Summary
Burada, kısa dönüş süresi, düşük maliyet ve yüksek iş elde etme avantajları ile aneuploidy (PGT-A) için preimplantasyon genetik test için bir yarı iletken sıralama yöntemi sokulmaktadır.
Abstract
Kromozomal aneuploi, embriyonik gelişim durmasına yol açan ana nedenlerinden biri, implantasyon yetmezliği, veya gebelik kaybı, iyi insan embriyolarında belgelenmiştir. Aneuploidi için preimplantasyon genetik test (PGT-A) önemli ölçüde embriyoların kromozomanomalileri tespit ederek üreme sonuçlarını iyileştirir genetik bir testtir. Yeni nesil sıralama (NGS) genetik analiz için yüksek iş artışı ve maliyet-etkin bir yaklaşım sağlar ve PGT-A klinik uygulanabilirlik göstermiştir. Burada embriyolarda aneuploidi taraması için hızlı ve düşük maliyetli yarı iletken dizilime tabanlı NGS yöntemini salıyoruz. İş akışının ilk adımı biyopsi yapılan embriyo örneğinin tüm genom amplifikasyonu (WGA) ve ardından sıralama kütüphanesinin inşası ve ardından yarı iletken sıralama sistemi üzerinde sıralamadır. Genellikle, bir PGT-A uygulaması için, ortalama okuma uzunluğu 150 baz çifti olan 60−80 milyon okuma üreten her yongaya 24 örnek yüklenebilir ve sıralanabilir. Yöntem, PGT-A algılamasını tekrarlanabilir, yüksek verimli, maliyet açısından verimli ve zaman tasarrufu sağlayan şablon amplifikasyonu ve sıralama kitaplığını zenginleştirme işlemi için zarif bir protokol sağlar. Bu yarı iletken sıralayıcının çalışma süresi sadece 2−4 saattir ve numune almaktan rapor verme süresini 5 güne kısaltır. Tüm bu avantajlar bu töşeyi, embriyolardan kromozomal aneuploidies tespit etmek ve böylece PGT-A geniş uygulama kolaylaştırmak için ideal bir yöntem yapmak.
Introduction
Yardımlı üreme transferi için normal kromozom kopya numaraları (euploid) ile kaliteli canlı embriyoların seçilmesi gebelik sonuçlarını iyileştirmeye yardımcı olur. Geleneksel olarak, köklü morfolojik derecelendirme sistemi yaygın kolay kullanılabilirliği ve non-invaziv doğası nedeniyle embriyo değerlendirme için kullanılır. Ancak, morfolojik değerlendirmenin sadece embriyo kalitesi1 ve implantasyon potansiyeli2hakkında sınırlı bilgi sağlayabileceği gösterilmiştir. Bir temel nedeni embriyoların kromozom bileşimi değerlendirilmesinde yetersizlik olduğunu.
Kromozom alofoidi (kromozomların anormal kopya sayısı) embriyonik gelişim durmasına, implantasyon yetmezliğine veya gebelik kaybına yol açan başlıca nedenlerden biridir. Aneuploidin in oluşumu insan embriyolarında iyi belgelenmiştir, dekolte evresi embriyolarda %60−%70,blastosistlerde %3,4 ve %50−%60'ı blastosistlerde%50-60'dır. Bu, bir dereceye kadar, yaklaşık% 35−40%6,7korumuştur in-vitro fertilizasyon (IVF) tedavisi, gebelik oranının iyileştirilmesinde darboğaz katkıda bulunmuştur. Bu nedenle, transfer için euploid embriyoların seçilmesi gebelik sonuçlarını iyileştirmek için yararlı olduğuna inanılmaktadır. Bu amaçla, aneuploidi için preimplantasyon genetik test (PGT-A) daha genetik yaklaşımlar kullanılarak embriyo canlılığı araştırmak için geliştirilmiştir. PGT-A'nın önemli rolünü destekleyen randomize kontrollü çalışmalar ve kohort çalışmaları giderek artmaktadır. PGT-A uygulamasının düşük oranını azalttığı ve klinik gebelik oranını ve implantasyon oranını artırdığı kanıtlanmıştır8, devam eden gebelik oranı ve canlı doğum oranı9.
Tarihsel olarak PGT-A'da floresan in situ hibridizasyon (FISH), karşılaştırmalı genomik hibridizasyon (CGH), dizi-CGH ve tek nükleotid polimorfizm (SNP)-mikrodizi gibi farklı yöntemler uygulanmıştır. Daha önceki çalışmalar, FISH tarafından dekolte evresi embriyoları için PGT-A'nın 59273array-CGH veya SNP-microarray5927310. Bu tutarsızlıklar kromozom mozaisiliğine, FISH teknik eserlerine veya gelişim sırasında kromozom elayrımı hatalarının embriyonik kendini düzeltmesine bağlanabilir11. Bu yaygın olarak dizi tabanlı PGT-A dizi-CGH veya SNP-mikrodizi için blastosist trophectoderm (TE) biyopsikullanarak embriyolarda kromozom dengesizliği tanımlamak için etkili olduğu kabul edilmiştir10,12. Son zamanlarda, tek hücreli yeni nesil sıralama (NGS) genetik analiz için yüksek iş ve maliyet-etkin bir yaklaşım sağlar ve PGT-A klinik uygulanabilirlik göstermiştir13,14,15, hangi bir yapmak şu anda mevcut yöntemlere umut verici bir alternatif.
Burada, insan embriyolarında aneuploidi taraması için hızlı, sağlam ve düşük maliyetli yarı iletken dizilime tabanlı NGS yöntemisi saiyoruz. İş akışının ilk adımı, biyopsi yapılan embriyo örneğinin tüm genom amplifikasyonu (WGA) olup, tek hücreli WGA kiti kullanılarak, ardından sıralama kütüphanesinin inşası ve ardından yarı iletken sıralama sistemi üzerinde sıralama dır.
DNA iplikçik sentezi sırasında her deoksiribonükleoside trifosfatdan salınan H+ iyonlarının tespit edilmesi yle sistem, yarı iletken elementler tarafından yakalanan kimyasal sinyalleri (pH değişimi) doğrudan dijital verilere aktarır. , daha fazla DNA dizisi bilgi olarak yorumlanır. Pahalı optik algılama ve karmaşık sıralama reaksiyonları gereksinimini ortadan kaldıran bu basit sıralama kimyası toplam reaktif maliyetini azaltır vesıralama çalışma süresini 2−4 saat 16'ya kadar kısaltır. Daha da önemlisi, üreticinin performans özelliklerine göre, yarı iletken sıralama platformu çalıştıran başına 15 GB'a kadar sıralama verisi (kitaplığın kalitesine bağlıdır) üretebilir ve bu da diğer sıralayıcılardan önemli ölçüde daha yüksektir. sadece yaklaşık 3−4 GB veri üreten (2 x 75 bp okuma uzunluğu ile)17. PGT-A'nın klinik uygulamalarında, bu platform 80 milyon adede kadar okuma17 ve her numunenin en az bir milyon benzersiz okuması üreten çip başına 24 örnek elde edebilir. Okuma derinliği, her numunenin en az 0,05x tüm genom kapsama alanına sahip olmasını sağlayabilir. Bu platformun yukarıdaki avantajları ideal bir tarama yöntemi yapmak ve böylece, PGT-A18geniş uygulamaları kolaylaştırmak.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Etik onay, Hong Kong Ortak Çin Üniversitesi―Yeni Bölgeler Doğu Küme Klinik Araştırma Etik Komitesi (Referans Numarası: 2010.432) tarafından verilmiştir. Araştırma lisansı Hong Kong İnsan Üreme Teknolojisi Konseyi (Sayı R3004) tarafından onaylanmıştır.
