Methodenartikel

Bildgebung von extrazellulären Vesikeln durch Atomkraftmikroskopie

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DOI:

10.3791/59254

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11. September 2019

 , 
1Department of Chemical Engineering, University of Utah, 2The Nano Institute of Utah, University of Utah, 3Center for Photonics and Quantum Materials, Skolkovo Institute of Science and Technology, 4Biopharmaceutical Cluster 'Northern', Moscow Institute of Physics and Technology

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Zur etikettenfreien Immobilisierung von Exosomen und extrazellulären Vesikeln aus flüssigen Proben und deren Bildgebung mittels Atomkraftmikroskopie (AFM) wird ein Schritt-für-Schritt-Verfahren beschrieben. Die AFM-Bilder werden verwendet, um die Größe der Vesikel in der Lösung zu schätzen und andere biophysikalische Eigenschaften zu charakterisieren.

Zusammenfassung

Exosomen und andere extrazelluläre Vesikel (EVs) sind molekulare Komplexe, die aus einem Lipidmembranvesikel, seiner Oberflächendekoration durch Membranproteine und anderen Molekülen und einem vielfältigen Luminalgehalt bestehen, der von einer übergeordneten Zelle geerbt wird, zu der RNAs, Proteine und DNAs. Die Charakterisierung der hydrodynamischen Größen von Elektrofahrzeugen, die von der Größe des Vesikels und seiner durch Oberflächendekorationen gebildeten koronalen Schicht abhängt, ist zur Routine geworden. Bei Exosomen, dem kleinsten EVs, ist der relative Unterschied zwischen der hydrodynamischen und der Vesikelgröße signifikant. Die Charakterisierung von Vesikelgrößen durch die kryogene Transmissionselektronenmikroskopie (Kryo-TEM), eine Goldstandard-Technik, bleibt aufgrund der Kosten des Instruments, des für die Probenvorbereitung, Bildgebung und Datenanalyse und eine kleine Anzahl von Partikeln, die häufig in Bildern beobachtet werden. Eine weit verbreitete und zugängliche Alternative ist die Atomkraftmikroskopie (AFM), die vielseitige Daten über dreidimensionale Geometrie, Größe und andere biophysikalische Eigenschaften extrazellulärer Vesikel erzeugen kann. Das entwickelte Protokoll führt die Anwender bei der Nutzung dieses Analysetools und skizziert den Workflow für die Analyse von Elektrofahrzeugen durch den AFM, der die Probenvorbereitung für bildgebende Elektrofahrzeuge in hydratisierter oder ausgetrockneter Form, die elektrostatische Immobilisierung von Vesikel auf einem Substrat, Datenerfassung, deren Analyse und Interpretation. Die repräsentativen Ergebnisse zeigen, dass die Fixierung von Elektrofahrzeugen auf der modifizierten Glimmeroberfläche vorhersagbar und anpassbar ist und es dem Benutzer ermöglicht, Größenergebnisse für eine große Anzahl von Vesikeln zu erhalten. Die Vesikelgröße auf Basis der AFM-Daten stellte sich heraus, dass sie mit der Kryo-TEM-Bildgebung übereinstimmt.

Einleitung

Extrazelluläre Vesikel (EVs) sind in allen Körperflüssigkeiten vorhanden, einschließlich Blut, Urin, Speichel, Milch und der Fruchtwasser. Exosomen bilden eine Bezirksklasse von Elektrofahrzeugen, die sich durch endosomale Biogenese, die Marker des endosomalen Weges und die kleinste Größe unter allen Elektrofahrzeugen von anderen Elektrofahrzeugen unterscheiden. Die Größe der Exosomen wird oft mit erheblichen Schwankungen zwischen den Studien berichtet. Die Größenergebnisse waren methodisch abhängig, was den Unterschied in den physikalischen Prinzipien widerspiegelt, die von verschiedenen Analysetechniken zur Schätzung der EV-Größen1,2verwendet werden. Beispielsweise schätzt die Nanopartikel-Tracking-Analyse (NTA) – die am weitesten verbreitete Größencharakterisierungstechnik – die Größe von Elektrofahrzeugen als ihre hydrodynamischen Durchmesser, die den Widerstand gegen die Brownsche Mobilität von Elektrofahrzeugen in der Lösung charakterisieren. Ein größerer hydrodynamischer Durchmesser eines Vesikels impliziert seine geringere Beweglichkeit in Flüssigkeit. Die koronale Schicht um Vesikel, bestehend aus Oberflächenproteinen und anderen Molekülen, die an der Membranoberfläche verankert oder adsorbiert werden, behindert die Beweglichkeit erheblich und erhöht die hydrodynamische Größe von Elektrofahrzeugen. Relativ gesehen ist dieser Anstieg besonders groß für die Exosomen3, wie in Abbildung 1dargestellt.

