Name: In Vitro Tumor Zelle Rechallenge für vorausschauende Bewertung der Chimeric Antigen-Rezeptor-T-Zell-Antitumor-Funktion (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-02-27T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 4 s
Description: Lernen Sie eine in-vitro-Co-Kultur-Methode zur funktionellen Bewertung von CAR-T-Zellen durch repetitive Tumorzell-Herausforderungen. Diese Technik ermöglicht die Hochdurchsatzanalyse der antitumorale Wirksamkeit.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse vom California Institute for Regenerative Medicine (CIRM) Grant TR3-05641 und NIH-Stipendien P30 CA33572 (Kerne) unterstützt. D.w. wird unterstützt von NCI-Stipendium 1F99CA234923-01.

Unser IRB erfordert keine Überprüfung dieses Protokolls. Ausrangierte frische Glioblastom Tumorproben erhalten wir aus der Stadt der Hoffnung Pathologie-Abteilung, die codiert sind, und unser Labor keinen Zugriff auf den Schlüssel. Wir erhalten die Exemplare mit Daten nur auf vorherige Behandlung und Krankheit Zustand zum Zeitpunkt der Biopsie/Resektion ohne identifizierende Daten.
(1) Media-Vorbereitung
<ol><li>Bereiten Sie neurale Stammzellen Medien für die Kultivierung der primären GBM-Zell-Linien: DMEM:F12, 01:50 B27, 5 µg/mL Heparin und 2 Mmol/L L-Glutamin; zweimal in der Woche mit 20 ng/mL epidermalen Wachstumsfaktor (EGF) und 20 ng/mL grundlegende Fibroblasten-Wachstumsfaktor (FGF) ergänzt (siehe Tabelle der Materialien).</li>
	<li>Bereiten Sie T-Zell-Medien: X-VIVO 15 mit 10 % fetalen Kälberserum (FCS); ergänzt mit 70 IU/mL RhIL-2 und 0,5 ng/mL RhIL-15 alle 48 Stunden (siehe Tabelle der Materialien).</li>
	<li>Bereiten Sie Kokultur Medien: neurale Stammzellen Medien ohne EGF und FGF Ergänzung zu nehmen, und fügen Sie 10 % FCS.</li>
	<li>FACS Färbelösung (FSS) vorbereiten: HBSS, 2 % FCS, NaN3 (0,5 g/500 mL).</li>
</ol>2. Vorbereitung des GBM Tumor-Zellen
<ol><li>Niedrig-Passage GBM Tumor Sphären (TSs) durch Zentrifugation bei 300 X g für 4 min ernten und überstand verwerfen. Hinweis: GBM Tumor erstellten Sphären (TSs) von resezierten Tumoren wie zuvor beschrieben22,23,24, und gepflegt in neuronalen Stammzellen Medien in Brutkästen mit 5 % CO2 bei 37 ° C.</li>
	<li>Wärmen Sie Co Kulturmedien in einem 37 ° C-Wasserbad vor.</li>
	<li>GBM TSs 1 mL kalte Accutase hinzufügen, TSs durch Pipettieren für 30-60 s zu distanzieren und Dissoziation durch Zugabe von 5 mL warme Co Nährmedien zu stoppen. Hinweis: GBM TSs sollte nicht auf Accutase für mehr als 5 min gehalten werden.</li>
	<li>GBM-Zellen durch Zentrifugation bei 300 X g für 4 min ernten, überstand verwerfen und Zellen in 2 mL Co Nährmedien aufzuwirbeln.</li>
	<li>Zellkonzentration Zelle Lebensfähigkeit Zähler zu bestimmen. Hinweis: Zellviabilität muss > 70 %.</li>
</ol>3. Vorbereitung der Auto-T-Zellen
<ol><li>Weniger als 24 Stunden vor dem Test, nehmen Sie 100 µL der kultivierten CAR T-Zellen in ein Flow Cytometry Rohr und 2 mL FSS. Hinweis: CAR-T-Zellen wurden generiert, wie oben beschrieben11,21 und in T-Zell-Medien kultiviert.</li>
	<li>Zentrifugation bei 300 X g für 4 min und überstand verwerfen.</li>
	<li>2 mL der FSS, Zellen, Zentrifuge bei 300 X g für 4 min waschen und verwerfen Sie überstand.</li>
	<li>Färben Sie die Zellen mit entsprechenden Antikörper Auto Ausdruck bei 4 ° C für 30 min an. Hinweis: Zum Beispiel, wenn eine IL13Rα2 ausgerichtete Auto beschrieben zuvor25 dient, dann färben mit Anti-IL13 Antikörper.</li>
	<li>Waschen Sie zweimal mit 2 mL der FSS und Auto Exn mit einem Durchflusszytometer analysiert.</li>
	<li>Bestimmen Sie die Auto % auf T-Zellen mit Hilfe der gating Strategie, die in Abbildung 1Bgezeigt.</li>
	<li>Am Tag der Kokultur ernten Sie alle Auto-T-Zellen durch Zentrifugation bei 300 X g für 4 min, verwerfen Sie überstand und Aufschwemmen Sie Zellen in 2 mL Co Nährmedien.</li>
	<li>Zellkonzentration Zelle Lebensfähigkeit Zähler zu bestimmen. Hinweis: Zellviabilität muss > 70 %.</li>
</ol>4. richten Sie Tumor — T Co Zellkultur
<ol><li>Verdünnen Sie Tumorzellen zu einer Konzentration von 0,16 Millionen/mL mit Co Nährmedien.</li>