1. Tüm genom amplifikasyonu
- Başlamadan önce, her numune için enaz 135 μL (%20 fazlalık) olduğundan emin olmak için manyetik boncukların (Malzeme Tablosu) hacmini kontrol edin. Manyetik boncukları oda sıcaklığında (RT) en az 30 dakika tutun. Her numune için %70 etanol 720 μL (%20 fazlalık) hazırlayın. 105 °C'de ısıtılmış kapaklı bir Termal çevrimci (MalzemeTablosu)donatın.
NOT: Yeni hazırlanan %70 etanol (MalzemeTablosu)3 gün içinde kullanılmalıdır. - Numune hazırlama
NOT: Rutin uygulamada blastosistin 5 ila 10 trophektoderm hücresi uygulama kılavuzuna göre19' a göre biyopsi yapılır.- Tek bir 0,2 mL polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) tüp1x fosfat tamponlu salin (PBS) 2 μL biyopsileri askıya.
- Damlacıkları toplamak için 3 s için bir mini santrifüj üzerinde kısaca tüp spin.
- Hücre lisisi ve ekstraksiyonu
- Hücre ekstraksiyon tamponu(MalzemeTablosu) ve ekstraksiyon enzimi seyreltme tamponu(Tablo)buz, girdap ve kısaca kullanmadan önce 3 s için bir mini santrifüj üzerinde spin.
- Adım 1.2.2 her tüp için hücre ekstraksiyon tampon 3 μL ekleyin.
- Her numune için 4,8 μL ekstraksiyon enzimi seyreltme tamponu ve 0,2 μL hücre ekstraksiyonenzimi (Malzeme Tablosu) ekleyerek 5 μL hücreli ana karışım hazırlayın. Mix iyi ve adım 1.3.2 her tüp içine aliquot. Tüpü hafifçe çevirin ve mini bir santrifüjde 3 s için kısa bir süre döndürün.
NOT: uçları ana karışımı eklerken hücre örneklerini içeren sıvıya dokunmamalıdır. - Isıtılmış kapaklı termal döngücörde 1.3.3 adımdan tüpü kuluçkaya yatırın. Programı aşağıdaki ayarlarla çalıştırın: 75 °C'de 10 dk, 95 °C'de 4 dk, 4 °C'de tutun.
- Preamplifikasyon
- Preamplifikasyon tamponu (MalzemeTablosu)buz, girdap üzerinde çözülün ve kullanmadan önce 3 s için bir mini santrifüj üzerinde kısaca spin.
- Her numune için 4,8 μL preamplifikasyon tamponu ve 0,2 μL preamplifikasyon enzimi(MalzemeTablosu) ekleyerek 5 μL preamplifikasyon ana karışımı hazırlayın. Mix iyi ve adım 1.3.4 her tüp içine aliquot. Tüpü hafifçe çevirin ve mini bir santrifüjde 3 s için kısa bir süre döndürün.
NOT: İpuçları ana karışımı eklerken DNA örneklerini içeren sıvıya dokunmamalıdır. - Isıtılmış kapakile termal döngü içinde tüp kuluçka. Programı akan ayarlarla çalıştırın: 95 °C'de 2 dk; 95 °C'de 15 s, 15 °C'de 50 s, 25 °C'de 40 s, 35 °C'de 30 s, 65 °C'de 40 s, 75 °C'de 40 s için 12 döngü; 4 °C'de tutun.
- Amplifikasyon
- Buz, girdap üzerindekiamplifikasyon tamponu (Malzeme Tablosu) çözülün ve kullanmadan önce 3 s için mini bir santrifüj üzerinde kısaca döndürün.
- Her numune için 25 μL ampl amplifikasyon tamponu, 0,8 μL amplifikasyon enzimi (MalzemeTablosu)ve WGA için 34,2 μL çekirdeksiz su (MalzemeTablosu)ekleyerek 60 μL amplifikasyon ana karışımı hazırlayın. Mix iyi ve adım 1.4.3 her tüp içine aliquot. Tüpü hafifçe çevirin ve mini bir santrifüjde 3 s için kısa bir süre döndürün.
- Isıtılmış kapakile termal döngü içinde tüp kuluçka. Programı aşağıdaki ayarlarla çalıştırın: 95 °C'de 2 dk; 95 °C'de 15 s, 65 °C'de 1 dk, 75 °C'de 1 dk için 14 devir; 4 °C'de tutun.
- Arınma ve WGA ürünleri
- Her WGA ürününü adım 1.5.3'ten yeni 1,5 mL tüplere aktarın. Her tüpe 112,5°L manyetik boncuk ekleyin. Girdap ve 5 dakika RT inkübat.
NOT: Manyetik boncukları kullanmadan önce tamamen karıştırın. - Tüpleri süpernatant temizolana kadar 3 dakika boyunca manyetik bir standın üzerine (MalzemeTablosu)yerleştirin. Boncukları rahatsız etmeden tüm supernatant atın.
- Her tüpe %70 etanol 300 μL ekleyin. Boncukların etanolün içinden geçmesine izin vermek ve orijinal konuma geri döndürmek için her tüpü 180° döndürün. Boncuklar boncukrahatsız etmeden yerleştikten sonra tüm supernatant atın. Bu adımı bir kez tekrarlayın.
NOT: Tüpü yatay olarak döndürürken tüpü manyetik standda tutun. - Kısaca 3 s. artık supernatant temiz olana kadar manyetik stand üzerine tüpler yerleştirin bir mini santrifüj üzerinde her tüp spin. Boncukları rahatsız etmeden tüm artık supernatant atın. Hava yaklaşık 3 dakika boyunca RT boncuk kuru.
- Tüpleri manyetik standdan çıkarın ve 35 μL düşük Tris-EDTA (TE) tamponu (MalzemeTablosu)ekleyerek kurutulmuş boncukları yeniden askıya alın. 5 dakika RT'de kuluçka.
- Tüpleri süpernatant temizolana kadar 3 dk boyunca manyetik standın üzerine yerleştirin. Eluted DNA içeren tüm süpernatantı boncukları rahatsız etmeden yeni 1,5 mL tüplere aktarın.
- Her WGA ürününü adım 1.5.3'ten yeni 1,5 mL tüplere aktarın. Her tüpe 112,5°L manyetik boncuk ekleyin. Girdap ve 5 dakika RT inkübat.
2. WGA ürünlerinin kalite kontrolü
- Her saflaştırılmış WGA ürününün 1,6.6 adımDan bir florometretesti (Malzeme Tablosu) ile üreticinin el kitabına göre başlangıç malzemesi olarak 1 μL WGA ürününün kullanılmasını ölçün.
NOT: WGA ürününün kabul edilen konsantrasyonu ≥ 10 ng/μL'dir. Bu eşiğin altındaki herhangi bir ürünün sonraki adımlara devam etmesi önerilmez.
3. WGA ürünlerinin parçalanması
- Başlamadan önce, kuru blok ısıtıcıyı 37 °C'ye ısıtın. Her numune için 0,5 M EDTA 6 μL (%20 fazlalıkla) hazırlayın. Konsantrasyona bağlı olarak, 1.6.6 ila yeni 0.2 mL PCR tüplerde saflaştırılmış her WGA ürününden 300 ng DNA alın ve her tüp için çekirdeksiz su ile hacim 16 μL'ye kadar çıkın.
-
Parçalanma
- Her örnek için 2 μL dsDNA parçalanma reaksiyon arabelleği (Malzeme Tablosu) ve 2 μLdsDNA parçalanma enzimleri (Malzeme Tablosu) ekleyerek4 μL çift iplikli DNA (dsDNA) parçalanma reaksiyonu karışımı hazırlayın. Mix iyi ve adım 3.1 her tüp içine aliquot. Girdap ve kısaca 3 s. 25 dakika boyunca tüpleri 37 °C'de ısıtılmış kapaklı bir termal döngüde kuluçkaya yatırın.
