In Vitro Tumor Zelle Rechallenge für vorausschauende Bewertung der Chimeric Antigen-Rezeptor-T-Zell-Antitumor-Funktion

Immuntherapie mit Chimären Antigen-Rezeptor (Auto)-entwickelte T-Zellen gesehen hat viel versprechende Ergebnisse gegen B-Zellen Malignome^1,2,3,4, während das Potenzial des Zielens anderen Tumoren nach wie vor unter strenge Untersuchung^5,6,7. Große Fortschritte erzielt worden, zur Optimierung der Auto-Konstrukt, Herstellungsprozess und geduldig Pre-Infusion Regimen^6,7,8, und neuartige synthetische Biologie Ansätze sind voraussichtlich erhöhen ihre Beständigkeit, Sicherheit und Tumor zu Spezifität^9,10. Es war jedoch schwierig und arbeitsintensiv das therapeutische Potenzial von Auto-T-Zellen um die beste Wahl für klinische Übersetzung führen entsprechend zu bewerten. Die etabliertesten Modell ist bisher um Auto T-Zellfunktion zu bewerten in immungeschwächte Mäuse mit menschlichen Tumor Xenografts, wobei Auto T-Zellen sind für die Antitumor-Wirkung untersucht und verglichen um betitelten Zelle Dosen^{11,12 , 13 , 14 , 15}. diese murinen Studien in vivo sind arbeitsintensiv und zeitaufwändig, vor allem, wenn große Anzahl von Parametern screening. Weitere, in-vivo Studien können durch die Zugänglichkeit von Mausstämme, Tierbetreuung Einrichtungen und Tier Handhabungstechniken zurückgehalten werden. Daher gibt es eine Notwendigkeit, bequemere in-vitro-Untersuchungen ermöglichen schnelle Ablesung Effektor Aktivität, die auch treu die in-vivo Antitumor-Funktion dieser T-Zellen widerspiegeln zu entwickeln.

Herkömmliche Methoden zur Bestimmung der Zytotoxizität von T-Zellen in vitro konzentrierten sich auf die Erkennung von Degranulation, Produktion von Zytokinen und die Fähigkeit, Radioisotopen-markierten Zielzellen (z.B. Chrom-Release-Assays) zu lösen. Während diese Assays für die Definition von Auto T Zelle Spezifität und umgeleitete Zielerfassung informativ sind, sie nicht oft in-vivo Antitumor-Potential veränderter T Zellen^12,13,16wider. Tötung Aktivität in kurzfristige Tests zeigten in bestimmten Fällen in Vitro eine inverse Korrelation mit in-vivo Antitumor-Funktion¹⁶. Diese Inkonsistenz ist wahrscheinlich das Ergebnis der hohen Effektor: Ziel (E:T) Verhältnisse in dieser in-vitro-Untersuchungen, und daher die Unfähigkeit, um Auto T Zelle Produkte zu unterscheiden, die anfällig für Erschöpfung¹⁷verwendet. Im Gegensatz dazu reagieren während der in-vivo Tumor Beseitigung T Zellen in der Regel gegen großen Tumor Belastungen, damit erfordern mehrere Runden von töten und anschließend fahren T Zelle Differenzierung und Erschöpfung^{18,19, 20}, ist eines der größten Hindernisse gegen effektive Tumor Freigabe durch Auto T Zellen^12,13. Unterdessen tun meist kurzfristige in-vitro-Tötung-Assays auch nicht auslesen Unterschiede in der T-Zell-Proliferation, während im Auto T Zelle behandelt Patienten die Kapazität für Auto T Zelle Expansion stark mit klinischen Reaktionen^{4 korreliert ist}. So die entsprechenden in-vitro-Assay müssten Bedingungen hoher Tumorlast, Induktion von T-Zell-Erschöpfung, rekapitulieren und ermöglicht das Auslesen der T-Zell-Expansion.

