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Methodenartikel

Probenvorbereitungsmethode des Raster- und Transmissionselektronenmikroskops für die Anhänge von Woodboring Beetle

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DOI:

10.3791/59251

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3. Februar 2020

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1The Key Laboratory for Silviculture and Conservation of the Ministry of Education, School of Forestry, Beijing Forestry University, 2School of Forestry, Inner Mongolia Agricultural University, 3Institute of Medicinal Plant Development, Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College, 4School of Forestry, Fujian Agriculture and Forestry University

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Zur Beobachtung der Ultrastruktur von Insektensensilla wurden in der Studie Raster- und Transmissionselektronenmikroskopie (SEM bzw. TEM) zur Probenvorbereitung vorgestellt. Tween 20 wurde in das Fixativ aufgenommen, um Probenverformungen in SEM zu vermeiden. Fluoreszenzmikroskopie war hilfreich, um die Schnittgenauigkeit in TEM zu verbessern.

Zusammenfassung

Dieser Bericht beschrieb Probenvorbereitungsmethoden, die Raster- und Transmissionselektronenmikroskop-Beobachtungen, die durch die Vorbereitung von Anhängsel des Holzbohrkäfers Chlorophorus caragana Xie & Wang (2012) für beide Arten der Elektronenmikroskopie demonstriert wurden. Das Rasterelektronenmikroskopieprotokoll (SEM) basierte auf probenchemischer Fixierung, Dehydrierung in einer Reihe von Ethanolbädern, Trocknung und Sputterbeschichtung. Durch Zugabe von Tween 20 (Polyoxyethylen-Sorbitan-Laurat) zur Fixier- und Waschlösung wurde die Insektenkörperoberfläche des Holzbohrkäfers im SEM sauberer gewaschen. Die Probenvorbereitung der Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) in dieser Studie umfasste eine Reihe von Schritten, einschließlich Fixierung, Ethanoldehydrierung, Einbettung in Harz, Positionierung mittels Fluoreszenzmikroskopie, Schnittung und Färbung. Fixative mit Tween 20 aktiviert eindringen die Insektenkörperwand von Holzbohrkäfer leichter als es ohne Tween 20 gewesen wäre, und in der Folge bessere feste Gewebe und Organe im Körper, so ergab klare Transmission Elektronenmikroskop Beobachtungen von Insekten sensilla Ultrastrukturen. Der nächste Schritt dieser Vorbereitung war die Bestimmung der Positionen der Insektensensorilla in der im Harzblock eingebetteten Probe durch die Verwendung der Fluoreszenzmikroskopie, um die Präzision der Zielsensilla-Positionierung zu erhöhen. Dies verbesserte die Schnittgenauigkeit.

Einleitung

Die Rasterelektronenmikroskopie ist ein wichtiges Werkzeug in vielen Morphologiestudien, dass SEM Oberflächenstrukturen1,2zeigt. Der Reiz der Transmissionselektronenmikroskopie ist, dass sie verwendet werden kann, um eine breite Palette biologischer Strukturen im Nanometermaßstab zu untersuchen, von der Architektur der Zellen und der Ultrastruktur von Organellen bis hin zur Struktur makromolekularer Komplexe und Proteine. TEM zeigt innere Strukturen3,4,5.