- Her tüpe hemen 0,5 M EDTA 5 0,5 M EDTA ekleyin. Girdap ile iyice karıştırın ve 3 s için bir mini santrifüj üzerinde kısaca spin.
-
Arınma ve yeniden süspansiyon
- Her ürünü adım 3.2.2'den yeni 1,5 mL tüplere aktarın. Her tüpe 37,5°L manyetik boncuk ekleyin. 5 dakika boyunca RT'de vertexing ve kuluçka ile karıştırın.
- Ürünleri 1.6.2 adımdan adım 1.6.4'e kadar arındırın.
- 1.6.5 ve 1.6.6 adımlarında açıklandığı gibi her saflaştırılmış ürünü 32 μL düşük TE tamponu ekleyerek elute.
4. Kütüphane inşaatı
-
Künt- e nd r epairment, boyut seçimi ve arıtma
- Her numune için 9,5 μL çekirdeksiz su, 10 μL 5x son onarım tamponu ekleyerek 20 μL künt uçlu onarım karışımı hazırlayın ( 3.3.3 adımdanMalzeme Tablosutüpü. Girdap ve kısaca 3 s için bir mini santrifüj üzerinde spin.
- Adım 4.1.1 her tüp için manyetik boncuk 50 μL ekleyin. Girdap ve 5 dakika RT inkübat.
NOT: Manyetik boncukları kullanmadan önce tamamen karıştırın. - Supernatant temiz olana kadar 3 dakika boyunca manyetik stand üzerine her tüp yerleştirin. Tüm supernatant'ı, her biri için 25°L manyetik boncuk eklendiği yeni 1,5 mL tüplere aktarın. Girdap transfer supernatant ve 5 dakika için RT inkübat ile tüpler.
- Adım 1.6.2'den adım 1.6.4'e kadar tanımlanan kuluçka tüplerinde ürünleri arındırın.
- 1.6.5 ve 1.6.6 adımlarında açıklandığı gibi her saflaştırılmış ürünü 32 μL düşük TE tamponu ekleyerek elute.
NOT: Bu güvenli bir durak noktasıdır; bu adımdan arınmış DNA en fazla 24 saat için 4 °C'de kararlıdır.
-
Adaptör l igation ve p urification
- Her numune için 10°L nükleaz içermeyen su, 5 μL 10x ligaz tampon (Malzeme Tablosu), 1μL P1 adaptörü (MalzemeTablosu)ve 1 μL DNA ligaz (MalzemeTablosu)ekleyerek 17°L adaptör ligasyon karışımı hazırlayın. 5 s için girdap tarafından iyice karıştırın ve 15 s için bir mini santrifüj üzerinde spin, ve adım 4.1.5 her tüp içine aliquot.
- Örnek sayfaya göre adım4.2.1'den her tüpe 1 μL adaptör (Malzeme Tablosu) ekleyin (Ek Dosya: Adaptör ligasyonu için örnek levha). Girdap ve kısaca 3 s. 20 dakika için RT (20−25 °C) tüpler inkübülbir mini santrifüj üzerinde spin.
- Adım 4.2.2 her tüp için manyetik boncuk 75 μL ekleyin. 5 dakika boyunca RT'de vertexing ve kuluçka ile karıştırın. Daha sonra, 1.6.2 adımdan adım 1.6.4'e kadar açıklanan ürünleri arındırın.
- 1.6.5 ve 1.6.6 adımlarında açıklandığı gibi her saflaştırılmış ürünü 15 μL düşük TE tamponu ekleyerek elute. Eluted DNA içeren tüm supernatant'ı yeni 0,2 mL 8 tüplü şeritlere aktarın.
NOT: Bu güvenli bir durak noktasıdır; bu adımdan arınmış DNA en fazla 24 saat için 4 °C'de kararlıdır.
-
Amplifikasyon ve arınma
- Her numune için 47,5 μL süper karışım (Malzeme Tablosu) ve2,5 μL astar karışımı (MalzemeTablosu) ekleyerek 50 μL amplifikasyon ana karışımı hazırlayın. Girdap ile iyice karıştırın ve kısa bir mini santrifüj üzerinde kısa bir spin ve adım 4.2.4 0.2 mL 8-tüp şeritler içine aliquot.
- 30 s için şeritler girdap ve kısaca 3 s. ısıtmalı kapak ile termal döngü içinde şeritler kuluçka için bir mini santrifüj üzerinde spin. Programı aşağıdaki ayarlarla çalıştırın: 72 °C'de 20 dk; 95 °C'de 5 dk; 95 °C'de 15 s, 62 °C'de 15 s, 70 °C'de 1 dk; 70 °C'de 5 dk; 4 °C'de tutun.
- Her ürünü adım 4.3.2'den yeni 1,5 mL tüplere aktarın. Her tüpe 97,5°L manyetik boncuk ekleyin. 5 dakika boyunca RT girdap ve kuluçka ile karıştırın.
- Ürünleri 1.6.2 adımdan adım 1.6.4'e kadar arındırın.
- 1.6.5 ve 1.6.6 adımlarında açıklandığı gibi her saflaştırılmış ürünü 25 μL düşük TE tamponu ekleyerek elute.
5. DNA kütüphanesinin kalite kontrolü ve seyreltilmesi
- Hazırlanan her DNA kitaplığını florometre testi ile florometre testiile 2 μL DNA kitaplığı kullanarak üreticinin el kitabına göre ölçün.
- DNA kütüphanesinin kabul edilen konsantrasyonu ≥ 0.5 ng/μL vepozitif kontrol (Malzeme Tablosu) ≤ 15 ng/μL'dir. Pozitif kontrolün konsantrasyonu 15 ng/μL'den çok fazla değişiyorsa, konsantrasyon 15 ng/μL'ye yakın olana kadar pozitif kontrolün niceliğini tekrarlayın. Kitaplığın konsantrasyonu 0,5 ng/μL'nin altındaysa, parçalanmadan yeniden başlayın (bölüm 3).
NOT: DNA kitaplığını ölçmeden önce pozitif kontrolün konsantrasyonunun kabul edilen değere ulaştığından emin olun. - Nükleaz içermeyen su ekleyerek her kütüphaneyi 100 pmol'a seyreltin. Nükleaz içermeyen suya 1 μL kitaplık ekleyin; aşağıdaki denklemi kullanarak n hesaplamak:
Q florometre testi ile ölçülen her kütüphanekonsantrasyonu ve C florometre testi ile ölçülen pozitif kontrol konsantrasyonudur.
6. Sıralama
- Başlamadan önce, her numune için 1 M NaOH ve 1 nükleaz içermeyen 1,5 mL tüp için 48 μL (%20 fazlalıkla) hazırlayın. RT'deki ana karışım PCRtamponu (Malzeme Tablosu) (hacim olarak 2000 μL) eritin. Küre parçacıklarını (Malzeme Tablosu) RT'ye getirin.
- Kütüphane havuzu
- Girdap adım 5.3 her seyreltilmiş kütüphane ve kısaca 3 s her zaman bir mini santrifüj 4x spin. Nükleaz içermeyen 1,5 mL tüpe birhavuz yapmak için her kütüphaneden 5 μL alın. Girdap karışık kütüphane ve kısaca 3 s için bir mini santrifüj spin.
- Emülsiyon PCR emülsiyon sistemi kullanılarak
- 2 yeni geri kazanım tüpüne 150μL kırma çözeltisi ekleyin (Malzeme Tablosu). Yeni kurtarma tüpleri, kurtarma yönlendirici ve amplifikasyon plakası yükleyin.
- Yağ şişesi ters çevirerek karıştırın (Malzeme Tablosu) 3 kez. Hem yağ hem de gerikazanım çözeltisinin (Malzeme Tablosu) en az 2/3 dolu olduğundan emin olun.