Die kryogene Transmissionselektronenmikroskopie (Kryo-TEM) ist eine definitive Technik zur Charakterisierung von Vesikelgrößen und Morphologie in ihren hydratisierten Zuständen. Die hohen Kosten der Instrumentierung und das für ihre korrekte Verwendung erforderliche Fachwissen motivieren jedoch die Erforschung alternativer Techniken, die hydratisierte Elektrofahrzeuge abbilden können. Eine relativ kleine Anzahl von EVs, die in den erfassten Kryo-TEM-Bildern beobachtet oder charakterisiert werden, ist ein weiterer bemerkenswerter Nachteil dieser Technik.

Die Atomkraftmikroskopie (AFM) visualisiert die dreidimensionale Topographie hydratisierter oder ausgetrockneter Elektrofahrzeuge4,5,6, indem eine Sonde über das Substrat gescannt wird, um das Bild der Partikel auf der Oberfläche zu rastern. Die wesentlichen Schritte des Protokolls zur Charakterisierung von Elektrofahrzeugen durch AFM werden in dieser Studie beschrieben. Bevor die Vesikel in Flüssigkeit abgeglichen werden, müssen sie auf einem Substrat immobilisiert werden, indem sie entweder an eine funktionalisierte Oberfläche binden, in einem Filter einfangen oder durch elektrostatische Anziehung7. Die elektrostatische Fixierung auf einem positiv geladenen Substrat ist eine besonders praktische Option zur Immobilisierung von Exosomen, von der bekannt ist, dass sie ein negatives Zeta-Potenzial hat. Die gleichen elektrostatischen Kräfte, die die extrazellulären Vesikel auf der Oberfläche immobilisieren, verzerren jedoch auch ihre Form, was eine post-imaging-Datenanalyse unerlässlich macht. Wir erarbeiten diesen Punkt, indem wir den Algorithmus beschreiben, der die Größe der Kugelbläschen in der Lösung auf der Grundlage der AFM-Daten über die verzerrte Form der auf der Oberfläche immobilisierten Exosomen schätzt.

Im entwickelten Protokoll wird das Verfahren zur robusten elektrostatischen Immobilisierung von Vesikeln vorgestellt und mit den Schritten verfolgt, die für die Durchführung der Atomkraft-Bildgebung in den hydratisierten oder ausgetrockneten Zuständen erforderlich sind. Die Faktoren, die die Oberflächenkonzentration der immobilisierten Vesikel beeinflussen, werden identifiziert. Es wird die Anleitung gegeben, wie die elektrostatische Immobilisierung für Proben mit unterschiedlichen Konzentrationen von Elektrofahrzeugen in der Lösung durchgeführt werden kann. Diskutiert wird die Auswahl von Versuchsbedingungen, die die Schätzung empirischer Wahrscheinlichkeitsverteilungen verschiedener biophysikalischer Eigenschaften auf der Grundlage einer ausreichend großen Anzahl von immobilisierten Vesikeln ermöglichen. Beispiele für die nach-Imaging-Analyse der AFM-Daten werden angeführt. Insbesondere wird ein Algorithmus zur Bestimmung der Größe von Vesikeln in der Lösung beschrieben, basierend auf der AFM-Charakterisierung von immobilisierten Elektrofahrzeugen. Die repräsentativen Ergebnisse zeigen die Konsistenz der Vesikelgröße durch AFM mit den Ergebnissen der Kryo-TEM-Bildgebung.

