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Methodenartikel

Analyse der Fucosylated menschlichen Milch Trisaccharides in biotechnologischen Zusammenhang mit genetisch codierte Biosensoren

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DOI:

10.3791/59253

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13. April 2019

 , 
1Department of Chemical and Biological Engineering, Iowa State University

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Wir beschreiben hier die Hochdurchsatz-Erkennung und Quantifizierung von Fucosylated Muttermilch-Oligosaccharide (HMOs) mit einer ganzen Zelle Biosensor. Wir zeigen auch hier, die Anpassung dieser Plattform zur Analyse von HMO Produktionsstämme, mit Schwerpunkt auf das Signal-Rausch-Verhältnis zu verbessern.

Zusammenfassung

Muttermilch-Oligosaccharide (HMOs) sind komplexe Kohlenhydrate Komponenten der menschlichen Muttermilch, die reichlich Vorteile auf Kleinkinder Gesundheit aufweisen. Optimierung ihrer biotechnologischen Synthese ist jedoch durch den relativ geringen Durchsatz der Erkennung und Quantifizierung von Monosaccharid und Verbindungen beschränkt. Konventionelle Techniken der Glycan Analyse gehören chromatographische/Masse-spektrometrische Methoden mit Durchsatz in der Größenordnung von Hunderten von Proben pro Tag ohne Automatisierung. Wir zeigen hier eine genetisch codierte bakterielle Biosensor für den Hochdurchsatz-, Gestänge-spezifische Erkennung und Quantifizierung von Fucosylated HMO Strukturen, 2'-Fucosyllactose und 3-Fucosyllactose, die wir über heterologe erreicht Ausdruck von Fucosidases. Da das Vorhandensein von Laktose in der Milch oder in biotechnologischen Prozessen zu Fehlalarmen führen kann, zeigen wir auch die Reduzierung des Signals aus Laktose mit unterschiedlichen Strategien. Aufgrund der hohen Durchsatz dieser Technik könnte vielen Reaktionsbedingungen oder Bioreaktor Parameter parallel in einer Angelegenheit von Stunden, ermöglicht die Optimierung der HMO Fertigung untersucht.

Einleitung

Muttermilch-Oligosaccharide (HMOs) sind Laktose-abgeleitete Oligosaccharide, meist bestehend aus drei bis acht Zucker Monomere. Sie haben eine Laktose (Gal-β1, 4-Glc) verringern zu beenden und sind weiter durch Glykosid-Links länglich (β-1,3 - oder β-1,6-) Glukose (Glc), Galaktose (Gal) oder N-Acetylglucosamin (GlcNAc). Darüber hinaus Fucose (Fuc, α-1,2 - oder α-1,3-) oder Sialinsäure Säure (Sia oder NeuAc, α-2,3 - oder α-2,6-) Rückstände werden oft1hinzugefügt.

Aktuelle Analyse der Oligosaccharide und anderen Kohlenhydraten wird durch die Notwendigkeit spektrometrische chromatographische/Masse (MS) Technologie2,3,4,5, Durchsatz und Umfang begrenzt. 6 , 7, was ungefähr dauern kann eine Stunde pro Probe, ganz zu schweigen von der Notwendigkeit für teure Ausrüstung, spezielle Spalten und derivatizing Agenten und Know-how über die Funktionsweise dieser Geräte8. Oligosaccharid-Verbindungen sind besonders schwer zu bestimmen, erfordert fortgeschrittene MS9,10 oder Kernspinresonanz (NMR) Techniken11. Schnelle Optimierung der Synthese von diese Oligosaccharide ist somit durch den Durchsatz dieser langsamen analytischen Schritt begrenzt.