- Vortex 30 s için ana karışımı PCR tampon ve kısaca 3 s. Vortex küre parçacıkları ve adım 6.2.1 1 dk ve kısaca 3 sn için bir mini santrifüj üzerinde spin karışık kütüphane için bir mini santrifüj üzerinde spin.
- 172 μL nükleaz içermeyen su, adım 6.3.3'ten 8 μL karışık kitaplık, 120 μL enzim karışımı (MalzemeTablosu)ve 2000 μL ana karışım PCR tamponunu içeren tüpe küre parçacıklarının 100 μL'si ekleyerek 2400 μL'lik bir ligasyon karışımı hazırlayın.
- Bir pipeti 800 μL'ye ayarlayın. Ligasyon karışımını 6.3.4 adımdan reaksiyon filtresine (MalzemeTablosu)numune portundan yükleyin. Reaksiyon filtresine 200 μL reaksiyon yağı eklemek için 1000P'lik bir pipet kullanın.
- Proton: Ion PI Hi-Q OT2 200 Kitiprogramını seçin ve ardından cihazın monitördeki talimatları izleyerek doğru şekilde ayarlandığından emin olmak için Yardımlı düğmeyi seçin. Ardından, programı başlatmak için İleri'yi tıklatın.
- Otomatik zenginleştirme sistemi ile zenginleştirme
- Emülsiyon PCR programı tamamlandığında, İleri'yi tıklatın ve ardından 10 dakika boyunca döndürmek için Son Spin'i tıklatın. AçıkKapak'ı tıklattıktan sonra 2 kurtarma tüpünü çıkar.
- Supernatant'ı her tüpte 100°L kalana kadar 2 geri kazanım tüpünden atın ve buna göre etiketlendirin. Çözeltiyi iyice karıştırın ve yeni bir 1,5 mL tüpe aktarın.
- Her geri kazanım tüpüne 200 μL nükleaziçermeyen su ekleyin, birkaç kez yukarı ve aşağı borular ile yıkayın ve tüm çözeltiyi adım 6.4.2'deki 1.5 mL boruya aktarın. Yıkama adımını bir kez tekrarlayın.
- Geri kazanım tüplerinden birine 200°L nükleazsız su ekleyin ve birkaç kez yukarı ve aşağı borular tutarak yıkayın. Tüm çözeltiyi diğer geri kazanım tüpüne aktarın ve birkaç kez yukarı ve aşağı borular ile yıkayın. Daha sonra, tüm çözeltiyi 6.4.3 adımdan aynı 1,5 mL tüpe aktarın. Girdap 30 s için 1.5 mL tüp ve 15.500 x g8 dk için santrifüj .
NOT: Bu adımda emülsiyon PCR ürününün toplam hacmi yaklaşık 1200 μL olmalıdır. - Süpernatant'ı tüpe atın ve emülsiyon PCR ürününden 20 μL'lik bir ürün tutun. Tüpe 80 μL resuspension çözeltisi (MalzemeTablosu)ekleyin. Yukarı ve aşağı boru lar karıştırarak karıştırın.
- Her talaş için 280 μL polietilen glikol sorbitan monolaurate çözeltisi (MalzemeTablosu)ve 40 μL 1 M NaOH ekleyerek 320 μL erime çözeltisi hazırlayın.
NOT: 1 M NaOH 4 °C'de veya taze olarak hazırlanmalıdır. Kullanmadan önce girdap. - 30 s için C1boncuk (Malzeme Tablosu) içeren tüp girdap. 100 μL'lik C1 boncuklarını yeni bir 1,5 mL tüpe götürün. 1,5 mL'lik tüpü RT'de 2 dakika boyunca manyetik standın üzerine yerleştirin. Boncuklar boncukları rahatsız etmeden yerleştikten sonra tüm supernatant'ı atın.
- 6.4.7 adımdan tüpe 1 mL yıkama çözeltisi C1 (MalzemeTablosu)ekleyin. 30 s. Girdap için 2 dakika RT de manyetik stand üzerine tüp yerleştirin. Boncukboncuklar rahatsız etmeden yerleştikten sonra tüm supernatant atın. 130 μL boncuk yakalama çözeltisi (MalzemeTablosu)ekleyerek boncukları yeniden askıya alın.
-
Zenginleştirme sistemi (ES) kurulum
- Numuneyi (100 μL emülsiyon PCR ürünü) 6,4,5 adımdan, yıkanmış boncukları (130 μL) 6,4,8adımdan, ES yıkama çözeltisini (300 μL) (Malzeme Tablosu) ve erime çözeltisini (300 μL) adım 6,4,6'dan 8 tüplü şeridin içine yükleyin. Düzen sırası: örnek (tüp 1), yıkanmış boncuklar (tüp 2), ES yıkama çözeltisi (tüp 3, 4, 5) ve erime çözeltisi (tüp 7). 6 ve 8 numaralı tüpleri boş tutun.
- Adım 6.4.9.1'den 8 tüplü şeridi ES'e yerleştirin. Bir pipet ucu ve yeni bir 0.2 mL tüp yükleyin ve programı başlatın.
NOT: Pipetlemenin normal çalıştığından emin olun.
- Zenginleştirme tamamlandıktan sonra küre parçacıklarını yıkayın.
- 15.500 x g5 dakika için adım 6.4.9.2 0.2 mL tüp santrifüj . Supernatant atın ve zenginleştirme ürünü 10 μL tutun. Tüpe 200°L nükleaz içermeyen su ekleyin. Girdap ile karıştırın.
- Santrifüj 0.2 mL tüp için 5 dk 15.500 x g. Supernatant atın ve zenginleştirme ürünü 10 μL tutun. Tüpe 90°L nükleaziçermeyen su ekleyin. Girdap ile karıştırın.
- Şablon hazırlama
- Vortex pozitif kontrol ve spin kısaca. 100 μL şablonuna 5 μL pozitif kontrol ekleyin (6.4.10.2 adımdaki zenginleştirme ürünü). Girdap ve santrifüj için 5 dk 15,500 x g. Supernatant atın ve şablonun 10 μL tutun.
- 6.5.1 adımdan şablon tüpüne20 μL sıralama astarı (Malzeme Tablosu) ve 15 μL'lik tampon (MalzemeTablosu)ekleyin. Girdap tüp ve kısaca 3 s için bir mini santrifüj üzerinde spin.
- Isıtılmış kapaklı termal döngücörde tüpü adım 6.5.2'den inkübedin. Programı aşağıdaki ayarlarla çalıştırın: 95 °C'de 2 dk, 37 °C'de 2 dk, 4 °C'de tutun.
- 6.5.3 adımdan tüpe 10 μL yükleme tamponu (MalzemeTablosu)ekleyin. Yukarı ve aşağı boru lar karıştırarak karıştırın.
- Sequencer başlatma
- Azot gazının tank basıncını kontrol edin (toplam basınç ≥ 500 psi, çıkış basıncı ≥ 10 psi, optimum 20-30 psi). Kontör 100 mL deiyonize su (18,2 MΩ) ile C1ve C2 tüpleri (Malzeme Tablosu) ve sıralayıcıdaki ilgili C1 ve C2 pozisyonlarına yerleştirin.
- W1 (32 μL 1 M NaOH) ve W3 (40−50 mL W3 tamponu [Malzeme Tablosu]) çözeltilerini hazırlayın. 1920 mL deiyonize su (18,2 MΩ), bir şişe W2 tamponu (MalzemeTablosu)ve 8−12 μL 1 M NaOH ekleyerek W2 çözeltisini hazırlayın ve karıştırmak için 4−8 kez ters çevirin.
