Dreidimensionale extrazelluläre Matrix Knochenmodell für Osteosarkom

Summary

Die extrazelluläre Matrix (BEM) Knochenmodell für Osteosarkom (OS) ist hier gut etabliert und gezeigt. Es kann als geeignete Gerüst für Primärtumor Wachstum in Vitro imitiert und bietet ein ideales Modell für das Studium der histologischen und cytogenic Heterogenität des Betriebssystems verwendet werden.

Abstract

Osteosarkom (OS) ist die häufigste und eine sehr aggressive primäre Knochentumor. Es wird mit anatomischen und histologischen Varianten sowie diagnostische oder prognostische Schwierigkeiten gekennzeichnet. OS umfasst genotypisiert und phänotypisch heterogene Krebszellen. Mikroumgebung Knochenteile werden entfallen Tumorprogression Heterogenität und Krankheit nachgewiesen. Extrazelluläre Knochenmatrix (BEM) behält die mikrostrukturellen Matrizen und biochemische Komponenten der native extrazelluläre Matrix. Diese Gewebe-spezifische Nische bietet eine günstige und langfristige Gerüst für OS-Zelle, die Aussaat und Verbreitung. Dieser Artikel enthält ein Protokoll für die Vorbereitung des BEM Modell und dessen weitere experimentelle Anwendung. OS-Zellen können wachsen und in Einklang mit der histopathologischen Komplexität des OS klinischen Proben mehrere Phänotypen unterscheiden. Das Modell erlaubt auch Visualisierung der verschiedenen Morphologien und ihrer Verbindung mit genetischen Veränderungen und zugrunde liegenden Regulationsmechanismen. Als homolog zu menschlichen OS kann, der Pathologie und klinische Forschung von OS dieses BEM-OS-Modell entwickelt und angewendet werden.

Introduction

Osteosarkom (OS) tritt in der Regel in aktiv Anbaugebieten, die Metaphyse der langen Röhrenknochen, während der Adoleszenz. Mehr als 80 % der OS-betroffenen Standorte bevorzugen die Metaphysis des proximalen Tibia sowie proximalen Humerus und distalen und proximalen Femur, der Standort des Wachstums Platte¹entspricht. OS umfasst mehrere Untertypen der Zelle mit mesenchymalen Eigenschaften und große Vielfalt in histologischen Merkmale und Klasse. Beweise unterstützen mesenchymalen Stammzellen (MSCs), Osteoblasten engagiert Vorläufer und Perizyten als die Zellen der Ursprung^2,3,4,5. Diese Zellen können genetische oder epigenetische Veränderungen zu sammeln und geben Anlass zu OS unter dem Einfluss von bestimmten Knochen microenvironmental Signale. Intrinsische und extrinsische Mechanismen führen die genomische Instabilität und Heterogenität des OS, mit mehreren morphologische und klinische Phänotypen^6,7. Für individualisierte Therapien oder Screening neuer Medikamente neue Modelle, gegen Heterogenität oder anderen klinischen Störungen generiert werden müssen.

OS ist ein Intra knöcherner malignen soliden Tumoren. Die Komplexität und die Aktivität der umgebenden Mikroumgebung Elementen verleihen phänotypische und funktionelle Unterschiede auf OS Zellen an verschiedenen Standorten eines Tumors. Extrazelluläre Knochenmatrix (BEM) stellt eine strukturelle und biochemische Gerüst für mineralische Ablagerungen und Knochenaufbau. Der organische Anteil der extrazellulären Matrix (ECM) besteht hauptsächlich aus Typ I Kollagen sezerniert osteoblastischen Linie Zellen, während seiner mineralisierte Teil von Calciumphosphat in Form von Hydroxylapatit⁸besteht. Die dynamische Rolle der ECM-Netzwerke ist die Zelladhäsion regulieren, Differenzierung, Übersprechen und Gewebe Funktion Wartung⁹.