Coleoptera ist die größte Insektengruppe, darunter etwa 182 Familien und 350.000 Arten. Die meisten der coleopteran Insekten, insbesondere Holzbohrkäfer, ernähren sich von Pflanzen, von denen viele wichtige Schädlinge von Wäldern und Obstbäumen sind, die verheerende Schäden an Bäumenverursachen 6. Zur Zeit, Prävention und Kontrolle Der Population von Schädlingen auf der Grundlage der chemischen Ökologie Theorie haben immer mehr Aufmerksamkeit erhalten7. Effiziente, niedriggiftige, schadstofffreie Pheromon-Kontrollmethoden sind zu einem effektiven Weg geworden8. Das Studium der Sensilla-Morphologie und Ultrastruktur von Insekten ist ein wichtiger Teil der chemischen Ökologieforschung in Insekten. Die Raster- und Transmissionselektronenmikroskopie (SEM bzw. TEM) wird zur Untersuchung ihrer Morphologie und inneren Anatomie eingesetzt. Bei der Vorbereitung von Insektenproben für die Elektronenmikroskopie (EM) kann jedoch die Objektivität und Authentizität der Beobachtungsstelle beeinträchtigt werden9. Im Allgemeinen erfordert die SEM-Probenvorbereitung von Insekten Reinigung, Gewebefixierung, Dehydrierung, Metathesen, Trocknung und Sputterbeschichtung10. Aufgrund der komplexen Umgebung, in der Holzbohrkäfer leben, hat die Körperoberfläche oft verschiedene Schadstoffe und ihre Anhängsel haben oft viele feine lange Sensilla oder Borsten. Insbesondere sind einige Holzträger nicht aus der Laboraufzucht erhältlich, die direkt im Feld gesammelt und dann in Befestigungsflüssigkeit gesteckt werden, um frische seramungzumachen und anschließend im Labor zu waschen. Wenn die Probe zuerst fixiert und dann gewaschen wird, ist es offensichtlich viel schwieriger, Schmutz zu entfernen, da Glutaraldehyd sie stark an der Probe fixiert. Tween 20 ist ein Tensid11,12,13,14, das eine wichtige Rolle im Waschprozess spielt, einschließlich der Verringerung der Oberflächenspannung von Wasser und der Verbesserung der Benetzbarkeit von Wasser auf der Oberfläche der Wäsche. In dieser Studie wurde Tween 20 der Befestigungslösung und der PBS-Reinigungslösung hinzugefügt, um die Oberflächenspannung der Flüssigkeit zu reduzieren und zu verhindern, dass sich der Schmutz auf der Körperoberfläche des Holzbohrkäfers ablagert, was die Körperoberfläche in SEM sauberer machte.

Mit TEM können Sensilla an verschiedenen Insektenorganen in Scheiben geschnitten werden, um die klaren Strukturen in ihnen zu offenbaren und so eine Grundlage für die Analyse von Sensilla-Funktionen zu schaffen. Wenn das Subjekt Insekt, wie Holzbohrkäfer, groß ist, und seine Körperwand hat einen erheblichen Grad an Sklerotisierung, so dass das Fixativ kann nicht vollständig gesättigt Organgewebe im Inneren des Insektenkörpers. Tween 20 kann die Dispersions- und Aufhängungskapazität des Schmutzes verbessern. In dieser Studie wurde Tween 20 dem Fixativ hinzugefügt, um das Fixative Flüssigkeitsdurchdringung in die Insektenkörperwand des Holzbohrkäfers zu verbessern, um Verformungen und Denkollaps des Epidermi11,12,13zu vermeiden. Darüber hinaus ist es mit der allgemeinen Schneidetechnologie schwierig, verschiedene Arten von Sensilla genau zu lokalisieren, insbesondere für einige kleine Sensilla15. Basierend auf der traditionellen TEM-Probenvorbereitung kombinierte diese Studie Fluoreszenzmikroskopie und SEM, um die Position von Insektensensilla im eingebetteten Block zu bestimmen und so die Schnittgenauigkeit zu verbessern.

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Protokoll

VORSICHT: Konsultieren Sie die Materialsicherheitsdatenblätter der Reagenzien, bevor Sie sie verwenden. Mehrere der bei der Probenvorbereitung verwendeten Chemikalien sind giftig, erbgutverändernd, krebserregend und/oder reprotoxisch. Verwenden Sie persönliche Schutzausrüstung (Handschuhe, Labormantel, Hose in voller Länge und Schuhe mit geschlossener Zehen) und arbeiten Sie unter einer Dunstabzugshaube, während Sie die Probe bearbeiten.