NOT: Su kalitesi jeolojik olarak değiştiğinden, gerektiğinde 1 M NaOH hacmini ayarlayın. W2'nin başlangıç pH'ı 5.9−6.1 ve ayarlama sonrası en uygun aralık 7.4−7.6'dır. Yeni reaktif tüpleri değiştirin ve kurun ve yıkama için son zamanlarda kullanılan çip kullanın. - Sıralama ek kiti (Malzeme Tablosu) 4 yeniboş tüpler hazırlayın. 4 tüpü dGTP, dCTP, dATP ve dTTP olarak etiketlayın ve 70 μL dGTP, dCTP, dATP veya dTTP (MalzemeTablosu)ile ilgili tüpe (yani dGTP olarak etiketlenmiş tüpe 70 μL dGTP) ekleyin. Kullanmadan önce tüpleri girdap. Tüpleri sıralayıcıda (Malzeme Tablosu) belirlenenilgili konumlara töşekilde
- Talaş yıkama
- Çipin yüklemekuyununa 100 μL izopropanol enjekte ederek çipi (Malzeme Tablosu) bir kez yıkayın. Atılan sıvıyı karşı kuyudan çıkarın.
- Çipin yükleme kuyununa 100°L nükleaz içermeyen su enjekte ederek çipi iki kez yıkayın. Atılan sıvıyı karşı kuyudan çıkarın.
- Çipin yükleme kuyununa 100 μL 0,1 M NaOH enjekte ederek çipi bir kez yıkayın. Atılan sıvıyı karşı kuyudan çıkarın. 1 dakika RT'de kuluçka.
- Çipin yükleme kuyununa 100°L nükleaz içermeyen su enjekte ederek çipi bir kez yıkayın. Atılan sıvıyı karşı kuyudan çıkarın.
- Çipin yükleme kuyununa 100 μL izopropanol enjekte ederek çipi iki kez yıkayın. Atılan sıvıyı karşı kuyudan çıkarın. Çipe azot üfleyerek kurulayın. Işıktan uzak dur.
- Örnek yükleme ve sıralama
- 55 μL numuneyi adım 6.5.4'ten yukarı ve aşağı borularla karıştırın ve numuneyi çipin yükleme kuyusuna yükleyin.
NOT: Bu adımda kullanılan pipet ucunu ve 0,2 mL PCR boruyu saklayın. - Çipi mini santrifüjün üzerine yerleştirin (Malzeme Tablosu)
- Annealing tampon ve yıkama çözeltisi için iki yeni 1,5 mL tüp hazırlayın. 500 μL tavla ve 500 μL nükleaz içermeyen su ekleyerek %50 annealing tamponu hazırlayın. 500 μL tavallama tamponu ve %100 2 propanol 500 μL ekleyerek yıkama çözeltisini hazırlayın.
- İki yeni 1,5 mL tüp hazırlayın ve her iki tüpte de 49 μL%50 tavallama tamponu ve 1 μL köpük çözeltisi (MalzemeTablosu)karıştırılarak köpük karışımını hazırlayın.
- Bir pipeti 100 μL'ye ayarlayın. 6.8.4 adımdaki iki tüpten birinden köpük karışımına hava yıkarak kabarcıklar yapın. > 120 μL kabarcıkyapın ve görünür de görülebilen kabarcıklar görülene kadar pipetleme yapmaya devam edin. Yükleme kuyununa 120°L kabarcık yükleyin.
NOT: Olağanüstü görünür kabarcıklar olmadığından emin olun. Aksi takdirde, baştan başla. - 6.8.5 adımından çıkış kuyusundan aşırı çıkarılan sıvıyı pipetleme ile yükleme kuyusuna aktarın. Pipet kabarcıkları etmeyin. Çipi mini santrifüjde 30 s santrifüj edin.
- Adım 6.8.4 köpük karışımı içeren ikinci tüp kullanarak adım 6.8.5 tekrarlayın.
- Adım 6.8.1'de tutulan 0,2 mL tüpe %50'lik tamponun 55 μL'sini ekleyin. Tutulan pipet ucunu adım 6.8.1'de kullanarak inlette yukarı ve aşağı kullanın. Tüm 55 μL tavallama tamponu yükleme kuyusu yükleyin. Belirlenen çip mini santrifüj üzerinde 30 s için çip santrifüj.
- 100 μL'lik yıkama çözeltisini talaş yükleme kuyusu içine yükleyin ve çıkarılan sıvıyı çıkış kuyusu ndan atın. Bu yükleme adımLarını bir kez tekrarlayın.
NOT: Talaşta kabarcıklar varsa, küçük kabarcıkları büyük kabarcıklar ile dışarı atve çözeltisi ile sifonu çekin. Bu, 100 μL'lik yıkama çözeltisinin boruya aktarılması ve 5 μL'lik havanın yıkama çözeltisinin altına bırakılarak elde edilebilir. Bu nedenle, 105 μL'yi çipin içine pipetleme yaparken, hava küçük kabarcıkları dışarı atabilecek büyük bir kabarcık oluşturur ve daha sonra, büyük kabarcık aşağıdaki yıkama çözeltisi ile dışarı atılabilir. - %50'lik tamponun 100 μL'sini talaş yükleme kuyusu içine yükleyin. Bu yükleme adımını toplam 3 kez tekrarlayın.
- Yeni bir 1,5 mL tüp içine% 50 annealing tampon 60 μL içine sıralama enzimi 6 μL ekleyin. Yukarı ve aşağı boru lar karıştırarak karıştırın. Bu karışık çözeltinin 65 0L'sini talaş yükleme kuyuya yükleyin. Pipet yavaş yavaş köpük önlemek için.
- Çipi ışıktan uzak tutun ve RT'de 5 dakika kuluçkaya yatırın.
- Kuluçkadan sonra, fişi hemen sıralayıcıya yükleyin ve sıralamaya başlamak için ekranda sıralama çalışmasını başlat'a tıklayın.
NOT: Sıralama ham veri ve kalite kontrol dosyaları veri analizi için otomatik olarak şirkete yüklenir.
- 55 μL numuneyi adım 6.5.4'ten yukarı ve aşağı borularla karıştırın ve numuneyi çipin yükleme kuyusuna yükleyin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bu modifiye protokole dayanarak, yarı iletken sıralama platformu ilk kez PGT-A için uygulandı. Hem de dekolte-evre blastomerlerden biyopsiler ve blastosist evresi embriyoları üzerinde test ettik. Biyopsi yapılan hücrelerin DNA'nın bozulmasını önlemek için mümkün olan en kısa sürede WGA'ya tabi tutulması önerilmektedir. Bir önceki çalışmada farklı WGA yöntemlerinin performansı karşılaştırıldığında ve burada açıklanan yöntem 100 KB20bin boyutunda en iyi tekdüzelik olduğunu belirtti. Hem tekdüzelik hem de ortanca mutlak çift yönlü fark (MAPD)21performansı göz önüne alındığında, bu WGA yöntemi yarı iletken sıralayıcı kullanılarak PGT-A için seçilmiştir. 186 dekolte evresi ve 1135 blastosist evre embriyoları üzerinde yapılan retrospektif istatistiksel analizile WGA başarı oranlarının blastomer örneklerinde%95.4, blastosist örneklerinde %96.9 olduğunu gözlemledik (Şekil 1). Bir boyut seçimi prosedürü olarak kütüphane inşaatı önce arıtma adımı büyük DNA parçaları yakalayarak kalite sıralama için çok önemliydi. Ayrıca, kütüphane inşaatı için 300 ng giriş miktarını kolaylaştırdı. Enzimatik parçalanma yöntemi, WGA ürünlerinin yaklaşık 160 bp'ye verimli bir şekilde kesilmesini sağladı.