	<li>Basierend auf dem Auto %, verdünnen Sie Auto T-Zellen zu einer Konzentration von 0,04 Millionen Auto+ Zellen/mL mit Co Nährmedien. Hinweis: Beispielsweise wenn das Auto 50 ist % und T-Zell-Konzentration 0,4 Millionen/mL beträgt, dann machen Sie eine 1:5 Verdünnung die Endkonzentration von 0,04 Millionen Auto+ Zellen/mL zu erhalten.</li>
	<li>Pipette 100 µL verdünnter Tumorzellen in jede Vertiefung einer 96-Well flach-Boden Gewebekultur-Platte.</li>
	<li>Pipette 100 µL verdünnter Auto T-Zellen in jedem Brunnen, die Tumorzellen und Mischung gut enthält. Hinweis: Jeder Tumor-T Co Zellkultur wird zu 4 Zeitpunkten analysiert werden. 4-6 Wiederholungen ist möglicherweise erforderlich an, jedes Mal, wenn Punkt basiert auf verschiedenen Analyse, aber < 3 Wiederholungen pro Zeitpunkt wird nicht empfohlen; siehe Tabelle 1 für eine repräsentative Platemap.</li>
	<li>Pflegen Sie die Platte in einem 37 ° C, 5 % CO2 Inkubator.</li>
</ol>(5) Tumor Zelle Rechallenge
Hinweis: Reprovokation erfolgt auf 2, 4 und 6 Tage nach der ersten Kokultur Setup (Abbildung 1A).
<ol><li>Ernte und GBM TSs zu distanzieren, wie oben (Schritte 2.1-2.6) beschrieben.</li>
	<li>Aufschwemmen Sie GBM-Zellen in einer Konzentration von 0,64 Millionen/mL.</li>
	<li>Bestimmen der Kokultur Brunnen, die Reprovokation benötigen (siehe Tabelle 1) und entfernen Sie vorsichtig von oben auf jede Vertiefung 50 µL Medien.</li>
	<li>Fügen Sie 50 µL Zellsuspension GBM in jede Vertiefung hinzu und mischen Sie gut, dann setzen Sie die Platte wieder in einem 37 ° C, 5 % CO2 Inkubator.</li>
</ol>6. Ernte Proben und fließen durchflusszytometrischen Analyse
Hinweis: Proben werden auf 1, 3, 5 und 7 Tage nach das erste Kokultur Setup mit 1, 2, 3 und 4 Runden Tumor Herausforderung bzw. geerntet werden.
<ol><li>Wärmen Sie 0,05 % Trypsin-EDTA-Lösung bei 37 ° C Wasserbad vor.</li>
	<li>Bestimmen Sie die Brunnen, die Ernte und die Medien in eine neue Rundboden-96-Well-Platte zu übertragen.</li>
	<li>Pipette 50 µL Trypsin-EDTA in die Vertiefungen, verbleibende Tumorzellen bei 37 ° C für 5 min zu verdauen.</li>
	<li>Bestätigen Sie unter dem Mikroskop, dass die Zellen von der Unterseite getrennt haben.</li>
	<li>Pipette, um den gut Boden aufzuwirbeln freistehende Zellen, dann Trypsin-EDTA freistehende Zellen in die entsprechenden Vertiefungen Rundboden-96-Well-Platte zu übertragen.</li>
	<li>Zentrifuge Rundboden-96-Well-Platte 300 X g, 4 ° C für 4 min, dann verwerfen Sie überstand.</li>
	<li>Fügen Sie 200 µL/Well des FSS, Zellen, Zentrifuge bei 300 X g, 4 ° C für 4 min zu waschen, dann verwerfen Sie überstand.</li>
	<li>Aufschwemmen Zellen in 100 µL/Well FSS mit Antikörpern (siehe Tabelle der Materialien) und Fleck-Zellen bei 4 ° C für 30 min.</li>
	<li>100 µL/Well FSS zu Zellen hinzufügen, Zentrifugieren bei 300 X g, 4 ° C für 4 min, dann verwerfen überstand.</li>
	<li>Fügen Sie 200 µL/Well des FSS, Zellen, Zentrifuge bei 300 X g, 4 ° C für 4 min zu waschen, dann verwerfen Sie überstand.</li>
	<li>Aufzuwirbeln Sie Zellen mit 100-200 µL/Well des FSS mit 500 ng/mL DAPI, dann analysieren Sie Proben von Durchflusszytometrie.</li>
</ol>7. funktionale und die Phen Otypic Analyse von Auto-T-Zellen
<ol><li>Die Datendateien von Durchflusszytometer abzurufen, und alle lebenden (DAPI)-Zellen (Abbildung 1C) Tor.</li>
	<li>Quantifizierung von Tumorzellen durch die CD45 gating– Bevölkerung und Auto-T-Zellen durch die CD45 gating+, Auto + Bevölkerung (Abbildung 1C). Hinweis: Wenn die Tumorzellen CD45 ausdrücken (z. B. Raji Lymphom-Zellen), Anti-CD3 Färbung kann verwendet werden, um T-Zellen von Tumorzellen unterscheiden.</li>
	<li>Tumorzelle Grundstück und Auto T-Zellzahl durch den zeitlichen Verlauf.</li>
	<li>T-Zell-Aktivierung von Co Ausdruck 4-1BB und CD69 zu identifizieren. Hinweis: Dieser Oberflächenmarker lässt sich die T-Zell Aktivierung 6-24 h Post erste Kokultur analysieren.</li>
	<li>T-Zell-Erschöpfung durch die Expression von PD-1, LAG-3 und TIM-3 zu identifizieren.</li>
	<li>T-Zell-Speicherstatus durch die Expression von CD45RO und CD62L zu identifizieren.</li>
</ol>