Entmineralisiertem BEM und ECM Hydrogele in Zellkultur erfolgreich benutzt worden und kann Cell Proliferation^10,11erhöhen. Synthetisierte Knochen wie ECM kann die Poolgröße, Schicksal Entscheidungen und Linie Fortschreiten der MSCs^12,13,14Regeln. Darüber hinaus beweisen Ergebnisse seine klinische Bedeutung zu knochenbildenden Aktivität durch anregende zelluläre Prozesse im Knochen Bildung und Regeneration^15,16,17.

In diesem Artikel stellt unsere Fraktion ein modifiziertes Modell und günstige Alternative für dreidimensionale langfristige Kultur. OS-Zellen in das Gewebe abgeleitet BEM injiziert präsentieren einen heterogen mesenchymalen Phänotyp leicht im Vergleich zu Kunststoff zweidimensionale Kulturen. BEM abgeleitet ortsspezifische homologe Gewebe zeigen dramatische Geltung als eine native Nische für OS in Vitro Zellen und hat ein großes Potenzial in der OS theoretischen und klinischen Forschung. Diese zeichnet sich BEM-Plattform ist einfach aber effizient für in-vitro- Forschung und bei der Modellierung von mehreren Krebserkrankungen verlängert werden.

Protocol

Tierpflege und Nutzung werden nach den nationalen Instituten der Health Guide für die Pflege und verwenden von Labortieren (NIH Publikation Nr. 80-23, revidiert 1996) nach der Genehmigung der Tier Ethik Ausschuss der Sun Yat-Sen University durchgeführt.

(1) Knochen-Vorbereitung

1. Erhalten Sie 4 bis 6 Wochen alten BALB/c Mäusen (ohne Geschlecht-spezifische Anforderung). Einschläfern Sie eine Maus aseptisch durch zervikale Dislokation und frischen Fibula, Tibia und Femur aus einem Megalosauridae mit sterile chirurgische Schere abgeschnitten. Das Epithelgewebe abziehen und dann so viel des Weichgewebes wie möglich mit Schere und Pinzette entfernen.
2. Spülen Sie die Beinknochen mit sterilen 10 mM Phosphat gepufferte Kochsalzlösung (PBS) zweimal, um Blut in einer 6 cm Schale entfernen. Tauchen Sie die Knochen in 75 % Ethanol für 3 min, dann spülen mit PBS zweimal. Die sauberen Knochen können monatelang bis in einen sterilen 50 mL Zentrifugenröhrchen mit sterilen PBS bei-80 ° C gespeichert werden.
   Hinweis: In den folgenden Schritten verwendet PBS hat 10 mM PO₄³⁻.