Hier beschreiben wir eine Strategie, um Auto-T-Zellen für sich wiederholende Tumor töten Potenzial, mit einem einfachen in-vitro-Kokultur Assay zu bewerten. Verschiedene T-Zell-Effektor Aktivitätsparametern können gleichzeitig untersucht werden, einschließlich Ziel Zelle Tötung, CAR T Zelle Expansion und Speicher oder Erschöpfung verbundenen Phänotypen. Die Ergebnisse dieser Assay korreliert gut mit der in-vivo antitumor-Wirkung von Auto-T-Zellen und können genutzt werden, um die Potenz des CAR T Zelle Produkte zu bewerten. Während wir einen Test zur Beurteilung der IL13Ra2 ausgerichtete Auto T-Zellen gegen primäre GBM Linien²¹beschreiben, kann es leicht zu jedem Auto T-Zelle-Plattform angepasst werden.

Unser IRB erfordert keine Überprüfung dieses Protokolls. Ausrangierte frische Glioblastom Tumorproben erhalten wir aus der Stadt der Hoffnung Pathologie-Abteilung, die codiert sind, und unser Labor keinen Zugriff auf den Schlüssel. Wir erhalten die Exemplare mit Daten nur auf vorherige Behandlung und Krankheit Zustand zum Zeitpunkt der Biopsie/Resektion ohne identifizierende Daten.

(1) Media-Vorbereitung

1. Bereiten Sie neurale Stammzellen Medien für die Kultivierung der primären GBM-Zell-Linien: DMEM:F12, 01:50 B27, 5 µg/mL Heparin und 2 Mmol/L L-Glutamin; zweimal in der Woche mit 20 ng/mL epidermalen Wachstumsfaktor (EGF) und 20 ng/mL grundlegende Fibroblasten-Wachstumsfaktor (FGF) ergänzt (siehe Tabelle der Materialien).
2. Bereiten Sie T-Zell-Medien: X-VIVO 15 mit 10 % fetalen Kälberserum (FCS); ergänzt mit 70 IU/mL RhIL-2 und 0,5 ng/mL RhIL-15 alle 48 Stunden (siehe Tabelle der Materialien).
3. Bereiten Sie Kokultur Medien: neurale Stammzellen Medien ohne EGF und FGF Ergänzung zu nehmen, und fügen Sie 10 % FCS.
4. FACS Färbelösung (FSS) vorbereiten: HBSS, 2 % FCS, NaN₃ (0,5 g/500 mL).

2. Vorbereitung des GBM Tumor-Zellen

1. Niedrig-Passage GBM Tumor Sphären (TSs) durch Zentrifugation bei 300 X g für 4 min ernten und überstand verwerfen.
   Hinweis: GBM Tumor erstellten Sphären (TSs) von resezierten Tumoren wie zuvor beschrieben^22,23,24, und gepflegt in neuronalen Stammzellen Medien in Brutkästen mit 5 % CO₂ bei 37 ° C.
2. Wärmen Sie Co Kulturmedien in einem 37 ° C-Wasserbad vor.
3. GBM TSs 1 mL kalte Accutase hinzufügen, TSs durch Pipettieren für 30-60 s zu distanzieren und Dissoziation durch Zugabe von 5 mL warme Co Nährmedien zu stoppen.
   Hinweis: GBM TSs sollte nicht auf Accutase für mehr als 5 min gehalten werden.
4. GBM-Zellen durch Zentrifugation bei 300 X g für 4 min ernten, überstand verwerfen und Zellen in 2 mL Co Nährmedien aufzuwirbeln.
5. Zellkonzentration Zelle Lebensfähigkeit Zähler zu bestimmen.
   Hinweis: Zellviabilität muss > 70 %.