<ol><li>Porter, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chimeric+antigen+receptor+T+cells+persist+and+induce+sustained+remissions+in+relapsed+refractory+chronic+lymphocytic+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Chimeric antigen receptor T cells persist and induce sustained remissions in relapsed refractory chronic lymphocytic leukemia.</a> Science Translational Medicine. 7 (303), (2015).</li>
<li>Brentjens, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD19-targeted+T+cells+rapidly+induce+molecular+remissions+in+adults+with+chemotherapy-refractory+acute+lymphoblastic+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">CD19-targeted T cells rapidly induce molecular remissions in adults with chemotherapy-refractory acute lymphoblastic leukemia.</a> Science Translational Medicine. 5 (177), (2013).</li>
<li>Grupp, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chimeric+antigen+receptor-modified+T+cells+for+acute+lymphoid+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22The+New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Chimeric antigen receptor-modified T cells for acute lymphoid leukemia.</a> The New England Journal of Medicine. 368 (16), 1509-1518 (2013).</li>
<li>Lee, D. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T+cells+expressing+CD19+chimeric+antigen+receptors+for+acute+lymphoblastic+leukaemia+in+children+and+young+adults%3A+a+phase+1+dose-escalation+trial%5BTitle%5D)+AND+%22The+Lancet%22%5BJournal%5D)">T cells expressing CD19 chimeric antigen receptors for acute lymphoblastic leukaemia in children and young adults: a phase 1 dose-escalation trial.</a> The Lancet. 385 (9967), 517-528 (2015).</li>
<li>Yong, C. S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CAR+T-cell+therapy+of+solid+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Immunology+and+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">CAR T-cell therapy of solid tumors.</a> Immunology and Cell Biology. 95 (4), 356-363 (2017).</li>
<li>Barrett, D. M., Singh, N., Porter, D. L., Grupp, S. A., June, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chimeric+antigen+receptor+therapy+for+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Chimeric antigen receptor therapy for cancer.</a> Annual Review of Medicine. 65, 333-347 (2014).</li>
<li>Priceman, S. J., Forman, S. J., Brown, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Smart+CARs+engineered+for+cancer+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Oncology%22%5BJournal%5D)">Smart CARs engineered for cancer immunotherapy.</a> Current Opinion in Oncology. 27 (6), 466-474 (2015).</li>
<li>Fesnak, A. D., June, C. H., Levine, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineered+T+cells%3A+the+promise+and+challenges+of+cancer+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Cancer%22%5BJournal%5D)">Engineered T cells: the promise and challenges of cancer immunotherapy.</a> Nature Reviews Cancer. 16 (9), 566-581 (2016).</li>
<li>Esensten, J. H., Bluestone, J. A., Lim, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+Therapeutic+T+Cells%3A+From+Synthetic+Biology+to+Clinical+Trials%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">Engineering Therapeutic T Cells: From Synthetic Biology to Clinical Trials.</a> Annual Review of Pathology. 12, 305-330 (2017).</li>
<li>Lim, W. A., June, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Principles+of+Engineering+Immune+Cells+to+Treat+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The Principles of Engineering Immune Cells to Treat Cancer.</a> Cell. 168 (4), 724-740 (2017).</li>
<li>Brown, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+IL13Ralpha2-Targeted+Chimeric+Antigen+Receptor+T+Cells+for+Improved+Anti-tumor+Efficacy+against+Glioblastoma%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy%22%5BJournal%5D)">Optimization of IL13Ralpha2-Targeted Chimeric Antigen Receptor T Cells for Improved Anti-tumor Efficacy against Glioblastoma.</a> Molecular Therapy. , (2017).</li>
<li>Long, A. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((4-1BB+costimulation+ameliorates+T+cell+exhaustion+induced+by+tonic+signaling+of+chimeric+antigen+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">4-1BB costimulation ameliorates T cell exhaustion induced by tonic signaling of chimeric antigen receptors.</a> Nature Medicine. 21 (6), 581-590 (2015).</li>
<li>Cherkassky, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+CAR+T+cells+with+cell-intrinsic+PD-1+checkpoint+blockade+resist+tumor-mediated+inhibition%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Human CAR T cells with cell-intrinsic PD-1 checkpoint blockade resist tumor-mediated inhibition.</a> The Journal of Clinical Investigation. 126 (8), 3130-3144 (2016).</li>
<li>Priceman, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Co-stimulatory+signaling+determines+tumor+antigen+sensitivity+and+persistence+of+CAR+T+cells+targeting+PSCA%2B+metastatic+prostate+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Oncoimmunology%22%5BJournal%5D)">Co-stimulatory signaling determines tumor antigen sensitivity and persistence of CAR T cells targeting PSCA+ metastatic prostate cancer.</a> Oncoimmunology. 7 (2), 1380764(2018).</li>
<li>Eyquem, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+a+CAR+to+the+TRAC+locus+with+CRISPR%2FCas9+enhances+tumour+rejection%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Targeting a CAR to the TRAC locus with CRISPR/Cas9 enhances tumour rejection.</a> Nature. 543 (7643), 113-117 (2017).</li>
<li>Gattinoni, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acquisition+of+full+effector+function+in+vitro+paradoxically+impairs+the+in+vivo+antitumor+efficacy+of+adoptively+transferred+CD8%2B+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Acquisition of full effector function in vitro paradoxically impairs the in vivo antitumor efficacy of adoptively transferred CD8+ T cells.</a> The Journal of Clinical Investigation. 115 (6), 1616-1626 (2005).</li>
<li>Malandro, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clonal+Abundance+of+Tumor-Specific+CD4%28%2B%29+T+Cells+Potentiates+Efficacy+and+Alters+Susceptibility+to+Exhaustion%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Clonal Abundance of Tumor-Specific CD4(+) T Cells Potentiates Efficacy and Alters Susceptibility to Exhaustion.</a> Immunity. 44 (1), 179-193 (2016).</li>
<li>Gattinoni, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wnt+signaling+arrests+effector+T+cell+differentiation+and+generates+CD8%2B+memory+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Wnt signaling arrests effector T cell differentiation and generates CD8+ memory stem cells.</a> Nature Medicine. 15 (7), 808-813 (2009).</li>
<li>Klebanoff, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Central+memory+self%2Ftumor-reactive+CD8%2B+T+cells+confer+superior+antitumor+immunity+compared+with+effector+memory+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Central memory self/tumor-reactive CD8+ T cells confer superior antitumor immunity compared with effector memory T cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (27), 9571-9576 (2005).</li>
<li>Gattinoni, L., Klebanoff, C. A., Restifo, N. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Paths+to+stemness%3A+building+the+ultimate+antitumour+T+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Cancer%22%5BJournal%5D)">Paths to stemness: building the ultimate antitumour T cell.</a> Nature Reviews Cancer. 12 (10), 671-684 (2012).</li>
<li>Wang, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glioblastoma-targeted+CD4%2B+CAR+T+cells+mediate+superior+antitumor+activity%5BTitle%5D)+AND+%22JCI+Insight%22%5BJournal%5D)">Glioblastoma-targeted CD4+ CAR T cells mediate superior antitumor activity.</a> JCI Insight. 3 (10), (2018).</li>
<li>Kahlon, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specific+recognition+and+killing+of+glioblastoma+multiforme+by+interleukin+13-zetakine+redirected+cytolytic+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Specific recognition and killing of glioblastoma multiforme by interleukin 13-zetakine redirected cytolytic T cells.</a> Cancer Research. 64 (24), 9160-9166 (2004).</li>
<li>Brown, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recognition+and+killing+of+brain+tumor+stem-like+initiating+cells+by+CD8%2B+cytolytic+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Recognition and killing of brain tumor stem-like initiating cells by CD8+ cytolytic T cells.</a> Cancer Research. 69 (23), 8886-8893 (2009).</li>
<li>Lee, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+stem+cells+derived+from+glioblastomas+cultured+in+bFGF+and+EGF+more+closely+mirror+the+phenotype+and+genotype+of+primary+tumors+than+do+serum-cultured+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Tumor stem cells derived from glioblastomas cultured in bFGF and EGF more closely mirror the phenotype and genotype of primary tumors than do serum-cultured cell lines.</a> Cancer Cell. 9 (5), 391-403 (2006).</li>
<li>Brown, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regression+of+Glioblastoma+after+Chimeric+Antigen+Receptor+T-Cell+Therapy%5BTitle%5D)+AND+%22The+New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Regression of Glioblastoma after Chimeric Antigen Receptor T-Cell Therapy.</a> The New England Journal of Medicine. 375 (26), 2561-2569 (2016).</li>
<li>Salter, A. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphoproteomic+analysis+of+chimeric+antigen+receptor+signaling+reveals+kinetic+and+quantitative+differences+that+affect+cell+function%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Signaling%22%5BJournal%5D)">Phosphoproteomic analysis of chimeric antigen receptor signaling reveals kinetic and quantitative differences that affect cell function.</a> Science Signaling. 11 (544), (2018).</li>
<li>Rossi, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preinfusion+polyfunctional+anti-CD19+chimeric+antigen+receptor+T+cells+are+associated+with+clinical+outcomes+in+NHL%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Preinfusion polyfunctional anti-CD19 chimeric antigen receptor T cells are associated with clinical outcomes in NHL.</a> Blood. 132 (8), 804-814 (2018).</li>
<li>Garcia-Diaz, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interferon+Receptor+Signaling+Pathways+Regulating+PD-L1+and+PD-L2+Expression%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Interferon Receptor Signaling Pathways Regulating PD-L1 and PD-L2 Expression.</a> Cell Reports. 19 (6), 1189-1201 (2017).</li>
<li>Walker, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+Antigen+and+Receptor+Densities+Regulate+Efficacy+of+a+Chimeric+Antigen+Receptor+Targeting+Anaplastic+Lymphoma+Kinase%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy%22%5BJournal%5D)">Tumor Antigen and Receptor Densities Regulate Efficacy of a Chimeric Antigen Receptor Targeting Anaplastic Lymphoma Kinase.</a> Molecular Therapy. 25 (9), 2189-2201 (2017).</li>
<li>Fraietta, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determinants+of+response+and+resistance+to+CD19+chimeric+antigen+receptor+%28CAR%29+T+cell+therapy+of+chronic+lymphocytic+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Determinants of response and resistance to CD19 chimeric antigen receptor (CAR) T cell therapy of chronic lymphocytic leukemia.</a> Nature Medicine. 24 (5), 563-571 (2018).</li>
<li>Fraietta, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disruption+of+TET2+promotes+the+therapeutic+efficacy+of+CD19-targeted+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Disruption of TET2 promotes the therapeutic efficacy of CD19-targeted T cells.</a> Nature. 558 (7709), 307-312 (2018).</li>
</ol>