2. Knochen Sie Demineralisation und decellularization

1. Die gefrorenen Knochen bei Raumtemperatur auftauen und dann einfrieren wieder bei-80 ° C, für 1H vorbehaltlich der Knochen mehr als 2 – 3 Frost-Tau-Zyklen für Zelle Lysis und Gewebe Zusammenbruch.
2. Inkubieren Sie die Knochen in einem sterilen 50 mL Zentrifugenröhrchen mit 0,5 N HCl über Nacht bei Raumtemperatur auf einem schaukelnden Plattform oder Orbital Shaker mit sanften Schaukeln/schütteln vollständig und sogar Knochen abzudecken.
   Hinweis: Stellen Sie sicher, die Knochen werden ausschließlich während der Bewegung in der Säure getaucht und begnügen Sie sich nicht während des Prozesses. Das Volumen der HCl-Lösung sollte mehr als zehnmal so, dass der Knochen.
3. Nach der Entkalkung die HCl-Lösung vollständig zu dekantieren und spülen unter fließendem Wasser für 1 h. Waschen Sie die Knochen zweimal für 15 min pro Waschgang mit destilliertem Wasser auf einem schaukelnden Plattform oder Orbital-Shaker.
   Hinweis: Stellen Sie sicher die Lösung oder das Wasser zwischen den Waschgängen und nach dem letzten Waschen mit destilliertem Wasser vollständig zu entfernen.
4. Extrahieren Sie die Lipide in den entmineralisiertem Knochen mit einem 1:1 Gemisch aus Methanol und Chloroform in ein 50 mL Zentrifugenröhrchen mit Alufolie für 1 h bei Raumtemperatur¹⁰gewickelt.
5. Dann Transfer die Knochen in einem anderen Gefäß umwickelt mit Alufolie für 30 min. Methanol Methanol vollständig entfernen und spülen Sie mit destilliertem Wasser zweimal für 15 min mit sanft schütteln. Dekantieren Sie letzte Waschwasser und fahren Sie mit den folgenden Schritten unter sterilen Bedingungen.
   Hinweis: Während der Extraktionsschritt muss Licht vermieden werden um Chloroform Zersetzung zu vermeiden. Die Mischung kann in lichtbeständigen Container gelagert werden oder ein Zentrifugenröhrchen mit Alufolie umwickelt. Alle Behandlungen durchführen und Schritte unter bescheidenen Rotation oder Schaukelbewegung zu waschen.
6. Spülen Sie die Knochen in einer 6 cm Petrischale mit sterilem PBS für 3 min, und übertragen Sie dann die Knochen in eine neue 50 mL Zentrifugenröhrchen. Hinzufügen von 40 mL sterile 0,05 % Trypsin-EDTA (TE) in das Rohr und inkubieren Sie Knochen für 23 h in einem CO₂ Inkubator bei 37 ° C¹⁸.
7. TE Lösung zu verwerfen und zweimal mit sterilen PBS ergänzt mit 90 μg/mL Ampicillin und 90 μg/mL Kanamycin abspülen. PBS waschen nach Umfüllen das Finale komplett, mit 40 mL sterile PBS aufzufüllen. 24 h bei Raumtemperatur mit sanften Schaukeln oder schütteln für antibiotische einweichen waschen Sie gründlich.
   Hinweis: Alle sterile PBS verwendet in diesem und den folgenden Schritten enthält 90 μg/mL Ampicillin und 90 μg/mL Kanamycin. Über Nacht waschen unter Rotation oder Schaukelbewegung erfolgen für längere gründliche eintauchen mit Antibiotika, effektive Sterilisation von Porenräumen zu erreichen.
8. Entfernen Sie die PBS und übertragen Sie die Knochen in eine frische 50 mL Zentrifugenröhrchen, gefüllt mit steriler PBS. Die vorbereiteten demineralisiertes und decellularized Knochen nennt man extrazelluläre Knochenmatrix (BEM) und können 2 Monate bis erforderlich bei 4 ° C gelagert werden.

3. Handy-Aussaat und Kultur

1. Nehmen Sie die BEM von 4 ° C Kühlschrank und zweimal in 75 % Ethanol für 30 s, dann spülen mit PBS eintauchen. Übertragen Sie die BEM auf eine saubere 6-Well Zellplatte Kultur. Fügen Sie 2 mL komplette Kulturmedium (Dulbeccos modifiziert Adlers Medium/F12 (DF12) mit 5 % fötalen Rinderserum, 90 μg/mL Ampicillin und 90 μg/mL Kanamycin). Inkubieren Sie die BEM über Nacht in eine CO₂ Inkubator bei 37 ° c
2. Erhalten Sie menschliche OS-Zell-Linien (MNNG/HOS und MG-63). Aussetzen Sie ca. 1,0 x 10⁵ OS Zellen mit 100 μl PBS mit Phenol rot als Indikator.
   Hinweis: Um besser verfolgen und mehrschichtige Zellen innerhalb des dreidimensionalen Modells BEM zu beobachten, sind MNNG/HOS und MG-63 mit Lentivirale Vektor ausdrücken fluoreszierende mCherry und grün fluoreszierendes Protein (GFP) infiziert.
3. Nach die BEM im Medium voll getränkt ist, injizieren Sie OS Zellen in BEM von proximalen oder distalen Epiphyse, wenn die Nadel die Markhöhle BEM erreicht. Inkubieren Sie das OS-BEM-Modell für ein Minimum von 2 h in einer befeuchteten 5 % CO₂ Atmosphäre bei 37 ° C zu gewährleisten, die injizierten Zellen fest haften, BEM.
   Hinweis: Vorwärmen der Medien, die für die Zellkultur verwendet. Der Inkubator für Zellkultur verwendet hat eine befeuchtete 5 % CO₂ Atmosphäre bei 37 ° C.
4. Fügen Sie 1 mL komplette Kulturmedium in die Platte komplett beschichten die Oberfläche der BEM Kultur über Nacht in eine CO₂ Inkubator bei 37 ° C.
5. Übertragen Sie das Modell OS-BEM sanft in einen neuen Brunnen 6-Well-Platte mit einer sterilen Pinzette und refeed 1 mL frisches Nährmedium Kultur des Modells für 14 Tage in eine CO₂ Inkubator bei 37 ° C und aktualisieren Sie das Kulturmedium situationsgerecht Verbreitung von OS-Zellen.
6. Halten Sie die Statusüberwachung mittlere Farbe und Zelle unter dem invertierten Fluoreszenzmikroskop bei der Kultur. Wenn OS Zellen auf Platte erweitern, übertragen Sie sanft das OS-BEM-Modell auf eine andere neu auch mit sterilen Pinzette.
   Hinweis: Das Kulturmedium ist leuchtend rot bei pH 7,4, der optimale pH-Wert für die meisten Säugetier-Zellkultur. Wenn das Medium in orange oder sogar gelb verwandelt, sofort aktualisieren Sie das Medium, um eine gesunde Umwelt für OS Zellen zu erhalten.
7. Das OS-BEM-Modell in einen neuen Brunnen mit einer Pinzette und sanft spülen mit PBS, das Kulturmedium zu entfernen. Dann übertragen Sie in einem 15 mL Zentrifugenröhrchen und befestigen Sie mit 10 % gepuffert Formalin zur histologischen Identifikation.

