Analyse der mitochondrialen Atmung Kette-komplexe in kultivierten menschlichen Zellen mit blauen Native Polyacrylamid-Gelelektrophorese und Immunoblotting

Zusammenfassung

Dieses Protokoll zeigt die Analyse der mitochondrialen Atmungskette komplexe durch blaue native Polyacrylamid Gelelektrophorese. Hier wird die Methode angewendet, kultivierten menschlichen Zellen beschrieben.

Zusammenfassung

Mitochondriale Atmung erfolgt durch Oxidative Phosphorylierung (OXPHOS) komplexe innerhalb der Mitochondrien. Interne und Umweltfaktoren können die Montage und die Stabilität des OXPHOS-Komplexe durcheinanderbringen. Dieses Protokoll beschreibt die Analyse der mitochondrialen Atmungskette komplexe durch blaue native Polyacrylamid Gelelektrophorese (BN-Seite) in Anwendung auf kultivierten menschlichen Zellen. Mitochondrien von den Zellen mittels Digitonin extrahiert werden, zunächst mit Natriumlaurylsulfat Maltosid intakt OXPHOS-Komplexe sind von der mitochondrialen Membranen isoliert. Die OXPHOS-Komplexe sind dann durch Gradienten Gelelektrophorese in Anwesenheit der negativ geladenen Farbstoff Coomassie Blau, gelöst, die verhindert Proteinaggregation und sorgt für elektrophoretische Mobilität Proteinkomplexe in Richtung der Kathode. Zu guter Letzt werden die OXPHOS-Komplexe vom standard Immunoblotting erkannt. BN-Seite ist also eine bequeme und preiswerte Technik, die verwendet werden kann, um die Montage der gesamten OXPHOS-Komplexe, im Gegensatz zu den grundlegenden SDS-PAGE erlaubt die Studie nur einzelne OXPHOS Komplexe Untereinheiten zu bewerten.

Einleitung

Mitochondrien sind multifunktionale Organellen spielen eine wichtige Rolle bei der Energiegewinnung, Regulierung des Zellstoffwechsels, Signaltechnik, Apoptose, Alterung, etc.^1,2,3. Die Energieproduktion in den Mitochondrien stützt sich auf die Oxidative Phosphorylierung-Funktion, die Atmung mit der ATP-Synthese Paare. In menschlichen Zellen besteht die Mitochondrien Oxidative Phosphorylierung System (OXPHOS) aus fünf komplexe. Komplexe I bis IV erstellen eine elektrochemischen Proton Steigung in den mitochondrialen Intermembran Raum, der durch komplexe V verwendet wird, um ATP zu produzieren. Jede komplexe OXPHOS ist Multimeric und außer Komplex II, bestehend aus den Untereinheiten von Kern- und mitochondriale Gene kodiert. Mängel in der Kernkomponenten der OXPHOS-Komplexe, die durch Mutationen oder Umweltstress können die Montage und die Funktionalität des Systems Oxidative Phosphorylierung durcheinanderbringen. Darüber hinaus erfordert die richtige Montage der funktionalen OXPHOS-Komplexe eine große Anzahl von Montage Faktoren^4,5,6.

Blaue native Polyacrylamid Gelelektrophorese (BN-Seite) ist eine grundlegende Technik ermöglicht Analyse von Proteinkomplexen intakt und kann verwendet werden, um die Montage der OXPHOS-Komplexe zu studieren. Erstens sind Mitochondrien isoliert aus den Zellen von Digitonin, ein mildes Reinigungsmittel, das die Plasmamembran der Zellen permeabilizes. Dann werden mithilfe von Natriumlaurylsulfat Maltosid OXPHOS-Komplexe aus den mitochondrialen Membranen freigegeben. Mithilfe von Gradienten Gelelektrophorese werden die OXPHOS-Komplexe nach ihrer Masse getrennt. Coomassie Blau G-250 (nicht R-250) der Probenpuffer und den blauen Kathode Puffer hinzugefügt distanziert sich Waschmittel-labile Verbände aber individuelle Atmungskette komplexe intakt⁸bewahrt. Während der Elektrophorese wird der blauen Kathode-Puffer mit Farbstoff von der Kathode Puffer ohne Farbstoff, sorgt für effiziente Übertragung der OXPHOS-Komplexe an der PVDF-Membran-⁸ersetzt. Um OXPHOS-Komplexe zu visualisieren, ist die PVDF-Membran sequenziell mit Antikörpern, die entsprechend der gewählten Untereinheiten der fünf OXPHOS Komplexe inkubiert.