Das Auto-Konstrukt beschrieben in dieser Arbeit wurden lizenziert von Mustang Bio., Inc., für die S.J.F. und C.E.B Zahlungen von Lizenzgebühren erhält. Alle anderen Autoren erklären keine Interessenkonflikte.

Dieser sich wiederholende Tumor Zelle Herausforderung Test bietet eine bequeme Herangehensweise zur Bewertung Auto T Zelle funktionale Potenz, mit einer in-vitro-Setup, das die hohe Tumorlast assoziiert mit in-vivo Tumormodellen rekapituliert. Während dieser 7-Tage-Test CAR T Zellen durchlaufen vier Runden Tumor Herausforderung (erste Kokulturen und 3 X Reprovokation), Schaffung einer Umgebung, wo erschöpfte T-Zellen ihre Fähigkeit zur Reaktion auf Tumor Herausforderung trotz einer starken ersten Reaktion verlieren. Tumor Zelle Beseitigung und Auto T Zelle Expansion repräsentieren zwei grundlegende anzeigen, die von dieser Assay erworben werden können, während die Phänotypen der Auto-T-Zellen leicht analysiert werden können, durch Färbung der Oberfläche oder intrazellulären Marker, die T-Zell-Aktivierung angeben, Erschöpfung und/oder Speicher. Dieser Test ist auch bequem zu kombinieren mit nicht voreingenommen Analyse der Auto T-Zellen Transkriptom, Proteom oder Phosphor-Proteom21,26und T-Zell-Polyfunktionalität angenommenen klinische Reaktionen27vorherzusagen. Tumorzellen können darüber hinaus auch für ihre adaptive Reaktion gegen T-Zell-Immunität wie Zytokin-Sekretion28getestet werden. Da Proben zu mehreren Zeitpunkten geerntet werden, ermöglicht dieser Assay nicht nur statische, sondern dynamische Analyse der CAR T Zelle Verhalten bei der Reaktion auf überschüssige Anzahl von Tumorzellen.
Der Test ist besonders leistungsfähig im Vergleich der Effektor-Potenz Auto T-Zellen gezielt dasselbe Antigen, aber mit unterschiedlichen Designs und/oder Fertigungsprozesse. Wir haben dieser Assay daran gewöhnt, dass CD4 identifizieren+ CAR T Zellen waren in der Lage, hervorragende langfristige Effektor-Funktion als CD8 vermitteln+ Zellen21. Es wurde auch gezeigt, dass die in-vivo Auto Wirksamkeit mit der Zytotoxizität zu späteren Zeitpunkten (D5-D7) während dieser Assay, weitere Hervorhebung der Notwendigkeit mit sich wiederholenden Tumor Herausforderung für in-vitro-CAR T Zelle Bewertung korreliert war. Obwohl GBM-Zellen wie das Beispiel der Zielzellen hier verwendet wurden, könnte dieser Test leicht auf eine Kombination von verschiedenen T-Zell-Tumor übernommen werden. Insbesondere kann CAR T Zelle Verhalten auch auf verschiedenen Antigen dichten und engineering Krebszellen zu verschiedenen Ebenen der gezielten Antigene zur Verfügung gestellt des Werkzeugs, um sequentielle molekularen Ereignisse auf Auto Anerkennung29untersuchen express variieren. Dieser Assay kann daher auch ausgenutzt werden, um die Aktivierungsmuster von bestimmten Auto T-Zellen gegen verschiedene Ziele zu untersuchen.
Da die Zellviabilität Ziel und Auto T Zelle Erweiterung zwei im Voraus Auslesen des Assays sind, ist es wichtig, dass alle Ko-Kulturen mit lebensfähigen beginnen (> 70 %) Tumor und T-Zellen. Wenn die Reprovokation Prozesse durchführen, sollte die Wirkung von Absaugnadeln Medien (Schritt 5.3) Tumor und T-Zellen im unteren Teil die Brunnen, um nicht unnötige Variationen von Zellen zählt einzuführen nicht stören. Bei der Durchführung dieses Assays auf Aussetzung Ziel Zelllinien empfiehlt es sich, die verbleibende Zellen Ernten durch Zentrifugation vor Tumor Zelle Reprovokation.
Eine Einschränkung dieser Tests ist, dass der Setup-Parameter (E:T Verhältnisse der ersten Kokulturen und Reprovokation) angepasst werden muss, basierend auf verschiedenen Auto-Tumor-Kombinationen. Beispielsweise wenn die Tumorzellen ein erhebliches Maß an Immuno-hemmenden Moleküle (z.B. PD-L1) ausdrücken, ein höheres E:T Verhältnis wird empfohlen da die allgemeine Effizienz zu töten ist verglichen mit PD-L1-niedrige Tumorzellen beeinträchtigt. Bevor der Test auf neue Auto-Tumor-Kombinationen eine pilot-Studie wird empfohlen, bestimmen die optimalen Bedingungen, wodurch in der Regel die stärksten Auto T-Zellen getestet in der Probe zu beseitigen > 80 % der Tumorzellen am Endpunkt. Da direkten Zell-Zell-Kontakt benötigt wird für das Auto T-Zell-vermittelten töten, wenn die Tumorzellen Fluoreszenz-markierten waren, dann das Panel der durchflusszytometrischen Analyse muss entsprechend angepasst werden (z.B. wenn die Tumorzellen GFP markiert, dann jedem FITC-konjugiert waren Antikörpern sollte nicht verwendet werden).
Die klinische Aktivität des Auto-T-Zellen gegen B-Zell-Tumoren führte zu zwei FDA-zugelassene Medikamente. Die Antwort hat jedoch erhebliche Unterschiede in verschiedenen Patienten27,30,31, gezeigt die korrelieren mit der phänotypischen Eigenschaften des Auto Produkte30aufgeklärt wurde. Dieser in-vitro-sich wiederholende Tumor Herausforderung Assay weiter bietet einen Ansatz zur funktional testen Sie die Auto-Effektor Potenz neben der phänotypische Charakterisierungen und Polyfunktionalität Cytokine Produktion und ermöglicht höhere Throughput Screening von Klinische Produkte im Vergleich zu in-vivo Tumormodellen unter Beibehaltung der prädiktiven Treue. Alles in allem könnte dieser Assay für T-Zell Funktionstest für Auto T Zelldesign, präklinische und klinische Entwicklung verwendet werden.

Immuntherapie mit Chimären Antigen-Rezeptor (Auto)-entwickelte T-Zellen gesehen hat viel versprechende Ergebnisse gegen B-Zellen Malignome1,2,3,4, während das Potenzial des Zielens anderen Tumoren nach wie vor unter strenge Untersuchung5,6,7. Große Fortschritte erzielt worden, zur Optimierung der Auto-Konstrukt, Herstellungsprozess und geduldig Pre-Infusion Regimen6,7,8, und neuartige synthetische Biologie Ansätze sind voraussichtlich erhöhen ihre Beständigkeit, Sicherheit und Tumor zu Spezifität9,10. Es war jedoch schwierig und arbeitsintensiv das therapeutische Potenzial von Auto-T-Zellen um die beste Wahl für klinische Übersetzung führen entsprechend zu bewerten. Die etabliertesten Modell ist bisher um Auto T-Zellfunktion zu bewerten in immungeschwächte Mäuse mit menschlichen Tumor Xenografts, wobei Auto T-Zellen sind für die Antitumor-Wirkung untersucht und verglichen um betitelten Zelle Dosen11,12 , 13 , 14 , 15. diese murinen Studien in vivo sind arbeitsintensiv und zeitaufwändig, vor allem, wenn große Anzahl von Parametern screening. Weitere, in-vivo Studien können durch die Zugänglichkeit von Mausstämme, Tierbetreuung Einrichtungen und Tier Handhabungstechniken zurückgehalten werden. Daher gibt es eine Notwendigkeit, bequemere in-vitro-Untersuchungen ermöglichen schnelle Ablesung Effektor Aktivität, die auch treu die in-vivo Antitumor-Funktion dieser T-Zellen widerspiegeln zu entwickeln.
Herkömmliche Methoden zur Bestimmung der Zytotoxizität von T-Zellen in vitro konzentrierten sich auf die Erkennung von Degranulation, Produktion von Zytokinen und die Fähigkeit, Radioisotopen-markierten Zielzellen (z.B. Chrom-Release-Assays) zu lösen. Während diese Assays für die Definition von Auto T Zelle Spezifität und umgeleitete Zielerfassung informativ sind, sie nicht oft in-vivo Antitumor-Potential veränderter T Zellen12,13,16wider. Tötung Aktivität in kurzfristige Tests zeigten in bestimmten Fällen in Vitro eine inverse Korrelation mit in-vivo Antitumor-Funktion16. Diese Inkonsistenz ist wahrscheinlich das Ergebnis der hohen Effektor: Ziel (E:T) Verhältnisse in dieser in-vitro-Untersuchungen, und daher die Unfähigkeit, um Auto T Zelle Produkte zu unterscheiden, die anfällig für Erschöpfung17verwendet. Im Gegensatz dazu reagieren während der in-vivo Tumor Beseitigung T Zellen in der Regel gegen großen Tumor Belastungen, damit erfordern mehrere Runden von töten und anschließend fahren T Zelle Differenzierung und Erschöpfung18,19, 20, ist eines der größten Hindernisse gegen effektive Tumor Freigabe durch Auto T Zellen12,13. Unterdessen tun meist kurzfristige in-vitro-Tötung-Assays auch nicht auslesen Unterschiede in der T-Zell-Proliferation, während im Auto T Zelle behandelt Patienten die Kapazität für Auto T Zelle Expansion stark mit klinischen Reaktionen4 korreliert ist. So die entsprechenden in-vitro-Assay müssten Bedingungen hoher Tumorlast, Induktion von T-Zell-Erschöpfung, rekapitulieren und ermöglicht das Auslesen der T-Zell-Expansion.
Hier beschreiben wir eine Strategie, um Auto-T-Zellen für sich wiederholende Tumor töten Potenzial, mit einem einfachen in-vitro-Kokultur Assay zu bewerten. Verschiedene T-Zell-Effektor Aktivitätsparametern können gleichzeitig untersucht werden, einschließlich Ziel Zelle Tötung, CAR T Zelle Expansion und Speicher oder Erschöpfung verbundenen Phänotypen. Die Ergebnisse dieser Assay korreliert gut mit der in-vivo antitumor-Wirkung von Auto-T-Zellen und können genutzt werden, um die Potenz des CAR T Zelle Produkte zu bewerten. Während wir einen Test zur Beurteilung der IL13Ra2 ausgerichtete Auto T-Zellen gegen primäre GBM Linien21beschreiben, kann es leicht zu jedem Auto T-Zelle-Plattform angepasst werden.