Results

Nach der Entsalzung und Decellularization scheint BEM durchscheinend mit stärkeren Widerstandsfähigkeit und Festigkeit im Vergleich zu nativen Maus Knochen sein. Eine kleine Muskel-Rückstände und der Raum der Markhöhle können deutlich (Abbildung 1A, B) beobachtet werden. Um festzustellen, die effektive Decellularization von BEM, BEM nach der Fixierung in Paraffin eingebettet, und dann in Scheiben geschnitten in 3 – 5 μm Abschnitte für Färbung Hämatoxylin-Eosin (H & E). D...

Discussion

In der Regel OS so osteoblastischen klassifiziert werden können, Chondroblastic und fibroblastic je nach seiner dominierenden Bestandteil der histologischen Subtypen. Seine Prognose ist nicht nur abhängig vom histologischen Parameter sondern auch auf seine anatomischen Website. Es kann in den Knochen (in der intramedullären oder intracortical Fach), auf den Oberflächen von Knochen und extraosseous Seiten¹⁹auftreten. Die Entstehung und die Heterogenität der OS können als eine Konjugation von onkogen...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
15 mL Zentrifugenröhrchen	Greiner	188271
50 mL Zentrifugenröhrchen	Greiner	227270
6 cm Zellkulturschale	Greiner	628160
6-Well-Platte	Greiner	657160
Ampicillin	Sigma-Aldrich	A9393
C57-BL/6J Maus	Sun Yat-sen University Laboratory Inkubator für Tierzentren
CO2	SHEL LAB	SCO5A
Dibasisches Natriumphosphat	Guangzhou Chemisches Reagenzienfabrik	BE14-GR-500G
DMEM/F12	Sigma-Aldrich	D0547
Fötales Rinderserum	Hyclone	SH30084.03
Hämozytometer	BLAU	717805
Kanamycin	Sigma-Aldrich	PHR1487
MG-63	Chinesische Akademie der Wissenschaften, Shanghai Zellbank		Humane Osteosarkom-Zelllinie
MNNG/HOS	Chinesische Akademie der Wissenschaften, Shanghai Zellbank		Humane Osteosarkom-Zelllinie
Phenolrot	Sigma-Aldrich	P4633	Als pH-Indikator wird eine Lösung von Phenolrot verwendet: Seine Farbe zeigt im pH-Bereich von 6,6 bis 8,0 einen allmählichen Übergang von Gelb zu Rot.
Kaliumchlorid	Sangon Biotech	A100395
Kaliumphosphat Monobasisch	Sangon Biotech	A501211
Natriumchlorid	Sangon Biotech	A501218