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Protokoll

1. Isolierung von Elektrofahrzeugen aus einem Biofluid

  1. Isolieren Sie Elektrofahrzeuge nach einer der etablierten Methoden, z. B. der Differenz-Ultrazentrifugation8, Derfällung oder Größenausschlusschromatographie9.
  2. Bestätigen Sie das Vorhandensein von erwarteten Oberflächen- und Luminal-Biomarkern und das Fehlen von Biomarkern, die auf eine Kreuzkontamination der Zubereitung hinweisen. Bestätigen Sie die Lipid-Bilayer-Morphologie der isolierten Teilchen durch Elektronenmikroskopie.
    HINWEIS: Bei der Isolierung der Exosomen sollte die hydrodynamische Größenverteilung, die durch Nanopartikel-Tracking-Analyse (NTA) oder dynamische Lichtstreuung gemessen wird, im erwarteten Bereich liegen. Die Details der Ev- und Exosomenisolierung gehen über den Rahmen dieses Protokolls hinaus. Die gewählte Methode hängt von experimentellen Fragen und dem Ziel der Studie10ab. Die folgenden Schritte liefern eine konkrete Darstellung des Verfahrens zur Anreicherung der Exosomen durch Niederschlag aus dem Wachstumsmedium von MCF-7 Brustkrebszellen mit einem handelsüblichen Niederschlagssatz (Materialtabelle).
  3. Vor der Zellkulturexpansion, speichern MCF-7 Brustkrebszellen in flüssigem Stickstoff. Tauen Sie Zellen in Subkultur.
  4. Führen Sie nach aseptischen Übungen die Zellbeschichtung auf 150 mm Platten durch. Verwenden Sie das Wachstumsmedium, das aus dem minimalen essentiellen MediumdesAdlers, 0,01 mg/ml humanem rekombinantem Insulin und 10% exosomenfreiem fetalem Rinderserum besteht.
  5. Belüften Sie die Kultur um 95% Luft und 5%CO2 und brüten bei 37 °C.
  6. Nachdem die Zellen sesshaft (ca. 24 h nach der Beschichtung) abgerechnet wurden, ändern Sie das Medium. Teilen Sie die Platte bei 1:10 Verhältnis und Kultur zehn Platten, die jeweils 20 ml Medien enthalten.
  7. Ernte- und Poolmedien von 9 dieser Platten (180 ml) bei einem Zusammenfluss von 70bis80 %, wenn sich die Zellen noch in der Wachstumsphase befinden.
  8. Teilen Sie die Medien in 60 ml und 120 ml auf, weiter aufgeteilt in 30 ml/Rohr und Zentrifuge bei 3.000 x g für 15 min.
  9. Übertragen Sie den Überstand von jedem Rohr auf ein neues steriles 50 ml Rohr und führen Sie die exosome Isolierung durch.
  10. Isolieren Sie Exosomen durch Niederschlag gemäß veröffentlichten Protokollen (siehe z. B. Referenz11) oder folgen Sie den Anweisungen des Herstellers, wenn einkommerzielles Isolationskit(Tabelle der Materialien) verwendet wird. Als ersten Schritt im letzteren Fall, Zentrifugenzellmedium bei 3.000 x g für 15 min. Rückzug Überstand und Entsorgen von Zellen und Zellablagerungen.
  11. Fügen Sie die Niederschlagslösung (1:5 Volumenverhältnis) dem Überstand hinzu, mischen und über Nacht kühlen.
  12. Zentrifuge bei 1.500 x g für 30 min bei Raumtemperatur. Entsorgen Sie den Überstand nach der Zentrifugation.
  13. Drehen Sie das verbleibende Exosomepellet für weitere 5 min bei 1.500 x g. Ohne das Pellet zu stören, entfernen Sie die verbleibende Niederschlagslösung durch Aspiration.
  14. Setzen Sie das Pellet in 100x500 l 1x Phosphat-gepufferter Salzsäurepuffer (PBS) aus und teilen Sie es bei Bedarf für die nachgeschaltete Analyse in mehrere Aliquots auf.
  15. Gehen Sie sofort zur Oberflächenimmobilisierung der isolierten Exosomen für die AFM-Bildgebung über. Falls erforderlich, frieren Sie die Aliquots bei -80 °Cfür die spätere Verwendung ein, während Sie Vorsichtsmaßnahmen treffen, um Schäden an der Probe während des Frost-Tau-Zyklus zu vermeiden.