<table><tbody><tr><td>0,05 % Trypsin/0,53 mM EDTA in HBSS ohne Calcium und</td><td>Magnesium Corning</td><td>MT25051CI</td><td></td></tr><tr><td>1 M Hepes</td><td>Irvine Scientific</td><td>9319</td><td></td></tr><tr><td>200 mM L-Glutamin</td><td>Cambrex Bio Science</td><td>17-605E</td><td></td></tr><tr><td>4',6-Diamidino-2-phenylindol, Dihydrochlorid (DAPI) - Invitrogen</td><td></td><td>D21490</td><td></td></tr><tr><td>Accutase</td> <td>in Fluorreiner QualitätInnovative Cell Technologies</td><td>AT104</td><td></td></tr><tr><td>Aldesleukin Proleukin (rhIL-2)</td><td>Novartis Oncology</td><td>NDC 0078-0495-61</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD137, PE</td><td>BD Biosciences</td><td>555956</td><td>4B4-1</td></tr><tr><td>Anti-CD19, PE-Cy7</td><td>BD Biosciences</td><td>557835</td><td>SJ25C1</td></tr><tr><td>Anti-CD3, PERCP</td><td>BD Biosciences</td><td>340663</td><td>SK7</td></tr><tr><td>Anti-CD4, FITC</td><td>BD Biosciences</td><td>340133</td><td>SK3</td></tr><tr><td>Anti-CD45, PERCP</td><td>BD Biosciences</td><td>340665</td><td>2D1</td></tr><tr><td>Anti-CD45RO, PE</td><td>BD Biosciences</td><td>561137</td><td>UCHL1</td></tr><tr><td>Anti-CD62L, APC</td><td>BD Biosciences</td><td>559772</td><td>DREG-56</td></tr><tr><td>Anti-CD69, APC</td><td>BD Biosciences</td><td>340560</td><td>L78</td></tr><tr><td>Anti-CD8, APC-Cy7</td><td>BD Biosciences</td><td>348793</td><td>SK1</td></tr><tr><td>Anti-IL-13, PE</td><td>BD Biosciences</td><td>340508</td><td>JES10-5A2</td></tr><tr><td>Anti-LAG-3, PE</td><td>eBiosciences</td><td>12-2239-41</td><td>3DS223H</td></tr><tr><td>Anti-PD-1, APC-Cy7</td><td>BioLegend</td><td>329921</td><td>EH12.2H7</td></tr><tr><td>Anti-TIM-3, APC</td><td>eBiosciences</td><td>17-3109-42</td><td>F38-2E2</td></tr><tr><td>B-27 serumfreies Supplement (50x)</td><td>Invitrogen</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>Corning 96 Well Clear Polystyrol TC-behandelte Mikroplatten mit flachem Boden, einzeln verpackt, mit Deckel, steril (Produkt #3596)</td><td>Corning Life Sciences</td><td>3596</td><td></td></tr><tr><td>Definiertes fötales Rinderserum, HI IR</td><td>Hyclone Labs</td><td>SH30070.03IH</td><td></td></tr><tr><td>DMEM F-12 50:50 (1x) ohne Glutamin</td><td>MediaTech, Inc.</td><td>15-090-CV</td><td></td></tr><tr><td>DMEM High Gluc ohne L-Glu, Na Pyr 1 L</td><td>Invitrogen</td><td>11960051</td><td></td></tr><tr><td>DMEM-Ham's F12 50:50 Mischung mit L-Glutamin und 15 mM HEPES</td><td>Fisher Scientific</td><td>MT10092CV</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Irvine Scientific</td><td>9224</td><td></td></tr><tr><td>Hitzeinaktiviertes FCS-Hyklon</td><td></td><td>SH30070,03</td><td></td></tr><tr><td>Heparin-Natrium (1.000 U/ml)</td><td>Amerikanisch Pharmazie</td><td>401811B</td><td></td></tr><tr><td>MACSQuant</td><td>Milteni Biotech Inc.</td><td>BIS013220&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>PBS 1x W/CA & MG</td><td>Irvine Scientific</td><td>9236</td><td></td></tr><tr><td>PBS mit 1 mM EDTA (ohne Ca2+ oder Mg2+)</td><td>VWR Scientific Produkte</td><td>PB15009A</td><td></td></tr><tr><td>rekombinante humane EGF</td><td>R& D Systems</td><td>236-EG-200</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinante humane FGF</td><td>F& Technik D Systems</td><td>233-FB</td><td></td></tr><tr><td>rhIL-15 Arbeitsverdünnung (10 ng/&mikro; L)</td><td>CellGenix, US Operations</td><td>tF0297</td><td></td></tr><tr><td>Natriumazid (NaN3)</td><td>Sigma</td><td>S8032</td><td></td></tr><tr><td>Sorvall ST40R</td><td>Thermo Scientific</td><td>41693700</td><td></td></tr><tr><td>TC-HEPES PUFFER (1 M) SOLN 100ML&NVPSP;</td><td>IRVINE SCIENTIFIC CORP</td><td>6472</td><td></td></tr><tr><td>Tecnol Procedure Maske</td><td>Kimberly-Clark</td><td>47117</td><td></td></tr><tr><td>X-VIVO 15</td><td>Lonza</td><td>BW04-744Q</td><td></td></tr></tbody></table>

in vitro tumor zelle rechallenge für vorausschauende bewertung der chimeric antigen-rezeptor-t-zell-antitumor-funktion

In Vitro Tumor Cell Rechallenge For Predictive Evaluation of Chimeric Antigen Receptor T Cell Antitumor Function

Bereich der chimeric Antigen-Rezeptor (Auto) T-Zell-Therapie schreitet rasch mit Verbesserungen in der Auto-Design, Gentechnologie Ansätze und Fertigung Optimierungen. Eine Herausforderung für diese Entwicklungsarbeit wurde jedoch die Einrichtung von in-vitro-Untersuchungen, die Auswahl der optimalen Auto T Zelle Produkte für in-vivo Therapieerfolg robust informieren können. Standard in-vitro-Tumor-Lyse-Assays können oft nicht das wahre Antitumor-Potenzial der Auto-T-Zellen aufgrund der relativ kurzen Kokultur Zeit und hohe T-Zell Tumor-Verhältnis zu reflektieren. Hier beschreiben wir eine in-vitro-Kokulturen-Methode zur Evaluierung CAR T Zelle rekursive Potenzial bei hohen Tumor Zelle Lasten zu töten. In diesem Assay, langfristige zytotoxische Funktion und proliferative Kapazität von Auto-T-Zellen werden in Vitro innerhalb von 7 Tagen mit zusätzlicher Tumor Zielen an der Kokultur jeden zweiten Tag verabreicht untersucht. Dieser Test kann mit profiling T-Zellaktivierung, Erschöpfung und Speicher Phänotypen gekoppelt werden. Mit dieser Assay, haben wir erfolgreich die funktionale und phänotypische Unterschiede zwischen CD4 unterschieden+ und CD8+ Auto T-Zellen gegen Glioblastom (GBM) Zellen, reflektieren ihre differentielle in-vivo Antitumor-Aktivität im orthotopen Xenograft-Modelle. Diese Methode bietet einen oberflächlichen Ansatz CAR T Zelle Potenz zu beurteilen und die funktionale Variationen über verschiedene Auto T Zelle Produkte aufzuklären.