Mit einigen Änderungen hier beschriebene Methode kann auf alle kultivierten Zellen angewendet werden. Darüber hinaus kann diese Methode für die Analyse der OXPHOS-Komplexe in den Mitochondrien von Gewebe Proben⁹isoliert verwendet werden. BN-Seite benötigt mindestens 5-10 µg von Mitochondrien für jede Probe pro Durchlauf. Mit der beschriebenen Methode hier, 500.000 kultivierte Zellen wie HEK293, SH-SY5Y oder 143B Zellen können Ausbeute ca. 10 µg der Mitochondrien. Allerdings hängt eine ausreichende Menge der Zellen für die BN-Analyse von bestimmten Zelltyp.

Die am häufigsten verwendete Methode zur mitochondrialen OXPHOS-Proteine zu studieren ist SDS-PAGE und westliche Beflecken. SDS-PAGE jedoch kann nur einzelne OXPHOS-Untereinheiten zu studieren und im Gegensatz zu den BN-Seite kann nicht verwendet werden, um die Montage des gesamten OXPHOS-Komplexe zu bewerten. Klar Native-Seite trennt Proteinkomplexe in native Bedingungen ohne die Anwesenheit von negativ geladenen Farbstoff und hat eine deutlich niedrigere Auflösung im Vergleich zu BN-Seite. Klar Native-Seite ist jedoch milder als BN-Seite, so dass es labile supramolekulare Baugruppen von Proteinkomplexen wie OXPHOS Supercomplexes behalten kann, die unter den BN-Seite Bedingungen¹⁰getrennt sind. In diesem Protokoll wird der gradient Gel verwendet, um komplexe zu trennen; jedoch kann alternativ-Gradient Trennung verwendet werden, wenn der relativ teure Farbverlauf Maker nicht verfügbar¹¹ist.

Wichtig ist, die hier beschriebene Methode erlaubt die Montage des OXPHOS-Komplexe, zu analysieren, während die Funktionalität der Anlagen nicht bewertet wird. Eine hochauflösende BN-Seite gefolgt von in-Gel-Aktivität Assay¹¹ sowie spektralfotometrische enzymatische Aktivität Assay der mitochondrialen komplexe¹² sind effiziente Techniken für die Funktionsanalyse der OXPHOS-Komplexe. Jedoch beide Methoden nicht die Versammlung des OXPHOS-Komplexe assay.

BN-Seite ist somit die optimale Methode, um die Montage der einzelnen OXPHOS-Komplexe zu untersuchen. Zum Beispiel sind einige mitochondrialen Erkrankungen, wie z. B. Leber hereditäre optische Neuropathie (LHON), mitochondriale Enzephalopathie mit Laktatazidose und Schlaganfall-ähnlichen Episoden (MELAS), veränderte Assembly eine oder mehrere Komponenten von der OXPHOS zugeordnet System⁵. Mithilfe der beschriebenen Methode der BN-Seite hier, können die molekularen Mechanismen der mitochondrialen Erkrankungen untersucht werden.

Protokoll

SpaNOTE: dieses Protokoll basiert auf einer zugehörigen Publikation von Hilander Et Al.¹³ .

1. Vorbereitung der Puffer und Lösungen

Hinweis: Die Puffer und Lösungen in das Protokoll sind in Tabelle 1zusammengefasst. Die angegebenen Mengen der Puffer sind ausreichend vorzubereiten und 10 Proben laufen. Der Puffer können bis zu einem Jahr bei + 4 ° C aufbewahrt werden.

1. Bereiten Sie 20 mL 3 x Gel-Puffer mit 1,5 M Aminocapronsäure, 150 mM Bis-Tris in destilliertem Wasser (dH₂O vor). PH-Wert auf 7,0 einstellen.
2. Vorbereitung 10 mL 2 M Aminocapronsäure dH₂O.
3. 1 mL der mitochondrialen Puffer durch die Kombination der folgenden vorbereiten: 0,5 mL 3 x Gel-Puffer, 0,5 mL 2 M Aminocapronsäure und 4 µL von 500 mM EDTA.
4. Bereiten Sie 1.000 mL Kathode Puffer mit 15 mM Bis-Tris und 50 mM Tricine dH₂O. Adjust pH 7.0.
   1. Bereiten Sie 200 mL blaue Kathode Puffer durch Zugabe von 0,04 g Coomassie blaue G-250 auf 200 mL der Kathode Puffer vor.
5. Bereiten Sie 1.000 mL Anode Puffer mit 50 mM Bis-Tris dH₂O. Adjust pH 7.0.
6. Bereiten Sie 2,5 mL Probenpuffer mit 750 mM Aminocapronsäure und 5 % Coomassie Blau G-250 dH₂O.