2. Oberflächenfixierung von extrazellulären Vesikeln

  1. Verwenden Sie starkes doppelseitiges Klebeband, Epoxid oder einen alternativen Klebstoff, um eine Glimmerscheibe fest an einem AFM/Scanning Tunneling Microscope (STM) magnetischer Edelstahl-Probenscheibe zu befestigen.
  2. Cleave Glimmerscheibe mit einem scharfen Rasiermesser oder Gebrauchsmesser, oder durch Befestigen eines Klebebandes an der Oberseite und dann Pealing es aus, um eine Schicht von Material zu entfernen.
    HINWEIS: Beide Methoden sollten eine unberührte Oberfläche offenbaren, indem eine dünne Schicht Glimmer entfernt wird, die zuvor der Umgebung ausgesetzt war. Nach dem Eingriff muss die Befestigung von Glimmer an der AFM/STM-Metallprobenscheibe fest bleiben.
  3. Bei Raumtemperatur die Oberfläche des Glimmers für 10 s mit 100 l von 10 mM NiCl2 Lösung behandeln, die die Oberflächenladung von negativ in positiv ändert.
  4. Blot NiCl2 Lösung mit einem fusselfreien Wisch- oder Blotting-Papier. Waschen Sie die Glimmeroberfläche 3x mit entionisiertem (DI) Wasser und trocknen Sie sie mit einem Strom trockenen Stickstoffs.
    HINWEIS: Es ist eine gute Praxis, die modifizierte Oberfläche mit AFM zu scannen, um zu bestätigen, dass sie frei von Verunreinigungen ist.
  5. Legen Sie die AFM-Probenscheibe mit dem angehängten oberflächenmodifizierten Glimmer in eine Petrischale.
  6. Verdünnen Sie die Exosomenprobe aus Schritt 1.14 mit 1x PBS, um eine Konzentration zwischen 4,0 x 109 und 4,0 x 1010 Partikel pro ml Lösung zu erhalten. Validieren Sie die verdünnte Partikelkonzentration mit NTA.
  7. Bilden Sie einen sessilen Tropfen auf der Oberfläche des Glimmers, indem Sie 100 l der verdünnten Exosomenlösung aus einer Pipette entleeren.
  8. Deckel auf die Petrischale legen und mit einem Paraffinfilm versiegeln, um die Probenverdunstung zu reduzieren. Inkubieren Sie die Probe für 12x18 h bei 4 °C.
    HINWEIS: Die Oberflächendichte der immobilisierten Exosomen wird mit der Inkubationszeit und der Konzentration von Elektrofahrzeugen in der Flüssigkeit zunehmen. Eine längere Inkubationszeit kann erforderlich sein, wenn Exosomen in der Probe in niedrigeren Konzentrationen vorhanden sind.
  9. Nach der Inkubation 80bis90 % der Probe aspirieren, ohne die Oberfläche zu stören. An dieser Stelle werden die Exosomen elektrostatisch immobilisiert auf dem Glimmersubstrat.
  10. Vor der Abbildung hydratisierter Elektrofahrzeuge spülen Sie die Oberfläche mit 1x PBS ab. Wiederholen Sie 3x. Achten Sie darauf, die Probe während des Spülvorgangs hydratisiert zu halten.
  11. Nach dem Waschen der Glimmeroberfläche mit 1x PBS, entfernen Sie 80%90%der Flüssigkeit, und Pipette 40 l frische 1x PBS, um die Probe zu bedecken.
  12. Bei der Abbildung der ausgetrockneten Elektrofahrzeuge spülen Sie das Substrat mit DI-Wasser ab. Wiederholen Sie 3x.
    HINWEIS: Das Spülen mit DI-Wasser verhindert die Bildung von Salzkristallen und die Ablagerung von Gelösten auf der Oberfläche, wenn das Substrat trocknet.
  13. Vor der Abbildung ausgetrocknete Elektrofahrzeuge, aspirieren Sie so viel Flüssigkeit wie möglich, ohne die Oberfläche zu berühren und trocknen Sie den Rest mit einem Strom von trockenem Stickstoff.