Mit Hilfe des oben beschriebenen Tests, wir haben die differenzielle Effektor Potenz unterschieden und töten Dynamik vermittelt durch CD4+ und CD8+ CAR T Zellen. Die hier vorgestellten Ergebnisse verdeutlichen den Unterschied zwischen CD4+ und CD8+ CAR T Zellen eines gesunden Spenders unabhängig von unserer früheren Publikation21erzeugt.
Durch einen standard Degranulation-Assay, konnten wir beobachten, dass beide CD4+ und CD8+ CAR T Zellen wurde ebenso gegen GBM-Zellen, die das gezielte Antigen ausdrücken aktiviert, wie durch die Expression von CD107a und intrazellulären Zytokin angegeben (Abb. 2A). Jedoch mit den sich wiederholenden Tumor Herausforderung Assay, wir fanden, dass CD4+ aber nicht CD8+ CAR T Zellen die Fähigkeit, mehrere Runde Tötung (Abbildung 2B) ausgestellt. CD4+ CAR T Zellen auch erzielten bessere Ausbau im Vergleich zu CD8 +-Zellen während dieser Assay (Abbildung 2C). Die Differenz der Ausdehnung zwischen Auto T Zelle Teilmengen wurden nur von D3 nach zwei Runden der Tumor Herausforderung (1:12 E:T) beobachtet, während die Differenz der Zytotoxizität beobachtet wurde, beginnend mit D5 nach drei Runden der Tumor Challenge (1:20 E:T), darauf hinweist, dass kurzfristige Assays fehlgeschlagen, Unterschiede in der Wirksamkeit verschiedener CAR T Zelle Produkte aufzuklären. Wenn das 1:1 gemischt CD4+ und CD8+ CAR T Zellen wurden in diesem Test angewendet, sie erwiesen sich als CD8 übertreffen+ aber nicht CD4+ CAR T Zellen auf langfristige Zytotoxizität (Abbildung 2B). Der Ausbau der CD8+ CAR T Zellen wurde durch die Co angewandte CD4 induziert+ Zellen, während CD4+ CAR T Zelle Expansion wurde im Beisein von CD8 gehemmt+ Zellen (Abbildung 2C).
Um den Mechanismus zu erklären, die die Effektor-Aktivität zwischen CD4 unterscheidet+ und CD8+ CAR T Zellen, bestätigen wir zuerst, dass 24 h nach anfänglichen Co Kultur, beide CD4+ und CD8+ CAR T Zellen waren vergleichsweise aktiviert (Abbildung 3 A). In der Zwischenzeit, wie durch CD45RO und CD62L Ausdruck, beide CD4+ und CD8+ CAR T Zellen zeigten einen Übergang aus dem zentralen Speicher (CD45RO+, CD62L+) Effektor Speicher (CD45RO+, CD62L–) Phänotyp Während sich wiederholende Tumor Challenge (Abbildung 3B). Dann wir die Zellen am D3 des Assays, zeichnet sich eine Zeit bevor die Auto T Zelle Teilmengen funktionalen Unterschied anzeigen. T-Zell-Erschöpfung war geprägt von der Co Ausdruck der inhibitorischen Rezeptoren PD-1, LAG-3 und TIM-315,21, die zeigten, dass CD8+ CAR T Zellen wurden anfälliger für Erschöpfung im Vergleich mit CD4+ CAR T Zellen () Abbildung 3 C). Darüber hinaus keinen Unterschied auf CD8 galt+ CAR T Zelle Erschöpfung in die Anwesenheit/Abwesenheit von Co angewandte CD4+ Zellen (Abb. 3C), darauf hinweist, dass CD4-induzierte CD8+ CAR T Zelle Expansion ist nicht eine bessere Effektor-Funktion zugeordnet.
Zusammen, die Ergebnisse aus diesem Test festgestellt, dass CD4+ CAR T überflügelt CD8-Zellen+ Zellen insbesondere langfristige Zytotoxizität. Trotz der ähnlichen kurzfristigen Zytotoxizität (1-3 Tage, einmal rechallenged), CD4+ CAR T Zellen nachhaltig Effektor-Funktion auf sich wiederholende Tumor, während CD8+ Zellen wurde erschöpft und versagt, Zelle Wachstum des Tumors zu kontrollieren. Wenn die zwei Teilmengen gemischt wurden, CD4+ CAR T Zellen erleichtert den Ausbau der CD8+ Auto T-Zellen, aber die Erschöpfung Status der CD8+ Zellen wurden nicht gebessert, was das Fehlen von synergistischen Effekt zwischen den beiden Gruppen. Ähnliche Unterschied zwischen CD4+ und CD8+ CAR T Zellen wurde als zuvor beschriebenen21in einem in-vivo Modell. In der Tat CD8+ CAR T Zellen waren in der Lage, kurzfristige Tumor Abstand aber gefolgt mit Antigen-Positive Wiederholung; zu vermitteln im Gegensatz dazu CD4+ CAR T Zelle Behandlung führte zu langfristigen Tumor Beseitigung21, erinnert sich wiederholende Tötung Potenzial mit Hilfe der in-vitro-Reprovokation Assay.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59275/59275fig1.jpg"> Abbildung 1 : Schema und Analyse Strategie der sich wiederholenden Herausforderung Assay. (A) Schema und Timeline der sich wiederholenden Tumor Herausforderung Assay. Für jedes gut waren Auto T-Zellen zuerst zusammen mit PBT030-2 GBM-Zellen (4.000 Auto + Zellen, 16.000 Tumorzellen) kultiviert und neu herausgefordert mit 32.000 Tumorzellen jeden zweiten Tag (D2, D4 und D6). Analyse der Tumorzelle sowie Auto T-Zellzahl und Auto T Zelle Phänotyp erfolgt auf D1, D3, D5 und D7. (B) Gating Strategie ermitteln, Auto % T Zellen vor dem Einrichten der Kokultur. (C) Gating Strategie von lebenden Zellen, Tumorzellen und Auto-T-Zellen aus der sich wiederholenden Herausforderung-Assay. (D) Tumorzellen Anzahl zu verschiedenen Zeiten des Rechallenge Assays, zusammen mit untransduced T-Zellen kultiviert. Fehlerbalken = ±SEM. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59275/59275fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59275/59275fig2.jpg"> Abbildung 2 : Sich wiederholende Herausforderung Assay ergeben sich Unterschiede in der Tötung und proliferative Potenz zwischen CD4+ und CD8+ CAR T Zellen. (A) Degranulation und intrazellulären Zytokin Färbung von CD4+ und CD8+ Auto T-Zellen nach 5 h Kokultur mit GBM-Zellen (E:T = 1:1). (B) CD4+, CD8+ oder gemischt (CD4:CD8 = 1:1) Auto-T-Zellen wurden auf wiederkehrende Herausforderung Assay angewendet und lebensfähigen Tumorzellen wurden quantifiziert. p &lt; 0,05, **p &lt; 0,01 ***p &lt; 0,001 verglichen mit CD4+, mit One-Way ANOVA mit Bonferroni mehrere Vergleichstests. (C) CD4+ und CD8+ CAR T Zelle Expansion während sich wiederholende Tumor Herausforderung Assay. Vergleich von (links nach rechts) CD4+ Vs CD8+, einzelne Teilmenge; CD4+ Vs CD8+, innerhalb der "gemischten" Gruppe; CD4+, einzelne Vs gemischt; CD8+, einzelne Vs gemischt. p &lt; 0,05, **p &lt; 0,01 ***p &lt; 0,001 mit einem ungepaarten Student t -Test. Fehlerbalken = ±SEM. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59275/59275fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59275/59275fig3.jpg"> Abbildung 3 : Analyse des T-Zell-Phänotyp bei sich wiederholenden Herausforderung Assay. (A) 4-1BB und CD69 Flecken auf Auto-T-Zellen bei D1 des Assays. (B) CD45RO und CD62L Färbung des Auto-T-Zellen vor dem Auftragen um rechallenge Assay (input) und D3 und D7 des Assays. (C) Co Ausdruck des PD-1, LAG-3 und TIM-3 auf Auto-T-Zellen bei D3 des Assays. (Oben) Gating Strategien, T-Zellen, die mit dem Ausdruck 1, 2 oder 3 inhibitorischen Rezeptoren zu identifizieren. (Unten) Vergleich: CD4+ Zellen (einzelne Teilmenge), CD8+ Zellen (einzelne Teilmenge), CD8 Zellen+ (innerhalb der "gemischten" Gruppe). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59275/59275fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Table 1" src="/files/ftp_upload/59275/59275table1.jpg"> Tabelle 1: Repräsentative Platte Karte Reprovokation Setup.