2. Vorbereitung des mitochondrialen lysates

1. Platte die Zellen am Tag vor der Abholung. Für HEK293 oder 143B Zellen Verwendung Dulbecco Adlers Medium (DMEM) mit fötalen Rinderserum 10 %, 1 % L-Glutamin, 100 mg/mL Penicillin und 100 mg/mL Streptomycin geändert. Wachsen Sie die Zellen in einer Zelle Kultur Inkubator bei 37 ° C in 5 % CO₂ feuchte Atmosphäre. Sicherstellen Sie, dass am Tag der Sammlung gibt es mindestens 500.000 Zellen pro Probe.
2. Waschen Sie vorsichtig die Zellen einmal mit eiskaltem PBS. Vermeiden Sie die Zellen von der Platte lösen. Kratzen Sie die Zellen und pellet sie 800 X g für 10 min bei + 4 ° C.
3. Die Zelle Pellet zweimal mit eiskaltem PBS waschen und wie in Schritt 2.2 zentrifugieren. Konzentration des Proteins mit der Bradford-Methode mithilfe eines kommerziellen Kits zu messen. Pellet-Zellen bei 800 X g für 10 min. bei + 4 ° C.
   Hinweis: Nach der Zellentnahme führen Sie alle Schritte bei + 4 ° C und nicht Wirbel zu tun.
4. Bereiten Sie 20 mL PBS mit Protease-Inhibitor durch Zugabe von 200 µL 100 X Protease-Inhibitor, 20 mL PBS vor. Halten Sie auf dem Eis. Die Zellen in PBS mit Protease-Hemmer zu einer endgültigen Proteinkonzentration von 5 mg/mL aufzuwirbeln.
   1. Um das Volumen der PBS mit Protease-Hemmer benötigt, um die Zellen bei 5 mg/mL Aufschwemmen zu berechnen, berechnen Sie die Protein-Menge in jeder Probe. Verwenden Sie für diese Berechnung die Proteinkonzentration in Schritt 2.3 und das Volumen der PBS verwendet, um die Zellen nach dem Waschen in Schritt 2.3 Aufschwemmen gemessen.
5. Bereiten Sie 1 mL 3,3 mM Digitonin in PBS mit Protease-Inhibitor. Eine Endkonzentration von 1,65 mM 3,3 mM Digitonin hinzufügen. Mischen Sie gut und inkubieren Sie für 5 min auf Eis.
   1. Bereiten Sie 1 mL 3,3 mM Digitonin in PBS mit Protease-Inhibitor, Auflösen von 4 mg Digitonin in 1 mL PBS bei 100 ° C bis kein Niederschlag ist sichtbar und cool auf Eis sofort. 1 mL der Lösung Digitonin 10 µL 100 X Protease-Inhibitor hinzufügen.
      Hinweis: Verwenden Sie nur eine frische Lösung von Digitonin.
      Achtung: Digitonin ist giftig! Verwenden Sie einen Mundschutz, Handschuhe und einen Laborkittel.
6. Das Endvolumen von 1,5 mL fügen Sie PBS mit Proteinase Inhibitor (vorbereitet in Schritt 2.4 hinzu). Zentrifuge bei 10.000 x g für 10 min bei + 4 ° C. Den Überstand zu entfernen. In diesem Schritt sind Mitochondrien pelleted.
7. Aufschwemmen der mitochondrialen Pellets in mitochondrialen Puffer. Das Volumen der mitochondrialen Puffer ist die Hälfte des Volumens der PBS im Schritt 2.4.
8. Bereiten Sie frische 10 % Natriumlaurylsulfat Maltosid in PBS mit Protease-Hemmer (in Schritt 2.4 vorbereitet). 1 mL ist ausreichend für 10 Proben. Die Endkonzentration von 1 % 10 % Natriumlaurylsulfat Maltosid hinzufügen. Inkubieren Sie für 15 min (dieser Schritt kann bis zu ein paar Stunden länger sein) auf Eis.
9. Zentrifuge bei 20.000 X g für 20 min bei + 4 ° C. Sammeln Sie den Überstand in ein neues Gefäß. Messen Sie die Proteinkonzentration von der Bradford-Methode mit einem Kit. Fügen Sie Probenpuffer, ein Volume, das die Hälfte des Volumens der Natriumlaurylsulfat Maltosid in Schritt 2.8 verwendet wird. Proben können bis zu 6 Monate bei-80 ° C gelagert werden.