3. AFM-Bildgebung

  1. Um die ausgetrockneten Elektrofahrzeuge abzubilden, wählen Sie einen Freischwinger aus, der für das Scannen in der Luft in abstichenden und berührungslosen Bildgebungsmodi entwickelt wurde, und montieren Sie ihn auf den Sondenhalter.
    ANMERKUNG: Die Merkmale eines Beispielauslegers, der in der Stofftabelle aufgeführt ist (123 m Länge, 40 m Breite, 7 nm Spitzenradius und 37 N/m Federkonstante), können als Richtschnur bei der Auswahl einer Sonde verwendet werden, die mit der verfügbaren AFM-Instrumentierung kompatibel ist.
    1. Platzieren Sie die Vorbereitung ab Schritt 2.13 auf der AFM-Bühne. Die magnetische Edelstahl-Probenscheibe wird die Probe auf der Bühne immobilisieren. Geben Sie Zeit für die Vorbereitung und die Bühne, um thermisch auszueinemt.
    2. Verwenden Sie den Tippmodus, um eine ausreichendgroße Fläche der Glimmeroberfläche zu scannen. Wählen Sie z. B. eine Fläche von 5 x 5 m aus, gerastert in 512 Zeilen mit einer Scanrate von 1 Hz. Erfassen Sie sowohl die Höhen- als auch die Phasenbilder, da sie ergänzende Informationen über die Topographie und die Oberflächeneigenschaften der Probe liefern.
      HINWEIS: Die Scanzeit wird mit dem abgebildeten Bereich und der Anzahl der Linien, die für die Bildbildung ausgewählt wurden, erhöht, verringert sich jedoch mit der Scanrate, die als Anzahl der pro Sekunde gescannten Zeilen definiert ist. Schnelle Scanraten können sich auf die Bildqualität auswirken. Daher sollte die Geschwindigkeit des Rasterns den Kompromiss zwischen der Erfassungszeit und der Bildqualität juristisch ausgleichen.
  2. Um hydratisierte Vesikel abzubilden, wählen Sie einen Ausleger aus, der zum Scannen weicher, hydratisierter Proben geeignet ist, und montieren Sie den Ausleger auf einen Sondenhalter, der für das Scannen in Flüssigkeiten entwickelt wurde.
    ANMERKUNG: Bei der Auswahl einer Sonde, die mit der verfügbaren AFM-Instrumentierung kompatibel ist, werden die Spezifikationen der Sonde in der Tabelle der Werkstoffe aufgeführt (dreieckiger Ausleger mit 175 m Nennlänge, 22 m Breite, 20 nm Spitzenradius, 0,07 N/m Federkonstante und optimiert für die Bildgebung mit der Antriebsfrequenz im Bereich zwischen 4 und 8 kHz) kann als Leitfaden verwendet werden.
    1. Befeuchten Sie die Spitze des Auslegers mit 1x PBS, um die Wahrscheinlichkeit zu verringern, dass Luftblasen während des Scannens in die Flüssigkeit eingeführt werden.
    2. Stellen Sie die Vorbereitung ab Schritt 2.11 auf die AFM-Bühne. Die magnetische Edelstahl-Probenscheibe wird die befestigte Glimmer mit immobilisierten Elektrofahrzeugen auf ihrer Oberfläche immobilisieren.
    3. Geben Sie Zeit für die Vorbereitung und die AFM-Stufe, um thermisch auszueinem.
    4. Stellen Sie die hydratisierte Glimmeroberfläche im Abstichmodus ab. Erfassen Sie sowohl die Höhen- als auch die Phasenbilder.
      HINWEIS: Die Bildqualität wird durch die Instrumentierung, die ausgewählten Sonden- und Scanparameter beeinflusst. Bei der Optimierung der Scan-Bedingungen können die folgenden Optionen als Ausgangspunkt verwendet werden: 5 x 5 m Fläche, die in 512 Zeilen mit einer Scanrate von 0,8-1,0 Hz und einer Laufwerksfrequenz zwischen 4 und 8 kHz gescannt wird.

4. Bildanalyse

HINWEIS: Die folgenden Datenverarbeitungs- und Analyseschritte werden auf die erfassten Höhenbilder angewendet. Ein ähnliches Verfahren kann angepasst werden, um die Phasendaten zu analysieren. Die folgende Beschreibung ist spezifisch für Gwyddion12, eine kostenlose und Open-Source-Software, die unter GNU General Public License verfügbar ist. Ähnliche Funktionen sind in alternativen Software-Tools verfügbar.