Hier beschreiben wir eine in-vitro-Kokultur Methode rekursiv Herausforderung Tumor gezielt T-Zellen, die phänotypische und funktionelle Analyse der Antitumor-T-Zell-Aktivität ermöglicht.

In Vitro Tumor Zelle Rechallenge für vorausschauende Bewertung der Chimeric Antigen-Rezeptor-T-Zell-Antitumor-Funktion

The field of chimeric antigen receptor (CAR) T cell therapy is rapidly advancing with improvements in CAR design, gene-engineering approaches and ...

Dieses Protokoll bietet eine langfristige, in vitro funktionelle Methode zur Bewertung von chimeric Antigen-Rezeptor, oder CAR-T-Zellen, durch sich wiederholende Tumorzell Herausforderung. Diese Technik ist weniger zeitaufwändig und weniger arbeitsintensiv als die Auswertung der in vivo CAR T-Zellfunktion, während sie dennoch eine genaue Darstellung der wahren Anti-Tumor-Wirksamkeit erreicht. Diese In-vitro-Technik ermöglicht das Hochdurchsatz-Screening und die Differenzierung der CAR-T-Zell-Antitumor-Potenz.Welches hat die mögliche Anwendung für die Bewertung der klinischen Wirksamkeit von CAR T Zellprodukten. Beginnen Sie mit der Dissoziierung von Glioblastom-Tumorsphären aus einer Glioblastom-Tumorsphärenkultur. Mit einem Milliliter Kaltaccutase und 30 bis 60 Sekunden Pipettierung.Wenn die Tumorsphären gestört sind, stoppen Sie die Reaktion mit fünf Milliliter warmes Co-Kulturmedium. Und pellet die Tumorzellsuspensionen durch Zentrifugation. Setzen Sie die Glioblastomzellen auf 1,6 mal 10 bis die fünfte Tumorzelle pro Milliliter frischer Cokulturmittelkonzentration aus und verdünnt T-Zellen, die aus einer CAR-T-Zellkultur geerntet werden, auf den entsprechenden Prozentsatz der CAR-positiven T-Zellen pro Milliliter Co-Kultur-Mittlerer Konzentration.Als nächstes fügen Sie 100 Mikroliter der verdünnten Tumorzellen zu jedem Brunnen einer 96 gut flachen Bodengewebekulturplatte hinzu. Und 100 Mikroliter CAR-T-Zellen in jeden Brunnen von Tumorzellen mit sanfter Mischung. Dann legen Sie die Platte in einem 37 Grad Celsius, 5% Kohlendioxid-Inkubator.An den Tagen zwei, vier und sechs der Kultur, sorgfältig entfernen 50 Mikroliter Medium aus jedem Brunnen der Tumorzelle, T-Zelle Co-Kultur-Platte für rechallenge nach der Tabelle geplant. Dann fügen Sie 50 Mikroliter frische Glioblastom-Zellsuspension, vorbereitet wie gerade gezeigt, aber mit der doppelten Zellzahl der ursprünglichen Co-Kultur zu jedem Brunnen mit sanften Mischen. Und kehren Sie die Platte an den Zellkultur-Inkubator zurück.Tage eins, drei, fünf und sieben der Kokultur, übertragen Sie den Überstand von jedem Brunnen, um geerntet zu werden, in eine neue 96 gut runde Bodenplatte nach der Tabelle und fügen Sie 50 Mikroliter vorgewärmte 0,5%Trypsin EDTA in jedes Medium gut erschöpft. Bestätigen Sie nach fünf Minuten bei 37 Grad Celsius, dass sich die Zellen durch Lichtmikroskopie von der Unterseite jedes Brunnens gelöst haben, und pipetten Sie sanft die Enzymlösung um den Boden jedes Brunnens, um die Zellen wieder auszusetzen. Vor der Übertragung der abgetrennten Zellsuspension in die entsprechenden Brunnen der neuen 96 Brunnenplatte.Pellet die Zellen durch Zentrifugation, und waschen Sie die Zellen mit 200 Mikroliter fluoreszierend aktiviert Zellsortierung stehende Lösung, oder FFS pro Brunnen mit einer zweiten Zentrifugation. Die Pellets in 100 Mikroliterdes Antikörpercocktail von Interesse in 100 Mikroliter SSS pro Brunnen für eine 30-minütige Inkubation bei vier Grad Celsius wieder aussetzen. A das Ende der Inkubation entfernen alle ungebundenen Antikörper durch sequenzielle 100 und 200 Mikroliter FSS-Washes und suspendieren die Zellen in 100 bis 200 Mikroliter DAPI Kernfleck und FSS.Analysieren Sie dann die Zellen nach standardmäßigen zytometrischen Analyseprotokollen. Für die funktionelle und phänotypische Analyse der CAR-T-Zellen nach Tumorzell-Kokultur, rufen Sie die Datendateien aus dem Durchflusszytometer ab und vereisten alle lebenden DAPI-Negativzellen. Um die Tumorzellen zu quantifizieren, gate die CD45 negative Population.Zur Quantifizierung der CAR-T-Zellen wird die CD45-positive CAR-positive Population gemessen. Zeichnen Sie dann den Tumor und die CAR T-Zellzahlen über den Zeitverlauf des Experiments, indem Sie die T-Zellaktivierung durch die Co-Expression von 41BB und CD69 identifizieren. T-Zellerschöpfung durch die Expression von PD1, LAG3 und TIM3, den T-Zellspeicherstatus LAG3 und TIM3 sowie den T-Zellspeicherstatus durch CD45RO und CD62-Ligand-Expression.cd45RO und CD62 Ligand-Expression. Sowohl CD4-positive als auch CD8-positive CAR-T-Zellen werden gleichermaßen gegen Glioblastomzellen aktiviert, die das Zielantigen entsprechend ihrer CD107a- und intrazellulären Zytokinexpression ausdrücken. Nach Einschätzung der repetitiven Tumorherausforderung SA, CD4-positiv, aber nicht CD8-positiv, sind CAR-T-Zellen jedoch in der Lage, mehrere runde Tötungen zu ermöglichen.CD4-positive CAR-T-Zellen erzielen ebenfalls eine robustere Expansion. Wenn CD4-positive und CD8-positive CAR-T-Zellen im Verhältnis eins zu eins gemischt werden, führt diese Zellkombination CD8-positive, aber nicht CD4-positive CAR-T-Zellen in Bezug auf die langfristige Zytotoxizität aus. Darüber hinaus wird die Expansion von CD8-positiven CAR-T-Zellen durch die Zugabe von CD4-positiven T-Zellen induziert.Während CD4 positive CAR T Zellexpansion in Gegenwart von CDa-positiven Zellen gehemmt wird. 24 Stunden nach der anfänglichen Co-Kultur werden sowohl CD4-positive als auch CD8-positive CAR-T-Zellen in ähnlicher Weise aktiviert. Während der sich wiederholenden Tumorherausforderung zeigen sowohl CD4-positive als auch CD8-positive CAR-T-Zellen einen Übergang von einem CD45RO-positiven Zentralspeicher-Phänotyp zu einem CD45RO-positiven CD62-positiven Effektor-Speicher-Phänotyp.CD8-positive CAR-T-Zellen sind auch anfälliger für Erschöpfung im Vergleich zu CD4-positiven CAR-T-Zellen, die nach drei Tagen Co-Kultur nach ihrer PD1-, LAG3- und TIM3-Expression beurteilt werden. Weiterhin wurden keine Unterschiede bei der CDa-positiven Car-T-Zellerschöpfung in Gegenwart oder Abwesenheit von CD4-positiven T-Zellen beobachtet, was darauf hindeutet, dass CD4-induzierte CD8-positive CAR-T-Zellexpansion nicht mit einer besseren Effektorfunktion verbunden ist. Dieser Aufsatz kann auch mit der Sortierung der T-Zellen gekoppelt werden, die die Kokultur bilden, um weitere Analysen zu Transkriptomen, Proteomik und spezifischen Genen von Interesse durchzuführen.Diese sich wiederholende Tumorherausforderung könnte auch als Plattform für die Untersuchung der biologischen Ereignisse nach der Erkennung von CAR T-Zelltumoren genutzt werden.

