreszenzmikroskopLEICADM2500
GlutaraldehydSigma-Aldrich111-30-8Wasserfreies Isophoron in EM-Qualität
Sigma78-59-1
BleicitratSigma512-26-5
MethanolSigma67-56-1
Monobasisches Natriumphosphat group chemical reagent co., LTD7558-80-7
ObjektivmikrometerOlympus0-001-034
OsmiumtetroxidSigma541-09-3
PetrischaleAldrich1998
RasierklingeGillette
ResinSpurrERL4221
SkalpellLianhuiGB/ T19001-2008
SEMHitachiS-3400
Kieselgel-TrockenmittelSuzhou Longhui Trockenmittel Co., Ltd.112926-00-8
Kleine BürsteMartolG1220
NatriumhydroxidSigma1310-73-2
Sputter-Ionen-InstrumentHitachi Koki Co. Ltd., Tokyo, JapanE-1010
StereomikroskopLeicaEZ4 HD
TEMHitachiH-7500
Tween 20Tianjin Damao Chemisches Reagenz9005-64-5
UltramikrotomLeicaUC6
UltraschallreinigerGT SonicGT-X1
UranylacetatSigma6159-44-0

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Song, Y. Q., Dong, J. F., Sun, H. Z. Scanning Electron Microscope Technology of Insect Material. Hubei Agricultural Sciences. 52, 1064-1065 (2013).
  2. Liu, C. The develo....

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Scanning Electron MicroscopyTransmission Electron MicroscopySample PreparationTween 20 FixativeEthanol DehydrationFluorescence MicroscopyUltramicrotome SectioningUranyl Acetate StainingLead Citrate StainingIon Sputtering

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