  1. Gehen Sie zu Datenprozess, SPM-Modi, Tipp und wählen Sie Modelltipp (Abbildung 2). Wählen Sie die Geometrie und die Bemaßungen der Spitze aus, mit der das Beispiel scannt, und klicken Sie auf OK.
  2. Korrigieren Sie die Spitzenerosionsartefakte, indem Sie die Oberflächenrekonstruktion durchführen. Öffnen Sie das Bild. Wählen Sie im Menü Datenprozess, SPM-Modi, Tipp, dann wählen Sie Oberflächenrekonstruktion und klicken Sie auf OK (Abbildung 3).
  3. Richten Sie die Bildebene an die XY-Ebene des Labors aus, indem Sie die Neigung im Substrat aus den Scandaten entfernen. Um diese Aufgabe zu erfüllen, wählen Sie Datenprozess, Ebene und Ebene Ebene (Abbildung 4).
  4. Richten Sie Die Zeilen des Bildes aus, indem Sie Data Process, Correct Data and then choose Align Rows auswählen. Es stehen mehrere Ausrichtungsoptionen zur Verfügung (Abbildung 5). Median ist z. B. ein Algorithmus, der eine durchschnittliche Höhe jeder Scanzeile findet und von den Daten subtrahiert.
  5. Wechseln Sie zu Datenprozess, Korrigieren von Daten und wählen Sie Narben entfernen (Abbildung 6), wodurch häufige Scanfehler entfernt werden, die als Narben bezeichnet werden.
  6. Richten Sie die Glimmeroberfläche auf der Nullhöhe, Z = 0, aus, indem Sie im Dropdown-Menü Ebene abflachen, auf das sie über den Datenprozess zugreifen kann (Abbildung 7).
  7. Identifizieren Sie EVs auf der gescannten Oberfläche mithilfe des Dropdown-Menüs Markierung nach Schwellenwert im Dropdown-Menü Körner (Abbildung 8A). Dieser Algorithmus identifiziert oberflächenimmobilisierte Exosomen als Partikel, die aus dem Null-Oberflächen-Substrat durch die Höhe über dem vom Benutzer gewählten Schwellenwert herausragen. Wählen Sie einen Schwellenwert im Bereich zwischen 1 und 3 nm aus, wodurch die meisten Hintergrundinterferenzen eliminiert werden. Kleinere Schwellenwerte werden mit saubererem Hintergrund verwendet.
    HINWEIS: Der Schwellenwert in Abbildung 8A beträgt 1.767 nm. Das Ergebnis der MCF-7-Exosomenidentifikation mit dieser Schwelle ist in Abbildung 8Bdargestellt. Gwyddion bietet mehrere Alternativen zum Schwellenwert als Algorithmus zur automatischen Identifizierung von Vesikel nakelten Im bilden, einschließlich automatisierter Schwellenwerte (Otsu-Methode), Kantenerkennung und dem Wendepunktalgorithmus.
    HINWEIS: Partikelagglomerate, sofern sie im AFM-Bild vorhanden sind, können maskiert und von der Analyse ausgeschlossen werden.
  8. Führen Sie die geometrische und dimensionale Charakterisierung der identifizierten Elektrofahrzeuge mithilfe der verfügbaren Verteilungsalgorithmen durch, auf die über das Menü Körner zugegriffen werden kann.
    HINWEIS: Gwyddion bietet Werkzeuge zur Bewertung der Verteilung von skalaren, arealen, volumetrischen und anderen Eigenschaften von immobilisierten Elektrofahrzeugen in einem hydratisierten oder dessikierten Zustand. Ein Beispiel für eine Skalarwerteigenschaft ist in Abbildung 9dargestellt, die die Verteilung der maximalen Höhen innerhalb des Footprints jedes identifizierten Exosomens angibt.
  9. Exportieren Sie die AFM-Daten aus Gwyddion für eine spezielle Analyse durch andere Rechenwerkzeuge und benutzerdefinierte Computerprogramme.

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Ergebnisse

Die Oberflächenfixierung von Elektrofahrzeugen ist ein wichtiger Schritt in der Bildsequenz. Die elektrostatische Oberflächenimmobilisierung von Exosomen, von der bekannt ist, dass sie ein negatives Zeta-Potenzial hat, wird robust auftreten, nachdem das Substrat des Glimmers modifiziert wurde, um eine positive Oberflächenladung zu haben. Ohne die Behandlung mit NiCl2, um positive Oberflächenveränderungen zu vermitteln, erwies sich die Immobilisierung von Elektrofahrzeugen auf dem Substrat als unwirksam. Das Hö...

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Diskussion

Die Immobilisierung von Elektrofahrzeugen aus einer biologischen Flüssigkeit, Oberflächenscans und Bildanalysen sind die wesentlichen Schritte des entwickelten Protokolls zur AFM-Charakterisierung von Elektrofahrzeugen in Flüssigkeiten. Die Anzahl der Vesikel, die AFM-Bildwaagen mit der abgebildeten Oberfläche und der auf dem Substrat immobilisierten Oberflächenkonzentration der Vesikel zugänglich sind. Angesichts eines negativen Zeta-Potenzials von Elektrofahrzeugen und Exosomen18befürworten wir ...