3. Vorbereitung der Auto-T-Zellen

1. Weniger als 24 Stunden vor dem Test, nehmen Sie 100 µL der kultivierten CAR T-Zellen in ein Flow Cytometry Rohr und 2 mL FSS.
   Hinweis: CAR-T-Zellen wurden generiert, wie oben beschrieben^11,21 und in T-Zell-Medien kultiviert.
2. Zentrifugation bei 300 X g für 4 min und überstand verwerfen.
3. 2 mL der FSS, Zellen, Zentrifuge bei 300 X g für 4 min waschen und verwerfen Sie überstand.
4. Färben Sie die Zellen mit entsprechenden Antikörper Auto Ausdruck bei 4 ° C für 30 min an.
   Hinweis: Zum Beispiel, wenn eine IL13Rα2 ausgerichtete Auto beschrieben zuvor²⁵ dient, dann färben mit Anti-IL13 Antikörper.
5. Waschen Sie zweimal mit 2 mL der FSS und Auto Exn mit einem Durchflusszytometer analysiert.
6. Bestimmen Sie die Auto % auf T-Zellen mit Hilfe der gating Strategie, die in Abbildung 1Bgezeigt.
7. Am Tag der Kokultur ernten Sie alle Auto-T-Zellen durch Zentrifugation bei 300 X g für 4 min, verwerfen Sie überstand und Aufschwemmen Sie Zellen in 2 mL Co Nährmedien.
8. Zellkonzentration Zelle Lebensfähigkeit Zähler zu bestimmen.
   Hinweis: Zellviabilität muss > 70 %.

4. richten Sie Tumor — T Co Zellkultur

1. Verdünnen Sie Tumorzellen zu einer Konzentration von 0,16 Millionen/mL mit Co Nährmedien.
2. Basierend auf dem Auto %, verdünnen Sie Auto T-Zellen zu einer Konzentration von 0,04 Millionen Auto⁺ Zellen/mL mit Co Nährmedien.
   Hinweis: Beispielsweise wenn das Auto 50 ist % und T-Zell-Konzentration 0,4 Millionen/mL beträgt, dann machen Sie eine 1:5 Verdünnung die Endkonzentration von 0,04 Millionen Auto⁺ Zellen/mL zu erhalten.
3. Pipette 100 µL verdünnter Tumorzellen in jede Vertiefung einer 96-Well flach-Boden Gewebekultur-Platte.
4. Pipette 100 µL verdünnter Auto T-Zellen in jedem Brunnen, die Tumorzellen und Mischung gut enthält.
   Hinweis: Jeder Tumor-T Co Zellkultur wird zu 4 Zeitpunkten analysiert werden. 4-6 Wiederholungen ist möglicherweise erforderlich an, jedes Mal, wenn Punkt basiert auf verschiedenen Analyse, aber < 3 Wiederholungen pro Zeitpunkt wird nicht empfohlen; siehe Tabelle 1 für eine repräsentative Platemap.
5. Pflegen Sie die Platte in einem 37 ° C, 5 % CO₂ Inkubator.

(5) Tumor Zelle Rechallenge

Hinweis: Reprovokation erfolgt auf 2, 4 und 6 Tage nach der ersten Kokultur Setup (Abbildung 1A).

1. Ernte und GBM TSs zu distanzieren, wie oben (Schritte 2.1-2.6) beschrieben.
2. Aufschwemmen Sie GBM-Zellen in einer Konzentration von 0,64 Millionen/mL.
3. Bestimmen der Kokultur Brunnen, die Reprovokation benötigen (siehe Tabelle 1) und entfernen Sie vorsichtig von oben auf jede Vertiefung 50 µL Medien.
4. Fügen Sie 50 µL Zellsuspension GBM in jede Vertiefung hinzu und mischen Sie gut, dann setzen Sie die Platte wieder in einem 37 ° C, 5 % CO₂ Inkubator.

6. Ernte Proben und fließen durchflusszytometrischen Analyse

Hinweis: Proben werden auf 1, 3, 5 und 7 Tage nach das erste Kokultur Setup mit 1, 2, 3 und 4 Runden Tumor Herausforderung bzw. geerntet werden.