1. SEM Probenvorbereitung und Bildgebung

  1. Probenfixierung und -reinigung
    1. Arbeiten in einem Gebiet, in dem C. caragana auftreten, ziehen Erwachsene in Feldfallen mit Pflanzenlockmitteln geködert, wie Isophoron16. Saubere Körper von erwachsenem C. Caragana in 0,1 mol L-1 phosphatgepufferter Salzsäure (PBS, pH 7,2), 2,5% (wt/vol) Glutaraldehyd (Anhydrous EM Grad) und 0,06% (vol/vol) Tween 20. Fixieren Sie die Probe auf 4 °C über das Wochenende.
    2. Entfernen Sie die Körper aus der Konservierungsflüssigkeit und spülen Sie im Phosphatpuffer ab. Mit Hilfe eines Stereomikroskops die Anhänge entfernen und ultrasonisch (40 kHz) in einer 0,1 molL-1 phosphatgepufferten Saline (pH 7,2) mit 0,06% (vol/vol) Tween 20 (PBST) reinigen. Nach der Reinigung für 100 s, übertragen Sie die Probe auf das Mikroskop, um zu überprüfen, ob es sauber war. Unter normalen Umständen für 400er reinigen, um sicherzustellen, dass die Probe sauber genug war, um zu beobachten und nicht beschädigt.
  2. Probenentwässerung, Montage und Trocknung
    1. Dehydrieren Sie die Proben mit 20 min aufeinanderfolgenden Behandlungen in 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 100% und 100% (alle vol/vol) Ethanol. Verwenden Sie unter einem Stereomikroskop doppelseitiges Klebeband aus Kohlenstoff, um 3 Beobachtungsflächen (dorsale ventrale und seitliche) getrennt auf Stubs zu fixieren. Beachten Sie, dass alle Sichtflächen sauber und frei von Verunreinigungen gehalten werden müssen. Legen Sie die Probenstufe in eine Petrischale, die ein Kieselgel-Desiccant für 48 h enthält.
  3. Sputtermantel und Probeneinfügung
    1. Mit Hitachi Koki (E-1010) Ionen-Sputtergerät drehen Main VALVE in OPEN-Position, entfernen Sie die Probenkammerabdeckung und geben Sie die Probe in die Kammer. Schalten Sie den POWER-Schalter ein, und READY-Licht war eingeschaltet. Stellen Sie die Sputterzeit auf 45 Sekunden und die Schichtdicke auf 70,875 ° fest. Sobald der mechanische Pumpen-Vakuum-Zifferblattindex unter 7 gefallen ist, drücken Sie DISCHARGE und beginnen Sie platin zu sprühen. Schalten Sie am Ende des Experiments die Stromversorgung aus und nehmen Sie die Probe aus der Kammer. Sprühfoliendicke: d = KIVt ("d" ist die Dicke der Folie in der Einheit von " " " K" ist eine Konstante, abhängig von dem gesputterten Metall und Gas. K der Luft ist z. B. 0,07; "I" ist die Einheit mA des Plasmaflusses; "V" ist die Spannung, die in der Einheit von "KV" angelegt wird. "t" ist die Zeit in Sekunden.
    2. Legen Sie den Stub, der die Probe enthält, auf die Bühne von SEM. Stellen Sie sicher, dass die Probenstufe mit dem Probenstummel genügend Höhe hat, um ein gutes Bild zu ermöglichen. Öffnen Sie die SEM-Software und wählen Sie eine gewünschte Betriebsspannung, beginnend bei 20 kV.