Veri analizi Öklid mesafesi ve dairesel ikili segmentasyon (EDCBS) analiz sistemi kullanılarak yapılmıştır. Bu biyoinformatik algoritmanın sağlamlığını değerlendirmek için şirket içi doğrulama yapıldı. PGT-A'ya özel bir referans veritabanı oluşturduk ve 100 KB'lik bir depo veri kutusu boyutunu analiz ederek bilinen karyotipli 66 hücre hattından 379 WGA ürününün sıralanması yoluyla bir referans veritabanı oluşturduk. Bu veritabanından, bir başvuru aralığı kopya numarası varyantı (CNV) araması için eşik olarak ve 10 MB algılama düzeyi için kesme olarak ayarlandı olarak belirlenmiştir. Bu eşikte hem duyarlılık hem de özgüllük %99'un üzerine ulaşmıştır (Tablo1). Embriyo biyopsileri üzerine PGT-A uygulamasında, pencere boyutu 400 KB'ye ayarlanmış ve yeterli okumaya ulaşmak için sürgülü pencere yaklaşımı na sahip olduğu belirlenmiştir. Her numunenin kalite kontrolü (QC) benzersiz okumalar, MAPD ve kopya numarası varyantının (CNV'SD) standart sapması ile belirlenmiştir. Üç indeksten birinin ötesindeki örnek QC hatası olarak tanımlanmıştır (Şekil 2C). Kromozom dağılım çizimlerinin yorumlanması (Şekil2A,B,D) tanımlanmış CNV ile DEŞIFRE, DGV veya ClinGen veritabanları ile karşılaştırılarak bir iş akışını takiben kalifiye genetikçiler tarafından yapılmıştır. Bireysel tutarsızlıklar bir uzman tedavi prosedürü tarafından kontrol edildi. Blastosist örneklerinde kromozom anomalileri aneuploiidi ve mozaisizm olarak gruplandı. %30−%70 aralığında ki kopya numarası kazanç veya kaybı mozaik kromozom bileşimi taşıyan olarak sınıflandırıldı; aksi takdirde, sonuç ya euploidy veya aneuploidy olarak yorumlanır. Bu çalışmada, euploid oranları blastomerlerde %45.2 ve blastosistlerde %52.3 idi,bu oran 22,23.
Şekil 1: Bu yöntemle test edilen 1321 embriyo biyopsisinin demografik istatistikleri. (A) 186 dekolte evresi embriyodan elde edilen veriler. (B) 1135 blastosist evre embriyolarından elde edilen veriler. WGA başarı oranları her iki tip numunede %95'in üzerindedir. Sıralama kalite kontrol başarısızlık oranları dekolte-evre grubunda %3.4, blastosist-evre grubunda ise sadece %1.9'dur. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: 23 çift kromozom için embriyonun PGT-A klinik uygulamasının temsili sonuçları. (A) euploidinin temsili sonuçları; (B) aneuploidy (seq[GRCh37] (2)x3, (21)x3); (C) sıralama QC 0,6571 (kabul ≤ 0.4) cnv'sd nedeniyle örnek başarısız; (D) segmental mozaik silme (%55) ve 4p16.3p15.1 (29.50 MB). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
| CNV eşik değeri | ||||||
| (-0.23, 0.20) | (-0.32, 0.26) | (-0.41, 0.32) | (-0.51, 0.37) | (-0.62, 0.43) | (-0.73, 0.48) | |
| Duyarlılık | 100.00% | 100.00% | 100.00% | 100.00% | 98.30% | 96.02% |
| Özgüllüğü | 72.41% | 81.03% | 91.38% | 99.10% | 99.54% | 100.00% |
Tablo 1: Yarı iletken sıralayıcının farklı Log R oranları arasındaki duyarlılık ve özgüllük. Bu yöntemle bilinen euploid karyotip sonuçları ile toplam 240 örnek test edildi ve farklı Log R oranlarında çağrıldı.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Diğer sıralama kimyalarından farklı olarak, burada açıklanan sıralayıcı nükleotitlerin tespiti için yarı iletken kullanır. Çipin kendisi polimeraz tahrikli baz birleşme17ile hidrojen iyonlarını algılayan elektronik bir cihazdır, bu da Proton programının 2−4 saat sıralama süresini sağlar. Ayrıca, çip diğer sıralayıcı sağlayıcıları tarafından akış hücresi sıralama kimyası farklı bir hedef molekül, lokalizasyonu sağlayan bir microwell çip. Bu protokol, PGT-A uygulaması için optimize edilmiş değiştirilmiş bir protokoldür. Optimizasyon, kontaminasyon şansını azaltmak için sonication yerine enzimatik yöntemle güçlendirilmiş DNA'nın parçalanmasını ve daha düşük maliyetlerle daha iyi performans için boyut seçimi ve PCR sistemini içerir. Ayrıca, klinik ortamda, varyant arama için doğrulanmış bir şirket içi boru hattı kullandık.
Uygulama sırasında dikkat edilmesi gereken kritik adımlar vardır. Arınma için etanol deneyden önce taze olarak hazırlanmalıdır, çünkü yüksek miktarda etanol kontamine OLMUŞ DNA'nın yetersiz yıkanmasına neden olurken, düşük konsantrasyon hedef DNA kaybına neden olur. Florometre, doğruluğu sağlamak için bilinen bir konsantrasyonile pozitif kontrol ile kalibre edilmelidir. Ayrıca, şablonun yeterli bir yükleme sıralama için çok önemlidir. Doğru boyuttaki kabarcıklar şablon küreyi mikrokuyulara düşmeye itmeye yardımcı olur, ancak çok büyük kabarcıklar yetersiz yüklemeye neden olabilir. Kullanıcılar, her çalıştırma için sıralanacak örnek sayısını (24 olması gerekmez) değiştirebilir. Bu çip için tasarlanmış 96 indeks var. Ancak, parça başına artan numunelerle okuma derinliği azalacaktır. En sık karşılaşılan sorunlardan biri düşük kütüphane konsantrasyonu, hangi artık etanol veya manyetik boncuklar nedeniyle arıtma düşük veya düşük kaliteli DNA çıkışı atfedilebilir, ya da daha önce belirtildiği gibi boncuk çatlama. Bir suboptimal DNA çıkışı da PCR düşük verimlilik ten kaynaklanabilir, hangi doğru numune girişleri ve termal döngüörlerin sıcaklık kontrolü ile ana karışımı nanca hazırlanması ile düzeltilebilir. Yüksek CNV'SD değerlerine (Şekil2C)sahip olanlar gibi QC-failed örneklerisıralamak için, boyut dağılımı analizi için numunelerin bir biyoanalizörde çalıştırılması önerilir.
Bu yöntemin sınırlamalarından biri diğer platformlara göre daha yüksek yanlış tek nükleotid arama oranıdır. Hata oranı diğer sequencers17tarafından sadece% 0.1 indel yanlış pozitif oranı ile karşılaştırıldığında% 1'dir. Ancak, bu CNV arama veya PGT-A analizi için belirleyici bir faktör değildir. Diğer platformlarla karşılaştırıldığında, emülsiyon sisteminin uygulanması operasyonel tutarsızlıkları ve pipetleme hatalarını en aza indirerek kütüphane kalitesini artırır. DSDNA konsantrasyonu çok düşük olduğundan ve aşağıdaki kütüphane havuzu için doğru bir nicelik gerekli olduğundan, bu yöntemimizin diğer platformlara göre önemli bir avantajıdır. Yöntemimiz, algılama hatasını kontrol etmek için standart pozitif kontrol kullanarak florometre niceliği kalibrasyonuna girişti.