in-vitro-tumor-cell-rechallenge-for-predictive-evaluation-chimeric

Research

Forschung

JoVE Journal

Cancer Research

Krebsforschung

In diesem Video demonstrieren wir den repetitiven Tumor-Challenge-Assay, um das repetitive Tumorabtötungspotenzial der CAR-T-Zellen bei hohen Tumorzelllasten zu bewerten. Darüber hinaus können die CAR-T-Zellen mittels Durchflusszytometrie analysiert werden, um die verschiedenen Subpopulationen von CAR-T-Zellen in der Probe zu bestimmen.

Repetitiver Tumor-Challenge-Assay: Ein In-vitro-Kultur-Assay zur Bewertung von chimären Antigenrezeptor (CAR)-T-Zellen auf das Potenzial zur wiederholten Tumorabtötung

Dieses Video demonstriert eine Technik zur Herstellung von chimären Antigenrezeptor (CAR) T-Zellen ex vivo. Menschliche T-Zellen werden mit magnetischen Kügelchen inkubiert, die mit Anti-CD3- und Anti-CD28-Antikörpern beschichtet sind, zusammen mit einem mit Interleukin-2 (IL-2) angereicherten Medium, was zu einer Aktivierung und Proliferation von T-Zellen führt. Transgene lentivirale Vektoren werden eingeführt, die es der transgenen RNA ermöglichen, sich in das Wirtsgenom zu integrieren und...

Eine ex vivo-Technik zur Herstellung chimärer Antigenrezeptor-T-Zellen

Dieses Video demonstriert eine Technik zur ex vivo Erzeugung von Tumorantigen-spezifischen chimären Antigenrezeptor (CAR) T-Zellen. Retrovirale Vektoren, die transgene RNA tragen, werden mit Milzzellen in einem mit Interleukin-2 supplementierten Medium gemischt, um das Überleben und die Proliferation von T-Zellen zu fördern. Das Gemisch wird dann auf eine mit rekombinanten menschlichen Fibronektinfragmenten beschichtete Platte überführt und zentrifugiert, um die Fusion des Virus mit der Zelle...

Eine ex vivo-Technik zur Erzeugung tumorspezifischer chimärer Antigenrezeptor-T-Zellen

Dieses Video zeigt einen in vitro Assay zur Validierung der T-Zellaktivität von chimären Antigenrezeptoren (CAR). B-Zell-Lymphomzellen, die das CD19-Antigen und die zytoplasmatische Luciferase exprimieren, werden mit CD19-spezifischen CAR-T-Zellen kokultiviert. Die Bindung von CAR an CD19 auf einem Tumor veranlasst die CAR-T-Zellen, Zytokine und Toxine freizusetzen, die eine Zytotoxizität der Tumorzellen verursachen. Die Aktivität der CAR-T-Zellen wird durch Quantifizierung des freigesetzten...

Ein in vitro Assay zur Bewertung der Anti-Tumor-Aktivität von tumorspezifischen CAR-T-Zellen

Wir beschreiben ein quantitatives Echtzeit-In-vitro-Zytolyse-Assay-System zur Bewertung der Wirksamkeit von chimeric antigenen Antigen-Rezeptor-T-Zellen, die auf flüssige und solide Tumorzellen abzielen. Dieses Protokoll kann erweitert werden, um andere Immuneffektorzellen sowie Kombinationsbehandlungen zu bewerten.

Ein Echtzeit-Potenz-Assay für chimerantigene Antigen-Rezeptor-T-Zellen, die auf feste und hämatologische Krebszellen abzielen

Dieses Protokoll beschreibt die chirurgische Entstehung von orthotopischen Bauchspeicheldrüsentumoren und die schnelle Verdauung von frisch isolierten murinen Bauchspeicheldrüsentumoren. Nach der Verdauung können lebensfähige Immunzellpopulationen für weitere nachgelagerte Analysen verwendet werden, einschließlich der Ex-vivo-Stimulation von T-Zellen zur intrazellulären Zytokindetektion durch Durchflusszytometrie.

Generierung von orthotopischen Pankreastumoren und Ex-vivo-Charakterisierung der tumorinfiltrierenden T-Zell-Zytotoxizität

In dieser Arbeit beschreiben wir ein Protokoll, in dem ein von Patienten mit akuter lymphatischer Leukämie abgeleitetes Xenograft-Modell als Strategie zur Bewertung und Überwachung von CD19-gerichteten chimären Antigenrezeptor-T-Zell-assoziierten Toxizitäten verwendet wird.

Bewertung der chimären Antigenrezeptor-T-Zell-assoziierten Toxizität unter Verwendung eines Xenograft-Mausmodells für Patienten mit akuter lymphatischer Leukämie

Ein Protokoll zur Bewertung der quantitativen Abtötung von Tumorzellen durch Jurkat-Zellen, die chimären Antigenrezeptor (CAR) exprimieren, der auf ein einzelnes Tumorantigen abzielt. Dieses Protokoll kann als Screening-Plattform für die schnelle Optimierung von CAR-Scharnierkonstrukten vor der Bestätigung in aus dem peripheren Blut gewonnenen T-Zellen verwendet werden.

Schnelle In-vitro-Zytotoxizitätsbewertung des Jurkat-exprimierenden chimären Antigenrezeptors mittels Fluoreszenzbildgebung

Hier beschreiben wir ein Verfahren zur Herstellung von Doppelemulsionströpfchen, die eine T-Zelle und eine Krebszielzelle verkapseln, um die Zellabtötung auf Einzelzellebene zu untersuchen. Diese Methode ermöglicht die duale Quantifizierung sowohl zytotoxischer Moleküle als auch der Apoptose der Zielzellen innerhalb einer großen Population von T-Zellen.

Tröpfchenbasierter Zytotoxizitätsassay zur Beurteilung von chimären Antigenrezeptor-T-Zellen auf Einzelzellebene

Dieses Protokoll ist zu erholen und molekulare genetische Charakterisierung der Ebene der einzelligen seltene Zielzellen aus einer Mischung mit Nichtziel-hintergrundzellen vorbereiten. DNA-Qualität entspricht nicht behandelten Einzelzellen und einzellige Anwendung (sowohl Screening basiert und gezielte Analyse) ermöglicht.

Ziel Zelle Voranreicherung und ganze Genome Amplifikation für einzelne Zelle nachgelagerten Charakterisierung

Lernen Sie eine in-vitro-Co-Kultur-Methode zur funktionellen Bewertung von CAR-T-Zellen durch repetitive Tumorzell-Herausforderungen. Diese Technik ermöglicht die Hochdurchsatzanalyse der antitumorale Wirksamkeit.

In Vitro Tumor Zelle Rechallenge für vorausschauende Bewertung der Chimeric Antigen-Rezeptor-T-Zell-Antitumor-Funktion

Weitere Videos entdecken