3. Vorbereitung der gradient Gel BN-Seite

1. Gießen Sie das Farbverlauf Gel für BN-Seite bei Raumtemperatur. Legen Sie den Farbverlauf Maker auf einem Teller rühren und verbinden Sie es mit flexiblen Schläuche an der peristaltischen Pumpe. Legen Sie ein Infusionsset mit der Nadel auf das Rohr. Legen Sie ein Magnetrührer in der proximalen Kammer der Farbverlauf Maker. Waschen Sie die Schläuche mit dH₂O bei maximaler Pumpenleistung für 10 min.
2. Leeren Sie den Schlauch und den Farbverlauf Maker. Verwenden Sie ein pipettieren, um alle übrig gebliebenen dH₂O im Kanal zwischen den Industrie-und Handelskammern der Farbverlauf Maker zu entfernen. Schließen Sie den Kanal und den Schlauch mit dem Ventil.
3. Mit Guss-Rahmen und Klammern montieren Sie zwei Glasplatten in der Halterung, die an der Unterseite eine Loch hat, und legen Sie es auf dem Stand. Stellen Sie sicher, dass es mehr oder weniger auf einer geraden Fläche mit einem Wasser-Balance. Ort der Nadel verbunden auf das Rohr zwischen den Glasplatten.
4. Bereiten Sie 6 % und 15 % Gel-Lösungen (Tabelle 2). Halten Sie auf dem Eis. Hinzufügen von Ammonium Persulphate (APS) und Tetramethylenediamine (TEMED) (sie beginnen Polymerisation) letzte. Die Mischung sanft zu verhindern, dass Luft sprudelt.
5. Laden Sie das proximale Ende der Steigung-Gel-Mischer Schläuche Kammer mit 6 % Gel und dem distalen Ende mit 15 % Gel. Das Gesamtvolumen des Gels sollte gleich dem Volumen des trennenden Gels zwischen den Glasplatten. Daher verwenden Sie 2,6 mL 6 % Gel und 2,1 mL 15 % Gel zum Mischer gradient Gel für eine 8,3 x 7,3 cm Größe Gel.
6. Schalten Sie den Magnetrührer, und öffnen Sie die Schläuche und Kanal zwischen Industrie-und Handelskammern der Farbverlauf Maker. Schalten Sie sofort die peristaltischen Pumpe auf 5 mL/min die Glasplatten zu füllen, und erlauben keine Luftblasen geben Sie das Gel. Entfernen Sie die Nadel, wenn es kein Gel in die Röhre ist.
7. Überlagern Sie sanft das Gel mit dH₂O. halten Sie das Gel bei Raumtemperatur mindestens 1 h für die Polymerisation.
8. Sofort nach dem Gießen des Gels, waschen den Schlauch der Gradienten Kammern mit dH₂O füllen und mit Hilfe der peristaltischen Pumpe mit maximaler Geschwindigkeit. Wenn Sie zwei oder mehr Gele vorbereiten, reinigen Sie das System immer dazwischen.
9. Bereiten Sie 1 X Gel-Puffer durch das Mischen von 3 mL 3 x Gel Puffer vor und 6 mL dH₂O. entfernen dH₂O von der Oberfläche des Gels mit Filterpapier vorsichtig. Waschen Sie die Oberfläche des Gels mit 1 x Gel-Puffer. Entfernen Sie 1 x Gel-Puffer mit Filterpapier vorsichtig.
   1. Vermeiden Sie Fasern aus Filterpapier auf das Gel. Um dies zu gewährleisten, schneiden Sie das Papier mit einer Schere in kleine Stücke, aber reißen Sie das Papier nicht.
10. Legen Sie den Kamm zwischen den Glasplatten, aber nicht in Wasser tauchen sie voll und ganz um das Stapeln Gel unter den Kamm gießen können. Bereiten Sie die 4 % Stapeln Gel (Tabelle 2). Hinzufügen von APS und TEMED dauern, wie sie Polymerisation schnell und problemlos starten. Mischen Sie sanft Vermeidung von Luftblasen.
11. Überlagern Sie das stapelnde Gel, Vermeidung von Luftblasen unter dem Kamm, und Tauchen Sie den Kamm voll. Lassen Sie das Stapeln Gel polymerisieren für mindestens 30 Minuten den Kamm zu entfernen und waschen Sie die Brunnen mit 1 x Gel-Puffer mit einem pipettieren.
    1. Nach der Polymerisation kann das Gel ein paar Tage bei + 4 ° C aufbewahrt werden. Um das Gel zu speichern, wickeln Sie das Gel in Papier getränkt mit dH₂O und Plastik Film zu verhindern Austrocknen des Gels.