In der vorliegenden Studie zeigen wir Gestänge-spezifischen Nachweis von Fucosylated Trisaccharide Laktose-basierte HMOs, mit Schwerpunkt auf 2'-Fucosyllactose (2'-FL), die am häufigsten vorkommende HMO in der Muttermilch ist, mit Hilfe einer genetisch codierte Escherichia coli ganze Zelle Biosensor mit einem Limit von Erkennung bei 4 mg/L. Ein wichtiges Merkmal dieser Biosensor ist seine Fähigkeit, zwischen Isomeren Trisaccharides unterscheiden. Das Konstruktionsprinzip basiert auf die Expression von bestimmten Fucosidases in E. Coli , die Laktose von HMOs, befreien das Vorhandensein von Lac -Operon, erkannt wird, die wiederum ein Fluoreszenzsignal erzeugt. Dies erreichen wir durch den Bau eines zwei-Plasmid-System, ein beherbergen die Gestänge-spezifische Fucosidase und andererseits eine fluoreszierende Reporter-Protein. Diese Biosensor-Plattform eignet sich für Hochdurchsatz-Screening von Durchflusszytometrie oder Mikro-Platte-Leser. Wir zeigen auch die Auslastung der Biosensor in 2'-FL produziert durch ein veränderter Belastung12zu quantifizieren. Im Rahmen dieser Studie präsentieren wir auch drei Strategien auf selektive Entfernung von Laktose, die false positives Signal aus der Biosensor ergeben können, angesichts der Tatsache, dass die technische Produzent Belastung auf Laktose angebaut wird.

Zusammen genommen, der genetisch codierten Biosensoren ermöglichen es uns, zu erkennen und zu quantifizieren HMOs Gestänge-spezifisch, die schwer selbst mit chromatographischen, MS oder NMR Techniken. Aufgrund seiner hohen Durchsatz und Benutzerfreundlichkeit sollte diese Methode weit verbreitete Anwendungen in das metabolic Engineering und Synthese von HMOs haben.

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Protokoll

(1) Zelle Kultur und Induktion Bedingungen

Hinweis: In den folgenden Experimenten werden drei Sorten verwendet: E. Coli BL21 (DE3) mit ein leerer Vektor, E. Coli BL21 (DE3) mit Plasmide pAfcA14 und pET28:green fluoreszierenden Proteins (GFP) und E. Coli BL21 (DE3) mit Plasmiden pAfcB14 und pET28:GFP. Alle Stämme wachsen im Luria-Bertani Brühe (LB) oder minimale Medien mit geeigneten Antibiotika. Stammlösungen von 1.000 X Kanamycin (50 mg/mL) und Carbenicillin (100 mg/mL) Wasser in deionisiertes (DI) vorzubereiten.

  1. Medien-Vorbereitung
    1. Bereiten Sie LB Medien durch Zugabe von 25 g LB Pulver bestand bis 1 L DI Wasser vor. Autoklaven die Lösung bei 121 ° C für 20 Minuten sterilisieren. Warten Sie, bis die sterilisierte LB Medien-Temperatur unter 60 ° C vor der Zugabe von 1 µL von Antibiotika Material für jeden 1 mL LB Medien ist.
    2. Fügen Sie 15 g Agar um LB-Platten vorzubereiten hinzu, die LB Medien vor der Sterilisation. Warten Sie, bis die sterilisierte LB-Agar-Temperatur unter 60 ° C vor der Zugabe von Antibiotika ist.
    3. 1.1.3 für die Biosensoren Zellen bereiten Sie Medien oder Platten mit zwei Antibiotika, Kanamycin und Carbenicillin.
  2. Kohlenhydrat-Induktoren
    1. Bereiten Sie Stammlösungen der Kohlenhydrat-Induktoren an Molaren äquivalente 20 g/l Laktose: 29 g/L FL 2' und 3-FL.
      Anmerkung: Jede 200 µL Zellen benötigen 20 µL 2'-FL oder 3-FL.
    2. 200 µL Zellen mit 2,0 g/L Endkonzentration von Laktose oder 2,9 g/L Endkonzentration von 2'-FL/3-FL. Inkubation bei 37 ° C mit kontinuierlichen schütteln zu induzieren und Kulturen über Nacht wachsen zu lassen.
  3. Zellkultur
    1. Samen Sie am Tag vor dem Experiment 5 mL LB-Medium mit Kanamycin und Carbenicillin aus einer frischen bakterielle Kolonie, mit steriler Technik ergänzt.
    2. Alle Kulturen bei 37 ° C unter Rühren inkubieren und Kulturen über Nacht wachsen.
    3. Übertragen Sie 50 µL über Nacht Kultur in 5 mL frisches LB/M9 Medien mit Kanamycin und Carbenicillin. Inkubation bei 37 ° C mit kontinuierlichen schütteln und wachsen bis Kultur, Extinktion bei 600 erreicht hat nm (OD600) von 0,5 – 0,7. In dieser Mitte des Log-Phase können die Zellen induziert werden.