Kısa dönüş süresine sahip yüksek bir iş günü platformu olarak yarı iletken sıralayıcı PGT-A için idealdir ve ileri maternal yaş24gibi PGT-A klinik endikasyonları olan IVF hastalarına yaygın olarak uygulanabilir. Deleye ve ark. diğer sequencers25ile yarı iletken sequencer performansını karşılaştırmak için insan blastosistparalel sıralama yaptı. Ayrıca, bu PGT-A kiti Çin Gıda ve İlaç İdaresi "yenilikçi tıbbi cihazlar da özel onay prosedürü" elde etti ve klinik embriyobinlerce için kullanılmıştır. Maliyet açısından, bu platformun fiyatı PGT-A pazarında başka bir yaygın olarak kullanılan platforma göre giga üsleri başına yarı fiyatına. Trophectoderm hücreleri güvenilir embriyo genetik anayasa temsil edebilir26. Bu yöntem potansiyel olarak PGT için monojenik/tek gen hastalıkları için geliştirilebilir (PGT-M)Treff ve ark. 27 gösterdiği gibi . Kendi modelinde, 16 embriyo biyopsisi PGT-M üzerinde 300 MB ile 1 GB iş lenmeyi kolaylaştırdılar ve sonuçları iki geleneksel PGT-M yöntemiyle karşılaştırdılar. 16 numuneyi yakalayıp yükleyerek, metodları hedeflenen bölgenin en az 100 x okuma derinliğine ulaşmış ve %100 güvenilirlik ve tekrarlanabilirlik ile sonuçlanmıştır27. Protokolümüz le yarı iletken sıralayıcının ipliği 15 GB'a ulaşabilir ve tasarlanmış 96 barkod vardır; bu nedenle, hedeflenen PGT-M'ye uygulandığıtakdirde, önemli sayıda embriyo biyopsisi yüksek okuma derinliğinde bir çip tarafından sıralanabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.
Acknowledgments
Bu çalışma Hong Kong, Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (Ref No. 81860272), Guangxi İl Bilim ve Teknoloji Vakfı (Ref No) Büyük Araştırma Planı Genel Araştırma Fonu (Ref No. 14162417) tarafından desteklenmiştir. AB16380219) ve Çin Doktora Sonrası Bilim Vakfı Hibe (Ref No. 2018M630993) Çin.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PCR tubes, 0.2 mL | Axygen | PCR-02D-C | |
| UltraPure 0.5M EDTA, pH 8.0 | ThermoFisher | 15575020 | |
| PBS, pH 7.4, Ca2+ and Mg2+ free | ThermoFisher | 10010023 | |
| 1.0 M NaOH (1.0N) solution | SIGMA-ALDRICH | S2567 | For Melt-off solution. Molecular grade |
| Eppendorf LoBind Tubes, 1.5 mL | Fisher Scientific | 13-698-791 | |
| Ion Plus Fragment Library Kit | ThermoFisher | 4471252 | |
| ELGA PURELAB Flex 3 Water Purification System or Equivalent 18 MΩ water system |
ThermoFisher | 4474524 | |
| Ion Plus Fragment Library Kit | ThermoFisher | 4471252 | |
| PicoPLEX WGA Amplification buffer | Rubicon Genomics | R30050 | This can be replaced by SurePlex DNA Amplification System,catalog number: PR-40-415101-03. |
| PicoPLEX WGA Amplification enzyme | Rubicon Genomics | R30050 | This can be replaced by SurePlex DNA Amplification System,catalog number: PR-40-415101-03. |
| Ion OneTouch Amplification Plate | In kit: Ion OneTouch 2 Supplies (Part No. A26367). Extended kit component in Sheet 5 | ||
| Ion PI Annealing Buffer | |||
| MyOne Beads Capture Solution | |||
| Agilent 2100 Bioanalyzer instrument | Agilent | G2939AA | |
| Ion OneTouch Breaking Solution (black cap) | In kit: Ion PI Hi?Q OT2 Solutions 200 (Part No. A26429). Extended kit component in Sheet 5 | ||
| Dynabeads MyOne Streptavidin C1 | ThermoFisher | 65001 | |
| PicoPLEX WGA Cell extraction buffer | Rubicon Genomics | R30050 | This can be replaced by SurePlex DNA Amplification System,catalog number: PR-40-415101-00. |
| PicoPLEX WGA Cell extraction enzyme | Rubicon Genomics | R30050 | This can be replaced by SurePlex DNA Amplification System,catalog number: PR-40-415101-03. |
| Ion PI Chip Kit v3 | ThermoFisher | A26771 | |
| Ion Chip Minifuge, 230 V | ThermoFisher | 4479673 | |
| Ion PI dATP | ThermoFisher | A26772 | |
| Ion PI dCTP | ThermoFisher | A26772 | |
| Ion PI dGTP | ThermoFisher | A26772 | |
| Ion Plus Fragment Library Kit | ThermoFisher | 4471252 | |
| Ion Plus Fragment Library Kit | ThermoFisher | 4471252 | |
| ThermoQ–Temperature Dry Bath | TAMAR | HB-T2-A | |
| NEBNext dsDNA Fragmentase | New England Biolabs | M0348L | |
| NEBNext dsDNA Fragmentase | New England Biolabs | M0348L | |
| Ion PI dTTP | ThermoFisher | A26772 | |
| Ion OneTouch 2 Instrument | ThermoFisher | INS1005527 | ThermoFisher Catalog number: 4474778. |
| Ion Plus Fragment Library Kit | ThermoFisher | 4471252 | |
| Ion One Touch ES | ThermoFisher | 8441-22 | ThermoFisher Catalog number: 4469495. Extended kit component in Sheet 5 |
| Ethanol | SIGMA-ALDRICH | 51976 | This can be replaced by any brand's molecular grade absolute ethanol. |
| PicoPLEX WGA Extraction enzyme dilution buffer | Rubicon Genomics | R30050 | This can be replaced by SurePlex DNA Amplification System,catalog number: PR-40-415101-01. |
| PicoPLEX WGA Extraction enzyme dilution buffer | Rubicon Genomics | R30050 | This can be replaced by SurePlex DNA Amplification System,catalog number: PR-40-415101-02. |
| Qubit 3.0 Fluorometer | ThermoFisher | Q33216 | This model has been replaced by Qubit 4 Fluorometer, Catalog number: Q33226. |
| Qubit ds DNA HS Assay kit | ThermoFisher | M2002-02 | |
| Qubit Assay Tubes | ThermoFisher | Q32856 | |
| Ion PI Foaming Solution | ThermoFisher | A26772 | |
| Index for barcoding of libraries | BaseCare | this is a in-house prepared index. Users can buy commercial product from ThermoFisher Ion Xpress Barcode Adapters Kits (Cat. No. 4474517) | |
| Ion PI Loading Buffer | ThermoFisher | A26772 | |
| Solid(TM) Buffer Kit-1X Low TE Buffer | ThermoFisher | 4389764 | |
| Agencour AMPure XP Kit | Beckman Coulter | A63880 | |
| DynaMag-2 magnet (magnetic rack) | ThermoFisher | 12321D | |
| Ion PI Master Mix PCR buffer | |||
| Sorvall Legend Micro 17 Microcentrifuge | Micro 17 | 75002430 | |
| Ion Plus Fragment Library Kit | ThermoFisher | 4471252 | |
| Nuclease-free water | ThermoFisher | AM9922 | This can be replaced by other brand. |
| PicoPLEX WGA Nuclease-free water | Rubicon Genomics | R30050 | This can be replaced by SurePlex DNA Amplification System,catalog number: PR-40-415101-03. |
| Ion OneTouch Oil bottle | Ion PI Hi?Q OT2 Solutions 200 (Part No. A26429). Extended kit component in Sheet 5 | ||
| Ion Plus Fragment Library Kit | ThermoFisher | 4471252 | Extended kit component in Sheet 3 |
| double-strand DNA standard | This is a in-house prepared DNA standard for calibration of Qubit before quantification of library. | ||
| PicoPLEX WGA Preamplification buffer | Rubicon Genomics | R30050 | This can be replaced by SurePlex DNA Amplification System,catalog number: PR-40-415101-03. |
| PicoPLEX WGA Preamplification enzyme | Rubicon Genomics | R30050 | This can be replaced by SurePlex DNA Amplification System,catalog number: PR-40-415101-03. |