4. blue native Gelelektrophorese

Hinweis: Zur Vermeidung der Verschlechterung der OXPHOS laufen komplexe Elektrophorese bei + 4 ° C. Verwenden Sie vorgekühlt Puffer.

1. Laden Sie die Gel-Kassette mit dem blauen Kathode-Puffer, bis der Boden der Näpfchen. Laden der Proben ist einfacher, wenn die Kassette nicht bis oben gefüllt ist. Waschen Sie die Brunnen mit dem blauen Kathode Puffer und füllen Sie dann die Brunnen mit den blauen Kathode-Puffer mit pipettieren.
2. Laden Sie die Proben (5-30 µg Protein) in Brunnen. Füllen Sie sanft die Gel-Kassette nach oben mit den blauen Kathode Puffer und den Tank mit Anode Puffer.
3. Führen Sie das Gel für 15 min bei einer konstanten Spannung von 40 V. Erhöhen Sie die Spannung bis 80 V (oder verwenden Sie einen konstanten Strom von 6 mA), nicht mehr als 10 mA. Führen Sie das Gel, bis der Farbstoff 2/3 der Länge Gel erreicht.
4. Ersetzen Sie den blauen Kathode-Puffer mit Kathode Puffer und Elektrophorese fortgesetzt, bis die Farbstoff Vorderseite abgelaufen ist. Elektrophorese dauert insgesamt ca. 3 Stunden.
5. Rufen Sie die Glasplatten und halbtrocken beflecken übertragen Sie der Proteine auf Polyvinylidene Fluorid (PVDF) Membran. Verwenden Sie eine konstante Spannung von 25 V und einem Strom auf 1,0 A 30 min begrenzt.
   1. Alternativ können Sie nasse beflecken die OXPHOS-Komplexe auf einer PVDF-Membran übertragen.
6. Weiter mit der Blockierung der Membran und Antikörper Inkubationszeit nach dem standard Immunoblotting-Protokoll. Verwenden Sie die primären Antikörper gegen Untereinheiten der OXPHOS-Komplexe sequenziell.
   Hinweis: z. B. Anti-NDUFA9 Antikörper (1: 2000) für komplexe ich Anti-SDHA Antikörper (1: 2000) für komplexe II, Anti-UQCRC2 Antikörper (1: 1000) für komplexe III, Anti-COX1 Antikörper (1: 2000) für komplexe IV und Anti-ATP5A Antikörper (1: 2000) für komplexe V. Die Liste der Antikörper wird in der Tabelle der Materialienpräsentiert.

Ergebnisse

BN-Seite verwenden, können Fehler bei der Montage des mitochondrialen OXPHOS-Komplexe untersucht werden. Abbildung 1A zeigt die Montage der komplexe der Atmungskette in menschlichen Neuroblastoma Zellen (SH-SY5Y) behandelt mit Chloramphenicol, die Übersetzung von MtDNA-codierte OXPHOS-Untereinheiten spezifisch hemmt. Chloramphenicol erschöpft die OXPHOS-Komplexe, die mitochondrially-kodierten Untereinheiten enthalten (Komplex I, III, IV; Abbildung 1A), während komplexe II, die ausschließlich von nuklearen Genen kodiert ist, compensatorily hochreguliert war. Anlage V war nicht Immunoblotted hier.

Mehreren Gefrier-Tau-Zyklen zerstören OXPHOS-Komplexe. Abbildung 1 b zeigt den Abbau von OXPHOS-Komplexe durch die Gefrier-Tau-Zyklen. Mitochondriale Atmung komplexe in Beispiel 3, die mehrere Gefrier-Tau-Zyklen durchlaufen haben haben eine geringere Intensität der Band und sind im Vergleich zu den gleichen Proben, die nur einmal eingefroren wurden verschoben. Ein uncropped western-Blot-Bild der Abbildung 1 b zeigt ergänzende Abbildung 1.