2. TEM Probenvorbereitung und Bildgebung

  1. Beziehen und fixieren Sie die Probe wie in den Schritten 1.1.1 und 1.1.2.
  2. Reinigung, Sekundärfixierung und Dehydrierung
    1. Entfernen Sie erwachsene C. caragana aus der Konservierungsflüssigkeit. Mit einem Stereomikroskop entfernen Sie die Anhänge, waschen Sie die Proben in PBST für 3 h, und fixieren Sie sie dann in 1% (wt/vol) Osmiumtetroxid in PBS für 1h bei 25 °C. Dehydrieren Sie die Proben mit 20 min aufeinanderfolgenden Behandlungen in 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 100% und 100% (alle vol/vol) Ethanol bei Raumtemperatur.
  3. Harzeinbettung und Polymerisation
    1. Die Proben in Harz in eine flache Einbettform einbetten. Die Probe befand sich an der Unterseite der Platte und wurde so nah wie möglich an den Rand der Einbaunut gelegt. Legen Sie das Etikett in den Rohling und inkubieren Sie dann die Platte, die die Probe enthält, bei 60 °C für 72 h. Entfernen Sie die Kapsel aus dem Inkubator und überprüfen Sie, ob das Harz polymerisiert war.
  4. Probenschnitt und Färbung
    1. Stellen Sie jeden Harzblock unter ein Fluoreszenzmikroskop und fotografieren Sie ihn unter blauem Licht, sobald sichergestellt wurde, dass die Probe verfestigt war. Bewegen Sie die fluoreszierende Lichtquelle des Mikroskops, sodass die Probe von oben bestrahlt wird. Ermöglichen Sie eine deutliche Beobachtung der Sensilla im Harzblock. Fotografiert und messen Entfernungen, um die Sensilla anzusprechen (Abbildung 1).
    2. Siehe SEM-Bild der Palps (Abbildung 2A), und schneiden Sie grob den Harzblock mit einer Rasierklinge, um den Zielrezeptor zu schließen (Abbildung 2B).
    3. Als nächstes fotografieren Sie mit der Blaulichtfluoreszenzmikroskopie den grob geschnittenen Harzblock und passen die Lichtquelle von oben so an, dass die Sensilla deutlich beobachtet wurde. Grünes Licht, das vom blauen Licht angeregt wurde, erzeugte eine positive Beobachtung. Bei der Bildgebung wurde das objektive Mikrometer (DIV 0,01 mm) der Fluoreszenzmikroskopstufe hinzugefügt, und dann wurde der Abstand des Ziels mit der ImageJ-Software (U.S. National Institute of Health) gemessen (Abbildung 2C). Das Bildlineal wurde von Adobe Photoshop CS5 (Adobe Systems, Inc., San Jose, CA, USA) erstellt. Legen Sie dann für das Schneiden von Ultramikrotome den Schnittabstand mit 50-60 nm Scheibenstärken fest, bis die Zielposition erreicht ist. Verwenden Sie die Fluoreszenzmikroskopie, um den Zielrezeptor zu lokalisieren.
    4. Montieren Sie die Abschnitte auf Formvar-beschichteten, 100-Mesh-Kupfergittern, doppelt mit Uranylacetat und Bleicitrat befleckt.
      1. Erstens 3,75 g Uranylacetat zu 50 ml 50 % Methanol hinzufügen. Fleckengitter mit einer gefilterten (0,45 m) Spritze einer gesättigten Lösung von Uranylacetat bei Raumtemperatur für 10 min. Abdeckabschnitte während der Färbung, um lichtinduzierte Ausscheidungen zu blockieren. 2x in 50 % Methanol abspülen; 2x gefiltertes entgastes Wasser.
      2. Zweitens 0,02 g Bleicitrat zu 10 ml entgastem destilliertem Wasser in zentrifugenrohr hinzufügen. 0,1 ml 10 N Natriumhydroxid hinzufügen, abdichten und schütteln, um sich aufzulösen. Fleckengitter mit einer Lösung aus Bleicitrat für 8 min. Zentrifuge vor Gebrauch. Die Färbung muss in einer kohlendioxidfreien Umgebung erfolgen, um die Bildung von Bleikohlensäureausfällen zu verhindern. Legen Sie Fleckentropfen auf Quadrate von Kunststoff-Petrischalen. Spülen Sie in entgastem gefiltertem Wasser und trocken17. Beobachten Sie sie über TEM mit 80 kV.

figure-protocol-1
Abbildung 1: Ein Fluoreszenzmikroskop fotografierte einen Harzblock, der das Anhängseln der Chlorophorus caraganaumschließt. (A) Antennenharzblock; (B) Harzblock am Ende des Ovipositors. Der Pfeil zeigte den Rand des Harzblocks an; gepunkteter Kreis zeigt die Zielsensorilla an. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Abbildung 2: Verfahren der genauen Sensilla-Positionsmethode. (A) Das 4. Untersegment eines Oberkiefers von Chlorophorus caraganazeigte die von SEM angestrebte Sensilla. (B) Das 4. Untersegment eines Oberkiefer-Palp von C. caragana, das durch Fluoreszenzmikroskopie betrachtet wurde. Weißer Pfeil zeigte die grob geschnittene Kante des Harzblocks und der gepunktete Kreis zeigte die genaue Position. (C) Der markierte Abstand vom Rand des Harzblocks zur maxillären Palp-Zielposition (in dieser Probe 28 m). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Ergebnisse