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Offenlegungen

Die Autoren haben nichts zu verraten.

Danksagungen

Die Autoren würdigen die finanzielle Unterstützung der National Science Foundation (Preisnummer IGERT-0903715), der University of Utah (Department of Chemical Engineering Seed Grant und Graduate Research Fellowship Award) und des Skolkovo Institute of Science. technologie (Skoltech Fellowship).

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
AFM/STM-Steuerung BrukerMultimode Nanoscope VDieser AFM-Controller unterstützt die Bildgebung biologischer Proben in Flüssigkeit und Luft.
AFM/STM Probenscheiben aus Metall (10 mm)TedPella16207Probenscheibe aus Metall, an der eine Glimmerscheibe mit einem doppelseitigen Klebeband oder auf andere Weise befestigt wird.
AFM/STM Glimmerscheiben (10 mm)TedPella50Hochwertigster V1-Glimmer, 0,21 mm (0,0085") dick. Interleaved, in 10er-Packungen. Kann auf AFM/STM-Scheiben montiert werden. Erhältlich in vier Durchmessern
AFM-Sonde für die Bildgebung in der LuftBrukerTESP-V2Hochwertige Sonden aus geätztem Silikon für den Abklopfmodus und den berührungslosen Modus für das Scannen in der Luft.
AFM-Sonde für die Bildgebung weicher Proben in FlüssigkeitBrukerMLCTSoft-Siliziumnitrid-Cantilever mit Siliziumnitrid-Spitzen, die sich gut für den Flüssigbetrieb eignen. Der Bereich der Kraftkonstanten ermöglicht es dem Anwender, extrem weiche Proben im Kontaktmodus sowie in der Spektroskopie mit hoher Last und Entfernung abzubilden.
Doppelseitiges KlebebandSpectrum360-77705Wird verwendet, um die Glimmerscheibe auf der Metallprobenscheibe zu befestigen.
ExoQuick-TCSystem BiosciencesEXOTC50A-1ExoQuick-TC ist ein proprietäres Kit auf Polymerbasis, das für die Isolierung von Exosomen aus Gewebekulturmedien entwickelt wurde.
Glassonden-AFM-Halter für die Bildgebung in flüssigenBruker  MTFML-V2Dieser Sondenhalter aus Glas ist für das Scannen in Flüssigkeit mit dem MultiMode AFM konzipiert. Der Halter kann im Spitzenkraft-Klopfmodus, im Kontakt-Modus, im Klopfmodus und in der Kraftmodulation verwendet werden. Die Sonde wird akustisch von einem separaten Piezo-Oszillator für eine größere Amplitudenmodulation angetrieben. Der Halter wird mit zwei Anschlüssen, den erforderlichen Armaturen und einem Zubehörsatz zum Hinzufügen und Entfernen von Flüssigkeiten geliefert.
Tschechisches MetrologieinstitutGwyddionVersion 2.52Open Source Software zur Visualisierung und Analyse von Datenfeldern, die mit Rastersondenmikroskopie-Techniken gewonnen werden.
Fusselfreies LöschpapierGE Healthcare Whatman Löschpapier der Güteklasse GB003Verwenden Sie dieses Löschpapier, um NiCl2 nach der Modifikation des Glimmersubstrats zu entfernen.  
Fusselfreie ReinraumtücherTexwipeAlphaWipe TX1004Verwenden Sie diese Polyestertücher für die Oberflächenreinigung.
Nickel(II)-chlorid (NiCl2)Sigma-Aldrich339350Pulver zur Herstellung von 10 mM NiCl2 in DI-Wasser
Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (1x)Gibco10010023PBS, pH 7,4
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Referenzen