2. Messung der Fluoreszenz und Nachweisgrenzen

  1. Vorbereitung der Zellen für die Durchflusszytometrie
    1. Übertragen Sie die Übernachtung Kulturen auf 1,5 mL Tuben und Zentrifuge bei 12.500 X g für 1 min.
    2. Verwerfen Sie überstand und erneut aussetzen Sie das Pellet in 500 µL 1 X Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS; 6 mM Na2HPO4, 1,8 mM NaH2PO4, 145 mM NaCl in VE-Wasser, pH 7,2) zur Vorbereitung eines einzigen Zellsuspension und übertragen die einzelne Zelle Aussetzung zur 5 mL Flow Cytometry Röhren.
    3. Bewahren Sie die Zellen im Dunkeln bei 4 ° C bis die Proben auf einem Durchflusszytometer ausgeführt. Analysieren Sie für optimale Ergebnisse die Zellen so bald wie möglich.
    4. Wählen Sie 488 nm Laser GFP zu begeistern. Fluorescein erfolgt (FITC) Fluoreszenz Ebenen (20.000 – 40.000 Veranstaltungen, gated für vorwärts- und seitliche Streuung aggregierte Zellen und Ablagerungen zu vermeiden) mit 525/50 nm Bandpassfilter zu sammeln.
  2. Kalibrierung der biosensor
    1. Um eine Kalibrierungskurve zu machen, machen Sie 8 – 10 Verdünnungen des standard 2'-FL in der Reihe 0-2.500 mg/L.
    2. Kulturzellen Sie die 2'-FL Biosensoren (mit pAfcA und pET28:GFP) und bewegen sie mit der standard Verdünnungen, wie zuvor beschrieben in Abschnitt 1.3. Drei biologische Wiederholungen für jede Verwässerung führen.