Die Qualität des Gels ist wichtig für scharfe und klare Bands. Abbildung 1 C zeigt einen Immunoblot aus einem Gel, die nicht gut polymerisieren. Abisolieren der Membran kann auch Auswirkungen auf die Erkennung von OXPHOS-Komplexe. In Abbildung 1 Dkomplexe ich vor oder nach dem Ausschalen festgestellt. Das Signal-Rausch-Verhältnis ist nach dem Ausschalen viel niedriger.

Abbildung 1. BN-Seite Immunoblots aus erfolgreichen und suboptimale Experimenten. (A) Erschöpfung der OXPHOS-Komplexe durch Hemmer der mitochondrialen Übersetzung. Menschlichen Neuroblastoma Zellen (SH-SY5Y) wurden mit Chloramphenicol (CAP) für 48 Stunden behandelt. Strg, Kontrollzellen ohne Chloramphenicol Behandlung. Der untere Bereich zeigt die Quantifizierung der Immunoblot. Der Wert des Steuerelements wird als 1 (als gestrichelte Linie dargestellt) übernommen. Daten werden ausgewiesen, weil meine ± SD, n = 3, * P < 0,0001 im Vergleich zur Kontrolle mit ungepaarten Schülers t-Tests. (B) Störung der OXPHOS-Komplexe durch mehrere Frost-Tau-Zyklen. Proben 1 bis 3 wurden von menschlichen Osteosarkom Zellen (143B) unter den gleichen Bedingungen vorbereitet. Anzahl der Proben 1 und 2 wurden eingefroren und nur einmal geschmolzen, während die Probennummer 3 vier Gefrier-Tau-Zyklen unterzogen. (C) BN-Seite Immunoblots OXPHOS-Komplexe von HEK293 Zellen isoliert. Das Verschmieren der Bänder verursacht durch niedrige Qualität des Gels. (D) Wirkung des Abtrags auf den Nachweis von OXPHOS-Komplexe. Erkennung von komplexen ich in menschlichen Neuroblastoma Zellen (SH-SY5Y) vor und nach dem Ausschalen der gleichen Membran. OXPHOS-Komplexe wurden mit Anti-NDUFA9 Antikörper nachgewiesen (komplexe ich), Anti-SDHA Antikörper (Komplex II), Anti-UQCRC2 Antikörper (Komplex III) und Anti-COX1 Antikörper (Komplex IV). Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Puffer oder Lösung	Zusammensetzung	Rezept
3 x Gel-Puffer	1,5 M Aminocapronsäure	3,94 g Aminocapronsäure
	150 mM Bis-tris	0,63 g Bis-Tris
	dH2O	20 mL dH2O hinzufügen
	pH 7,0	PH-Wert auf 7,0 einstellen
Kathode-Puffer	15 mM Bis-tris	3,14 g Bis-Tris
	50 mM tricine	8,96 g tricine
	dH2O	1000 mL dH2O hinzufügen
	pH 7,0	PH-Wert auf 7,0 einstellen
Blaue Kathode Puffer	0,02 % Coomassie blau G	0,04 g Serva blau G
	15 mM Bis-tris	200 mL Kathode Puffer
	50 mM tricine
	dH2O
	pH 7,0
Anode Puffer	50 mM Bis-tris	20,93 g
	dH2O	2000 mL dH2O hinzufügen
	pH 7,0	PH-Wert auf 7,0 einstellen
Mitochondriale Puffer	1,75 Aminocapronsäure M	0,5 mL 3 x Gel-Puffer
	75 mM Bis-tris	0,5 mL 2 M Aminocapronsäure
	2 mM EDTA	4 µL von 500 mM EDTA
	dH2O	-
	pH 7,0	-
Probenpuffer	750 mM Aminocapronsäure	0,94 mL 2 M Aminocapronsäure
	5 % Comassie blau G	0,125 g Serva blau G
	dH2O	2,5 mL dH2O hinzufügen
2M Aminocapronsäure	2 M Aminocapronsäure	2,62 g Aminocapronsäure
	dH2O	10 mL dH2O hinzufügen

Tabelle 1. Puffer und Lösungen bei der BN-Seite.