| Library Amplification Primer Mix | ThermoFisher | 4471252 | Extended kit component in Sheet 3 |
| Ion OneTouch Reaction Filter | Extended kit component in Sheet 5 | ||
| Recovery Router | Extended kit component in Sheet 5 | ||
| Recovery Tubes | Extended kit component in Sheet 5 | ||
| ISP Resuspension Solution | |||
| Ion Proton | ThermoFisher | DA8600 | This model is imported by Da An Gene Co.,LTD. of Sun Yat-Sen University from ThermoFisher and has been certified by China Food and Drug Administration for clinical application. The catalog number in ThermoFisher is 4476610. |
| Ion PI Hi?Q Sequencing Polymerase | ThermoFisher | A26772 | |
| Ion PI Sequencing Primer | |||
| server for sequencer | Lenovo | T260 | |
| Ion PI Sphere Particles | |||
| Platinum PCR SuperMix High Fidelity | ThermoFisher | 4471252 | |
| Nalgene 25mm Syringe Filters | ThermoFisher | 724-2045 | Pore size: 0.45μm. Specifically for aqueous fluids. |
| Ion PI Hi?Q W2 Solution | ThermoFisher | A26772 | |
| Ion PI 1X W3 Solution | ThermoFisher | A26772 | |
| Ion OneTouch Wash Solution C1 | |||
| The Ion PGM Hi?Q View Sequencing Kit | ThermoFisher | A30044 | Extended kit component in Sheet 2 |
| Ion Plus Fragment Library Kit | ThermoFisher | 4471252 | Extended kit component in Sheet 3 |
| Ion PI Hi-Q Sequencing 200 Kit (1 sequencing run per initialization) | ThermoFisher | A26772 | Extended kit component in Sheet 4 |
| Ion PI Hi?Q OT2 200 Kit | ThermoFisher | A26434 | Extended kit component in Sheet 5 |
References
- Balaban, B., Urman, B. Effect of oocyte morphology on embryo development and implantation. Reproductive BioMedicine Online. 12 (5), 608-615 (2006).
- Capalbo, A., et al. Correlation between standard blastocyst morphology, euploidy and implantation: An observational study in two centers involving 956 screened blastocysts. Human Reproduction. 29 (6), 1173-1181 (2014).
- Magli, M. C., Gianaroli, L., Ferraretti, A. P.
- Trussler, J. L., Pickering, S. J., Ogilvie, C. M. Investigation of chromosomal imbalance in human embryos using comparative genomic hybridization. Reproductive BioMedicine Online. 8 (6), 701-711 (2004).
- Fragouli, E., et al. Cytogenetic analysis of human blastocysts with the use of FISH, CGH and aCGH: Scientific data and technical evaluation. Human Reproduction. 26 (2), 480-490 (2011).
- Calhaz-Jorge, C., et al. Assisted reproductive technology in Europe, 2013: Results generated from European registers by ESHRE. Human Reproduction. 32 (10), 1957-1973 (2017).
- Dyer, S., et al. International committee for monitoring assisted reproductive technologies world report: Assisted reproductive technology 2008, 2009 and 2010. Human Reproduction. 31 (7), 1588-1609 (2008).
- Dahdouh, E. M., Balayla, J., García-Velasco, J. A. Comprehensive chromosome screening improves embryo selection: A meta-analysis. Fertility and Sterility. 104 (6), 1503-1512 (2015).
- Chen, M., Wei, S., Hu, J., Quan, S. Can Comprehensive Chromosome Screening Technology Improve IVF/ICSI Outcomes? A Meta-Analysis. PloS One. 10 (10), e0140779 (2015).
- Northrop, L. E., Treff, N. R., Levy, B., Scott, J. T. SNP microarray-based 24 chromosome aneuploidy screening demonstrates that cleavage-stage FISH poorly predicts aneuploidy in embryos that develop to morphologically normal blastocysts. Molecular Human Reproduction. 16 (8), 590-600 (2010).
- Barbash-Hazan, S., et al. Preimplantation aneuploid embryos undergo self-correction in correlation with their developmental potential. Fertility and Sterility. 92 (3), 890-896 (2009).
- Fragouli, E., et al. Comprehensive cytogenetic analysis of the human blastocyst stage. Fertility and Sterility. 90 (11), S36 (2008).
- Fiorentino, F., et al. Development and validation of a next-generation sequencing-based protocol for 24-chromosome aneuploidy screening of embryos. Fertility and Sterility. 101 (5), 1375-1382 (2014).
- Fiorentino, F., et al. Application of next-generation sequencing technology for comprehensive aneuploidy screening of blastocysts in clinical preimplantation genetic screening cycles. Human Reproduction. 29 (12), 2802-2813 (2014).
- Wells, D., et al. Clinical utilisation of a rapid low-pass whole genome sequencing technique for the diagnosis of aneuploidy in human embryos prior to implantation. Journal of Medical Genetics. 51 (8), 553-562 (2014).
- Quail, M. A., et al. A tale of three next generation sequencingplatforms: comparison of Ion Torrent, PacificBiosciences and Illumina MiSeq sequencers. BMC Genomics. 13 (1), 1-13 (2012).
- Goodwin, S., McPherson, J. D., McCombie, W. R. Coming of age: ten years of next-generation sequencing technologies. Nature Reviews Genetics. 17 (6), 333-351 (2016).
- Bono, S., et al. Validation of a semiconductor next-generation sequencing-based protocol for preimplantation genetic diagnosis of reciprocal translocations. Prenatal Diagnosis. 35 (10), 938-944 (2015).
- Harton, G. L., et al. ESHRE PGD Consortium/Embryology Special Interest Groupbest practice guidelines for polar body and embryo biopsy for preimplantation genetic diagnosis/screening (PGD/PGS). Human Reproduction. 26 (1), 41-46 (2011).
- Liu, W. Q., et al. The performance of MALBAC and MDA methods in the identification of concurrent mutations and aneuploidy screening to diagnose beta-thalassaemia disorders at the single- and multiple-cell levels. Journal of Clinical Laboratory Analysis. 32 (2), 1-8 (2018).
- Zhang, X., et al. The comparison of the performance of four whole genome amplification kits on ion proton platform in copy number variation detection. Bioscience Reports. 37 (4), BSR20170252 (2017).
- Munné, S., Grifo, J., Wells, D. Mosaicism: “survival of the fittest” versus “no embryo left behind”. Fertility and Sterility. 105 (5), 1146-1149 (2016).
- Del Carmen Nogales, M., et al. Type of chromosome abnormality affects embryo morphology dynamics. Fertility and Sterility. 107 (1), 229-235 (2017).
- Harton, G. L., et al. ESHRE PGD consortium best practice guidelines for amplification-based PGD. Human Reproduction. 26 (1), 33-40 (2011).
- Deleye, L., et al. Shallow whole genome sequencing is well suited for the detection of chromosomal aberrations in human blastocysts. Fertility and Sterility. 104 (5), 1276-1285 (2015).
- Bielanska, M., Tan, S. L., Ao, A. Chromosomal mosaicism throughout human preimplantation development in vitro: incidence, type, and relevance to embryo outcome. Human Reproduction. 17 (2), Oxford, England. 413-419 (2002).
- Treff, N. R., et al. Evaluation of targeted next-generation sequencing-based preimplantation genetic diagnosis of monogenic disease. Fertility and Sterility. 99 (5), 1377-1384 (2013).