3. Erkennung und Quantifizierung von 2'-FL in einem Stamm Produzent

  1. Anbau von Produzent Belastung
    1. Für die Herstellung von minimaler Medien, bereiten Sie separate Lösungen von 1 M K2HPO4, FeSO4·7H2O, Natriumcitrat und 1 M Thiamin-HCl. sterilisieren die Lösungen mit einem 0,22 µm-Filter. Mischen Sie M9 Medien Brühe Pulver mit 1 L DI Wasser. Autoklaven die M9-Lösung bei 121 ° C für 15 min. Abkühlen der Lösung bis zu 50 ° C. MgSO4, CaCl2, K2HPO4, FeSO4·7H2O, Natrium-Citrat, und Thiamin, Endkonzentrationen von 2 mM, 0,1 mM, 12 g/L, 11 mg/L, 75 mg/L und 7,5 µg/L, bzw. hinzufügen.
    2. Starten Sie eine Kultur der 2'-FL Belastung, z. B. JM109 GwBC-F2, in 5 mL LB Medien produzieren und lassen es über Nacht bei 37 ° C zu wachsen, wie im Baumgartner Et Al.12beschrieben.
    3. Subkultur bei 1 %, wie weiter oben in Schritt 1.3.3 in 250 mL der minimalen Medien vorbereitet im Schritt 3.1.1 beschrieben. Eine Endkonzentration von 10 g/L Glycerin hinzufügen und die Kultur bei 37 ° c inkubieren
    4. Wenn die Kultur eines OD600 von 0,5 – 0,7 erreicht, fügen Sie Isopropyl β-D-1-Thiogalactopyranoside (IPTG hinzu), eine Endkonzentration von 0,5 mM und Laktose, eine Endkonzentration von 2 g/L.
    5. Inkubation bei 37 ° C mit kontinuierlichen schütteln und Kulturen für 24 h wachsen zu lassen.
  2. Extraktion von 2'-FL
    1. Übertragen Sie die Übernachtung Kulturen steril 50 mL Röhrchen und Zentrifuge bei 900 X g für 15 min.
    2. 3.2.2 verwerfen Sie überstand und erneut aussetzen Sie das Pellet in VE-Wasser. Wiederholen Sie der Waschschritt dreimal, um verbleibende Laktose zu entfernen und schließlich wieder anzuhalten, in 5 mL VE-Wasser.
    3. Um die Zellsuspension zu lösen, verwenden Sie eine Sonikator bei 30 % Leistung, in 30 s-Pulse. Halten Sie die Zellen auf dem Eis, zu allen Zeiten.
    4. Zentrifugieren Sie die lysierten Zellen für 25 min bei 2.000 X g. Den Überstand zu entfernen, führen Sie ihn durch eine sterile (z. B. 0,22 µm) filtern und bis zur Analyse bei 4 ° C lagern.
  3. Quantifizierung mit biosensor
    1. Eine Kultur der 2'-FL Biosensoren Zellen und bei Mid Log-Phase zu impfen, induzieren mit Zelle lysate entspricht der geschätzten Konzentrationen von 2'-FL verwendet, um die Eichkurve zu machen, wie in Abschnitt 2.2 beschrieben. Die Kalibrierung im gleichen Milieu als die zu analysierende Probe durchzuführen (z. B. Zelle lysate) durch Zugabe von Verdünnungen von 2'-FL zu steuern (d. h.-Produzent) gefilterte Zelle lysate vor Biosensor-Zellen induzieren.
    2. Laufen Sie die Proben auf einem Durchflusszytometer. Eine Dosis-Wirkungs-Kurve durch Auftragen der Fluoreszenz-Ausgabe gegen die Oligosaccharid-Konzentration zu erzeugen. Vergleichen Sie die Reaktion der Normen auf die Zelle lysate.

(4) selektive Entfernung von Laktose

Hinweis: Die Biosensoren Zellen reagieren empfindlich auf Laktose und es ist wünschenswert, dass der Biosensor HMOs selektiv über Laktose zu erkennen. Eine Strategie würde Waschen der Zellen enthalten, wie in Abschnitt 3.2 beschrieben. Drei andere Strategien werden nachfolgend beschrieben.

  1. Behandlung mit kommerziellen gereinigten β-Galaktosidase
    1. Lyophilisierter β-Galaktosidase bis 1.000 (FCC Laktase) Einheiten/mL, in 1 mM MgCl2 auflösen oder kommerzielle β-Galaktosidase in Lösung verwenden.
    2. Ermitteln Sie die optimale Konzentration des Enzyms benötigt, ein Inokulum von 2'-FL Biosensoren Zellen wachsen und induzieren mit 2 g/L Laktose und 2,9 g / L 2'-FL achen Mitte Log-Phase.
    3. 100 µL Kulturen Variable Mengen an β-Galaktosidase, bis zu 12 Einheiten, und lassen Sie die Kulturen wachsen über Nacht bei 37 ° C mit kontinuierlichen schütteln.
    4. Messen Sie die Fluoreszenz zu, wie in Abschnitt 2.1 beschrieben und berechnen Sie die optimale Einheiten des Enzyms benötigt, um die minimale Enzym Konzentrationsbestimmung gewünschten Dämpfung des Signals zu erreichen.
    5. 2'-FL produzierenden Zellen gezüchtet für 24 h optimale Einheiten der β-Galaktosidase hinzugeben und über Nacht bei 37 ° c inkubieren Fahren Sie mit dem Protokoll zur Ermittlung der 2'-FL-Titer wie in Abschnitt 3.3 beschrieben.
  2. Vorbehandlung mit LacZ + Stamm
    1. Starten Sie eine 25 mL Kultur der 2'-FL Herstellung von Belastung und einmal bei Mid Log-Phase induzierten, brüten Sie die Kultur bei 37 ° C für 24 h.
    2. Impfen ein E. Coli BL21 (DE3) Kultur in LB, zur Mitte des Log-Phase bei 37 ° C zu wachsen und die 24 h-Kultur 50 mL der Kultur (2:1) hinzufügen.
    3. Inkubation bei 37 ° C für 3 h fahren Sie mit dem Protokoll zur Ermittlung der 2'-FL-Titer wie in Abschnitt 3.3 beschrieben.
  3. Laktose-Fällung mit ethanol
    Anmerkung: Dieser Abschnitt ist von Matsuki Et Al.12angepasst.
    1. Starten Sie eine 25 mL Kultur der 2'-FL Herstellung von Belastung und einmal bei Mid Log-Phase induzierten, Inkubation bei 37 ° C für 24 h.
    2. Fügen Sie zwei Bände von 100 % Ethanol, die Kultur, gut schütteln und Inkubation bei 37 ° C für 4 h.
    3. Zentrifugieren Sie der Federung bei 900 X g für 15 min. sammeln überstand und Inkubation über Nacht bei 4 ° C, was die Laktose ausfällt.
    4. Entfernen Sie die ausgefällte Laktose, indem man die Lösung durch ein Filterpapier (11 µm). Sammeln Sie das Filtrat, das ist die Zelle lysate, enthält der 2'-FL, die von folgenden Abschnitt 3.3 quantifiziert werden kann.