  1. Chernyshev, V. S., et al. Size and shape characterization of hydrated and desiccated exosomes. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 407, 3285-3301 (2015).
  2. Ramirez, M. I., et al. Technical challenges of working with extracellular vesicles. Nanoscale. 10, 881-906 (2018).
  3. Skliar, M., et al. Membrane proteins significantly restrict exosome mobility. Biochemical and Biophysical Research Communications. 501, 1055-1059 (2018).
  4. Parisse, P., et al. Atomic force microscopy analysis of extracellular vesicles. European Biophysics Journal. 46, 813-820 (2017).
  5. Ito, K., et al. Host Cell Prediction of Exosomes Using Morphological Features on Solid Surfaces Analyzed by Machine Learning. Journal of Physical Chemistry B. 122, 6224-6235 (2018).
  6. Sharma, S., LeClaire, M., Gimzewski, J. K. Ascent of atomic force microscopy as a nanoanalytical tool for exosomes and other extracellular vesicles. Nanotechnology. 29, 132001(2018).
  7. Meyer, R. L. Immobilisation of living bacteria for AFM imaging under physiological conditions. Ultramicroscopy. 110, 1349-1357 (2010).
  8. Théry, C., Amigorena, S., Raposo, G., Clayton, A., et al. Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids. Current protocols in cell biology. Chapter 3 (Unit 3.22), (2006).
  9. Taylor, D. D., Zacharias, W., Gercel-Taylor, C. Exosome isolation for proteomic analyses and RNA profiling. Methods in Molecular Biology. 728, 235-246 (2011).
  10. Théry, C., et al. Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines. Journal of Extracellular Vesicles. 8, 1535750(2019).
  11. Weng, Y., et al. Effective isolation of exosomes with polyethylene glycol from cell culture supernatant for in-depth proteome profiling. The Analyst. 141, 4640-4646 (2016).
  12. Nečas, D., Klapetek, P. Gwyddion: an open-source software for SPM data analysis. Open Physics. 10, 181-188 (2012).
  13. Hsueh, C., Chen, H., Gimzewski, J. K., Reed, J., Abdel-Fattah, T. M. Localized nanoscopic surface measurements of nickel-modified Mica for single-molecule DNA sequence sampling. ACS Applied Materials and Interfaces. 2, 3249-3256 (2010).
  14. Conde-Vancells, J., et al. Characterization and comprehensive proteome profiling of exosomes secreted by hepatocytes. Journal of Proteome Research. 7, 5157-5166 (2008).
  15. Zhou, Y., et al. Exosomes released by human umbilical cord mesenchymal stem cells protect against cisplatin-induced renal oxidative stress and apoptosis in vivo and in vitro. Stem Cell Research & Therapy. 4, 34(2013).
  16. Coleman, B. M., Hanssen, E., Lawson, V. A., Hill, A. F. Prion-infected cells regulate the release of exosomes with distinct ultrastructural features. FASEB Journal. 26, 4160-4173 (2012).
  17. Briegel, A., et al. Universal architecture of bacterial chemoreceptor arrays. Proceedings of the National Academy of Sciences. 106, 17181-17186 (2009).
  18. Akagi, T., et al. On-Chip Immunoelectrophoresis of Extracellular Vesicles Released from Human Breast Cancer Cells. PLOS ONE. 10, e0123603(2015).
  19. Sharma, S., et al. Structural-mechanical characterization of nanoparticle exosomes in human saliva, using correlative AFM, FESEM, and force spectroscopy. ACS Nano. 4, 1921-1926 (2010).
  20. Radeghieri, A., et al. Cultured human amniocytes express hTERT, which is distributed between nucleus and cytoplasm and is secreted in extracellular vesicles. Biochemical and Biophysical Research Communications. 483, 706-711 (2017).
  21. Woo, J., Sharma, S., Gimzewski, J. The Role of Isolation Methods on a Nanoscale Surface Structure and Its Effect on the Size of Exosomes. Journal of Circulating Biomarkers. 5, 11(2016).
  22. Deegan, R. D., et al. Capillary flow as the cause of ring stains from dried liquid drops. Nature. 389, 827-829 (1997).
  23. Johnson, C. A., Lenhoff, A. M. Adsorption of Charged Latex Particles on Mica Studied by Atomic Force Microscopy. Journal of Colloid and Interface Science. 179, 587-599 (1996).
  24. Pastré, D., et al. Adsorption of DNA to Mica Mediated by Divalent Counterions: A Theoretical and Experimental Study. Biophysical Journal. 85, 2507-2518 (2003).
  25. van der Pol, E., Böing, A. N., Harrison, P., Sturk, A., Nieuwland, R. Classification, functions, and clinical relevance of extracellular vesicles. Pharmacological Reviews. 64, 676-705 (2012).

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Exosomen ImagingVesikelgr enbestimmungelektrostatische ImmobilisierungModifikation von Glimmeroberfl chenAnalyse hydratisierter ProbenAnalyse getrockneter ProbenAFM DatenverarbeitungCryoTEM Vergleich

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