1. Wärmen Sie 0,05 % Trypsin-EDTA-Lösung bei 37 ° C Wasserbad vor.
2. Bestimmen Sie die Brunnen, die Ernte und die Medien in eine neue Rundboden-96-Well-Platte zu übertragen.
3. Pipette 50 µL Trypsin-EDTA in die Vertiefungen, verbleibende Tumorzellen bei 37 ° C für 5 min zu verdauen.
4. Bestätigen Sie unter dem Mikroskop, dass die Zellen von der Unterseite getrennt haben.
5. Pipette, um den gut Boden aufzuwirbeln freistehende Zellen, dann Trypsin-EDTA freistehende Zellen in die entsprechenden Vertiefungen Rundboden-96-Well-Platte zu übertragen.
6. Zentrifuge Rundboden-96-Well-Platte 300 X g, 4 ° C für 4 min, dann verwerfen Sie überstand.
7. Fügen Sie 200 µL/Well des FSS, Zellen, Zentrifuge bei 300 X g, 4 ° C für 4 min zu waschen, dann verwerfen Sie überstand.
8. Aufschwemmen Zellen in 100 µL/Well FSS mit Antikörpern (siehe Tabelle der Materialien) und Fleck-Zellen bei 4 ° C für 30 min.
9. 100 µL/Well FSS zu Zellen hinzufügen, Zentrifugieren bei 300 X g, 4 ° C für 4 min, dann verwerfen überstand.
10. Fügen Sie 200 µL/Well des FSS, Zellen, Zentrifuge bei 300 X g, 4 ° C für 4 min zu waschen, dann verwerfen Sie überstand.
11. Aufzuwirbeln Sie Zellen mit 100-200 µL/Well des FSS mit 500 ng/mL DAPI, dann analysieren Sie Proben von Durchflusszytometrie.

7. funktionale und die Phen Otypic Analyse von Auto-T-Zellen

1. Die Datendateien von Durchflusszytometer abzurufen, und alle lebenden (DAPI)-Zellen (Abbildung 1C) Tor.
2. Quantifizierung von Tumorzellen durch die CD45 gating^– Bevölkerung und Auto-T-Zellen durch die CD45 gating⁺, Auto + Bevölkerung (Abbildung 1C).
   Hinweis: Wenn die Tumorzellen CD45 ausdrücken (z. B. Raji Lymphom-Zellen), Anti-CD3 Färbung kann verwendet werden, um T-Zellen von Tumorzellen unterscheiden.
3. Tumorzelle Grundstück und Auto T-Zellzahl durch den zeitlichen Verlauf.
4. T-Zell-Aktivierung von Co Ausdruck 4-1BB und CD69 zu identifizieren.
   Hinweis: Dieser Oberflächenmarker lässt sich die T-Zell Aktivierung 6-24 h Post erste Kokultur analysieren.
5. T-Zell-Erschöpfung durch die Expression von PD-1, LAG-3 und TIM-3 zu identifizieren.
6. T-Zell-Speicherstatus durch die Expression von CD45RO und CD62L zu identifizieren.

Mit Hilfe des oben beschriebenen Tests, wir haben die differenzielle Effektor Potenz unterschieden und töten Dynamik vermittelt durch CD4+ und CD8+ CAR T Zellen. Die hier vorgestellten Ergebnisse verdeutlichen den Unterschied zwischen CD4+ und CD8+ CAR T Zellen eines gesunden Spenders unabhängig von unserer früheren Publikation21erzeugt.