Blaue native Gele	Trennung von 6 % gel	Trennung von 15 % gel	Stapeln von 4 % gel
3 x Gel-Puffer	3,3 mL	3,3 mL	1,64 mL
40 % Acrylamid/Bis 37.5:1	1,5 mL	3,75 mL	0,5 mL
dH2O	5,14 mL	0,93 mL	2,77 mL
Glycerin	0	2 mL	0
10 % Ammonium bleichen *	60 ΜL	10 ΜL	60 ΜL
TEMED	4 ΜL	2 ΜL	6 ΜL
Gesamtvolumen	10 mL	10 mL	5 mL
* Machen Sie immer frisch 10 % Ammonium Bleichen in dH2O

Tabelle 2. Rezepte des Gels für BN-Seite.

Ergänzende Abbildung 1. uncropped western-Blot-Bild der Figur 1 b. Klicken Sie bitte hier, um diese Zahl zu downloaden.

Diskussion

Eines der wichtigsten Teile des Protokolls ist zur Erhaltung intakter OXPHOS-Komplexe während der Probenvorbereitung, Lagerung und gel-Elektrophorese. So Mitochondrien sollte bei + 4 ° C isoliert werden und die Proben sollten nicht Frost-Tau-Zyklen durchlaufen. OXPHOS-Komplexe verträgt nur einem Gefrier-Tau-Zyklus während des gesamten Verfahrens. Mehreren Gefrier-Tau-Zyklen zerstören OXPHOS-Komplexe (Abbildung 1 b). Kontrolle und experimentellen Proben, die verglichen werden sollen sollte parallel vorbereitet werden, um Unterschiede in der Lagerung zu vermeiden, die irreführende Ergebnisse geben könnte. Wenn es nicht möglich, alle Schritte des Protokolls mit den Proben parallel auszuführen ist, empfehlen wir, gewaschene Zelle Pellets bei-80 ° C (Schritt 1.4 in diesem Protokoll) Einfrieren und später tragen Sie den Rest des Protokolls für alle Proben zusammen mindestens bis Gel elec Trophoresis. Besondere Aufmerksamkeit sollte auf die Sauberkeit der Elektrophorese-Apparatur (Tank, Kassette). Wenn das gleiche Gerät für SDS-PAGE verwendet wird, waschen Sie es sehr gut vor BN-Seite. Alle restlichen SDS kann dazu führen, dass Dissoziation der OXPHOS-Komplexe während der Elektrophorese.

Qualitativ hochwertige gradient Gele sind ein weiterer wichtiger Bestandteil des Protokolls. Vorgefertigte Gele für blaue native Seite sind im Handel erhältlich; jedoch ist es nicht empfohlen, sie zu benutzen, da der Puffer für kommerzielle Gele könnte eine Komposition, die anders als die Probe-Puffer ist. Die Steigung des Gels verwendet hier (6-15 %) ist optimal für die Trennung der einzelnen OXPHOS-Komplexe. Um supramolekularen Strukturen höherer Ordnung des OXPHOS, auch bekannt als Atmungskette Supercomplexes¹⁴, zu erkennen ist eine Optimierung erforderlich¹¹.

Für die Visualisierung von OXPHOS verwenden komplexe die spezifischen Antikörper gegenüber dem Vorquartal aufgrund ihrer Eigenschaften. Z. B. zuerst die Antikörper, der das schwächste Signal und der Antikörper mit dem stärksten Signal letzten gibt. Dies ist wichtig, da das Abisolieren die Erkennung (Abbildung 1 schwächt). Die Zusammensetzung der komplexe der Atmungskette untersucht werden kann, wenn das Gel nach BN-Seite der zweiten Dimension SDS-PAGE¹⁵unterliegt.

Das hier beschriebene Protokoll schlägt mit Antikörpern gegen einzelne OXPHOS-Komplexe gegenüber dem Vorquartal. Jedoch kann der im Handel erhältliche OXPHOS-Antikörper cocktail verwendet werden, alle fünf OXPHOS-Komplexe gleichzeitig zu erkennen. Dennoch sollte um sein unvollständig montierten OXPHOS-Komplexe erkennen und definieren ihre Identität, Antikörper gegen einzelne OXPHOS-Komplexe nacheinander verwendet werden. Dieser Schritt ist zeitaufwändig. Es kann jedoch wesentlich zum Testen von neuen experimentellen Bedingungen und Modelle.