Mit Reinigungs- und Fixierlösung mit Tween 20 wurde ein saubereres SEM-Bild beobachtet als das ohne Tween 20 (Abbildung 3). Tween 20 Befestigungslösung drang in die Glutaraldehyd-Fixierlösung in das Gewebe ein. Die Mikrotubuli-Struktur war deutlich zu sehen. DAS TEM-Bild der internen Struktur der Probe wurde ohne Tween 20 verwischt (Abbildung 4).

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Diskussion

In diesem Artikel haben wir ein Probenvorbereitungsschema für die Raster- und Transmissionselektronenmikroskopie für Holzbohrkäfer vorgestellt. Anhand des Insektenanhängsals als repräsentatives Studienfach haben wir einige Verbesserungen gegenüber herkömmlichen Probenvorbereitungsmethoden gezeigt.

Das von der festen Oberfläche gelöste flüssige Öl wird zu kleinen Tröpfchen emulgiert, die gut dispergiert und im Waschmedium aufgehängt werden können, um die Rückablagerung auf der Oberfläche des Ob...

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Offenlegungen

Wir haben keinen Interessenkonflikt zu offenbaren.

Danksagungen

Wir schätzen die großzügige Unterstützung des Beijing Vocational College of Agriculture, des Institute for the Application of Atomic Energy (Chinese Academy of Agricultural Science), des Bioresearch Center of Beijing Forestry University und Professor Shan-gan Zhang vom Institut für Zoologie der Chinesischen Akademie der Wissenschaften. Diese Forschung wurde unterstützt durch national Key R&D Program of China (2017YFD0600103), die National Natural Science Foundation of China (Grant No. 31570643, 81774015), Forest Scientific Research in the Public Welfare of China (201504304), Inner Mongolia Agricultural University High-Level Talent Research Startup Plan (203206038) und Inner Mongolia Autonomous Region Higher Education Research Project (NJZZ18047), Inner Mongolia Autonomous Region Linxue "Double First-class" Construction Project (170001).

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Anatomische LinseChongqing Auto Optical
Gesellschaft mit beschränkter Haftung		1425277
Carbon-KlebebandSPI Supplies, Division of Structure Probes, Inc.7311
TetrachlorkohlenstoffSigma56-23-5
KupfergitterGilderGridsG300
DinatriumhydrogenphosphatSinopharm Group chemisches Reagenz Co., LTD10039-32-4
EthanolJ.T. Baker64-17-5
Flache EinbettformenHyde Venture (Beijing) Biotechnology Co., Ltd.70900
FluoreszenzmikroskopLEICADM2500
GlutaraldehydSigma-Aldrich111-30-8Wasserfreies Isophoron in EM-Qualität
Sigma78-59-1
BleicitratSigma512-26-5
MethanolSigma67-56-1
Monobasisches Natriumphosphat group chemical reagent co., LTD7558-80-7
ObjektivmikrometerOlympus0-001-034
OsmiumtetroxidSigma541-09-3
PetrischaleAldrich1998
RasierklingeGillette
ResinSpurrERL4221
SkalpellLianhuiGB/ T19001-2008
SEMHitachiS-3400
Kieselgel-TrockenmittelSuzhou Longhui Trockenmittel Co., Ltd.112926-00-8
Kleine BürsteMartolG1220
NatriumhydroxidSigma1310-73-2
Sputter-Ionen-InstrumentHitachi Koki Co. Ltd., Tokyo, JapanE-1010
StereomikroskopLeicaEZ4 HD
TEMHitachiH-7500
Tween 20Tianjin Damao Chemisches Reagenz9005-64-5
UltramikrotomLeicaUC6
UltraschallreinigerGT SonicGT-X1
UranylacetatSigma6159-44-0

Referenzen

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