Durch einen standard Degranulation-Assay, konnten wir beobachten, dass beide CD4+ und CD8+ CAR T Zellen wurde ebenso gegen GBM-Zellen, die das gezielte Antigen ausdrücken aktiviert, wie durch die Expression von CD107a und intrazellulären Zytokin angegeben (Abb. 2A). Jedoch mit den sich wiederholenden Tumor Herausforderung Assay, wir fanden, dass CD4+ aber nicht CD8+ CAR T Zellen die Fähigkeit, mehrere Runde Tötung (Abbildung 2B) ausgestellt. CD4+ CAR T Zellen auch erzielten bessere Ausbau im Vergleich zu CD8 +-Zellen während dieser Assay (Abbildung 2C). Die Differenz der Ausdehnung zwischen Auto T Zelle Teilmengen wurden nur von D3 nach zwei Runden der Tumor Herausforderung (1:12 E:T) beobachtet, während die Differenz der Zytotoxizität beobachtet wurde, beginnend mit D5 nach drei Runden der Tumor Challenge (1:20 E:T), darauf hinweist, dass kurzfristige Assays fehlgeschlagen, Unterschiede in der Wirksamkeit verschiedener CAR T Zelle Produkte aufzuklären. Wenn das 1:1 gemischt CD4+ und CD8+ CAR T Zellen wurden in diesem Test angewendet, sie erwiesen sich als CD8 übertreffen+ aber nicht CD4+ CAR T Zellen auf langfristige Zytotoxizität (Abbildung 2B). Der Ausbau der CD8+ CAR T Zellen wurde durch die Co angewandte CD4 induziert+ Zellen, während CD4+ CAR T Zelle Expansion wurde im Beisein von CD8 gehemmt+ Zellen (Abbildung 2C).

Um den Mechanismus zu erklären, die die Effektor-Aktivität zwischen CD4 unterscheidet+ und CD8+ CAR T Zellen, bestätigen wir zuerst, dass 24 h nach anfänglichen Co Kultur, beide CD4+ und CD8+ CAR T Zellen waren vergleichsweise aktiviert (Abbildung 3 A). In der Zwischenzeit, wie durch CD45RO und CD62L Ausdruck, beide CD4+ und CD8+ CAR T Zellen zeigten einen Übergang aus dem zentralen Speicher (CD45RO+, CD62L+) Effektor Speicher (CD45RO+, CD62L–) Phänotyp Während sich wiederholende Tumor Challenge (Abbildung 3B). Dann wir die Zellen am D3 des Assays, zeichnet sich eine Zeit bevor die Auto T Zelle Teilmengen funktionalen Unterschied anzeigen. T-Zell-Erschöpfung war geprägt von der Co Ausdruck der inhibitorischen Rezeptoren PD-1, LAG-3 und TIM-315,21, die zeigten, dass CD8+ CAR T Zellen wurden anfälliger für Erschöpfung im Vergleich mit CD4+ CAR T Zellen () Abbildung 3 C). Darüber hinaus keinen Unterschied auf CD8 galt+ CAR T Zelle Erschöpfung in die Anwesenheit/Abwesenheit von Co angewandte CD4+ Zellen (Abb. 3C), darauf hinweist, dass CD4-induzierte CD8+ CAR T Zelle Expansion ist nicht eine bessere Effektor-Funktion zugeordnet.

Zusammen, die Ergebnisse aus diesem Test festgestellt, dass CD4+ CAR T überflügelt CD8-Zellen+ Zellen insbesondere langfristige Zytotoxizität. Trotz der ähnlichen kurzfristigen Zytotoxizität (1-3 Tage, einmal rechallenged), CD4+ CAR T Zellen nachhaltig Effektor-Funktion auf sich wiederholende Tumor, während CD8+ Zellen wurde erschöpft und versagt, Zelle Wachstum des Tumors zu kontrollieren. Wenn die zwei Teilmengen gemischt wurden, CD4+ CAR T Zellen erleichtert den Ausbau der CD8+ Auto T-Zellen, aber die Erschöpfung Status der CD8+ Zellen wurden nicht gebessert, was das Fehlen von synergistischen Effekt zwischen den beiden Gruppen. Ähnliche Unterschied zwischen CD4+ und CD8+ CAR T Zellen wurde als zuvor beschriebenen21in einem in-vivo Modell. In der Tat CD8+ CAR T Zellen waren in der Lage, kurzfristige Tumor Abstand aber gefolgt mit Antigen-Positive Wiederholung; zu vermitteln im Gegensatz dazu CD4+ CAR T Zelle Behandlung führte zu langfristigen Tumor Beseitigung21, erinnert sich wiederholende Tötung Potenzial mit Hilfe der in-vitro-Reprovokation Assay.