Die Konzentration von Digitonin verwendet für mitochondriale Isolierung sollte für die bestimmten Zelltyp optimiert werden. Als Reinigungsmittel permeabilizes Digitonin Zellmembranen. Die optimale Konzentration von Digitonin permeabilizes effizient die Plasmamembran der Zellen der mitochondrialen Membranen intakt. Zu geringer Konzentration von Digitonin verursacht hohe Kontamination der mitochondrialen Extrakte, während zu hoher Konzentration der mitochondrialen Membranen schadet und die mitochondriale Gesamtausbeute reduziert. Das optimale Digitonin/Protein-Verhältnis (g/g) variiert von 0,3 bis 1. Western-Blot Analyse von Proteinen aus Pellets und Überstände extrahiert kann verwendet werden, um die optimale Konzentration von Digitonin¹⁶zu testen.

Dieses Protokoll enthält keine Ladekontrolle auf der Immunoblot Protein; die Proteinkonzentration der extrahierten komplexe sollte daher, sorgfältig zumindest in Triplicates Gewährleistung gleicher Belastung gemessen werden. Darüber hinaus können die Proben in BN-Seite in Wiederholungen ausgeführt werden. Wenn die Montage der selektiven OXPHOS-Komplexe beeinträchtigt wird, können als Steuerelemente laden unberührt komplexe dienen.

Die Schätzung der molekularen Masse des Protein-komplexe in der BN-Seite ist eine Herausforderung,¹⁸. Das aktuelle Protokoll beinhaltet nicht den Molekulargewicht Marker; um die Montage der OXPHOS-Komplexe abschätzen zu können, sollte die Kontrollproben mit unberührt komplexe daher immer in die Analyse einbezogen werden. Die Kontrollproben für BN-Seite sind in der Regel unbehandelt oder wild-Typ-Zellen.

Die hier vorgestellte Methode ist für die Erkennung der mitochondrialen Atmungskette komplexe optimiert; Es kann jedoch auch für die Bewertung der Oligomerisierung von mitochondrialen Proteine¹⁹angewendet werden. Darüber hinaus kann die Montage bei OXPHOS-Komplexe durch erste abbauende mitochondrial kodierten Untereinheit enthält komplexe von Chloramphenicol und dann nach ihrer Genesung nach der Entfernung von Chloramphenicol¹⁰untersucht werden. BN-Seite ist somit lässt sich stationäre Ebenen und Montage von OXPHOS für verschiedene Anwendungen einschließlich molekulare Diagnostik von menschlichen mitochondrialen Erkrankungen^9,11bewerten.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
100 mm Zellplatten	Thermo Fisher Scientific	130182
40% Acrylamid/Bis 37,5:1	Bio-Rad	161-0148
Aminocapronsäure	Sigma	A2504
Ammoniumpersulfat	Sigma	A3678
Anti-ATP5A	Abcam	14748	Komplex V Untereinheit
Anti-MTCOI	Abcam	14705	Untereinheit des Komplexes VI
Anti-NDUFA9	Abcam	14713	Untereinheit des Komplexes I
Anti-SDHA	Abcam	14715	Untereinheit des Komplexes II
Anti-UQCRC2	Abcam	14745	Untereinheit des Komplexes III
Bis-tris	Sigma	B7535
Bradford-Protein-Assay-Kit	BioRad	5000006
Zellschaber	Fisher	11597692
Coomassie blue G250 (Serva Blue G)	Serva	35050
Digitonin	Sigma	D141
DMEM	Lonza	12-614F/12
EDTA	Life Technologies	15575-038
FBS	Life Technologies	10270106
Fötales Rinderserum	Life Technologien	10270106
Glycerin	(Sigma	G5516
Gradient Maker	Bio-Rad	1654120
Lauryl Maltosid (n-Dodecyl β -D-Maltosid)	Sigma	D4641
L-Glutamin	Life Technologies	25030024
L-Glutamin	Gibco	25030
N,N,N′,N′-Tetramethylethylendiamin (TEMED)	Sigma	T9281
PBS	Life Technologies	BE17-516F
Penicillin/Streptomycin	Lonza	17-602E
Penicillin/Streptomycin	Gibco	15140
Netzteil	GE Healthcare	EPS 301
Proteaseinhibitoren	Thermo Scientific	10137963
Transblot turbo mini PVDF	BioRad	1704156
Tricin	Sigma	T9784
Trypsin-EDTA	Gibco	15400054
Vertikales Elektrophoresegerät	BioRad	1658004