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Ergebnisse

Wir entwarfen eine ganze Zelle Biosensor spezifisch für 2'-FL, die in Verbindung mit der biotechnologischen Produktion von der Oligosaccharid verwendet werden kann. Diese stützt sich auf die spezifische enzymatische Spaltung terminal Zucker erzeugen Laktose zu verändern und somit Aktivierung des Lac -Operon, führt zum Ausdruck eines Reporter fluoreszierenden Proteins unter einer Laktose induzierbaren Promoter, im Verhältnis zu den Menge von 2'-FL. Um seine Besonderheit Gestänge, ...

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Diskussion

Wir präsentieren eine Hochdurchsatz-Strategie für die Gestänge-spezifische Erkennung des Fucosylated der Muttermilch-Oligosaccharide. Dies wurde erreicht durch den Bau der ganzen Zelle Biosensoren durch genetisch Technik Escherichia Coli die auf Induktion mit spezifischen Glykane mit ein Fluoreszenzsignal reagieren. Das Protokoll auch details wie der Biosensor zu erkennen und zu quantifizieren HMOs in ein metabolisch veränderter Bakterienstamm eingesetzt werden kann.

Unser Protokoll b...

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Offenlegungen

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Danksagungen

Diese Arbeit wurde von Iowa State University Startup Fonds unterstützt. Z.B. wurde teilweise durch die NSF Trinect Fellowship und Manley Hoppe Professur finanziert. T.J.M. wurde teilweise von Karen und Denny Vaughn Faculty Fellowship unterstützt. Die Autoren danken die Iowa State Universität Flow Cytometry Anlage und des w.m. Keck Metabolomik Forschungslabors für Hilfe mit Fluoreszenz und LC-MS-Studien.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
2'-Fucosyllactose Carbosynth 41263-94-9
3-Fucosyllactose Carbosynth 41312-47-4
AgarFisherScientific BP9744500
Calciumchlorid, DihydratFisher ScientificC79-500
Carbenicillin Fisher ScientificBP26481
Dextrose (D-Glukose), wasserfreiFisher ScientificD16-1
DurchflusszytometerBDFACSCanto Plus RUO
HPLC AgilentTechnologies1100 Serie HPLC-System
HPLC-Säule LunaC18 Umkehrphasensäule
KanamycinFisher Scientific
LB Broth, Müller Fisher Scientific12-795-027
LaktoseFisher Scientific64044-51-5
M9, Minimmale Salze, 5xSigma-AldrichM6030
Magnesiumsulfat, wasserfreiFisher ScientificM65-500
MSAgilent TechnologiesMass Selective Trap SL Detektor
NatriumchloridSigma-Aldrich7647-14-5
Natriumphosphat zweibasischSigma-Aldrich7558-79-4
Natriumphosphat einbasischSigma-Aldrich13472-35-0
11815024

Referenzen

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Nachdrucke und Genehmigungen

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