Abbildung 1 : Schema und Analyse Strategie der sich wiederholenden Herausforderung Assay. (A) Schema und Timeline der sich wiederholenden Tumor Herausforderung Assay. Für jedes gut waren Auto T-Zellen zuerst zusammen mit PBT030-2 GBM-Zellen (4.000 Auto + Zellen, 16.000 Tumorzellen) kultiviert und neu herausgefordert mit 32.000 Tumorzellen jeden zweiten Tag (D2, D4 und D6). Analyse der Tumorzelle sowie Auto T-Zellzahl und Auto T Zelle Phänotyp erfolgt auf D1, D3, D5 und D7. (B) Gating Strategie ermitteln, Auto % T Zellen vor dem Einrichten der Kokultur. (C) Gating Strategie von lebenden Zellen, Tumorzellen und Auto-T-Zellen aus der sich wiederholenden Herausforderung-Assay. (D) Tumorzellen Anzahl zu verschiedenen Zeiten des Rechallenge Assays, zusammen mit untransduced T-Zellen kultiviert. Fehlerbalken = ±SEM. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Abbildung 2 : Sich wiederholende Herausforderung Assay ergeben sich Unterschiede in der Tötung und proliferative Potenz zwischen CD4+ und CD8+ CAR T Zellen. (A) Degranulation und intrazellulären Zytokin Färbung von CD4+ und CD8+ Auto T-Zellen nach 5 h Kokultur mit GBM-Zellen (E:T = 1:1). (B) CD4+, CD8+ oder gemischt (CD4:CD8 = 1:1) Auto-T-Zellen wurden auf wiederkehrende Herausforderung Assay angewendet und lebensfähigen Tumorzellen wurden quantifiziert. p < 0,05, **p < 0,01 ***p < 0,001 verglichen mit CD4+, mit One-Way ANOVA mit Bonferroni mehrere Vergleichstests. (C) CD4+ und CD8+ CAR T Zelle Expansion während sich wiederholende Tumor Herausforderung Assay. Vergleich von (links nach rechts) CD4+ Vs CD8+, einzelne Teilmenge; CD4+ Vs CD8+, innerhalb der "gemischten" Gruppe; CD4+, einzelne Vs gemischt; CD8+, einzelne Vs gemischt. p < 0,05, **p < 0,01 ***p < 0,001 mit einem ungepaarten Student t -Test. Fehlerbalken = ±SEM. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Abbildung 3 : Analyse des T-Zell-Phänotyp bei sich wiederholenden Herausforderung Assay. (A) 4-1BB und CD69 Flecken auf Auto-T-Zellen bei D1 des Assays. (B) CD45RO und CD62L Färbung des Auto-T-Zellen vor dem Auftragen um rechallenge Assay (input) und D3 und D7 des Assays. (C) Co Ausdruck des PD-1, LAG-3 und TIM-3 auf Auto-T-Zellen bei D3 des Assays. (Oben) Gating Strategien, T-Zellen, die mit dem Ausdruck 1, 2 oder 3 inhibitorischen Rezeptoren zu identifizieren. (Unten) Vergleich: CD4+ Zellen (einzelne Teilmenge), CD8+ Zellen (einzelne Teilmenge), CD8 Zellen+ (innerhalb der "gemischten" Gruppe). Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Tabelle 1: Repräsentative Platte Karte Reprovokation Setup.

Das Auto-Konstrukt beschrieben in dieser Arbeit wurden lizenziert von Mustang Bio., Inc., für die S.J.F. und C.E.B Zahlungen von Lizenzgebühren erhält. Alle anderen Autoren erklären keine Interessenkonflikte.