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Behavior

Integración de ensayos psicofísicos visuales dentro de un laberinto Y para aislar el papel que desempeñan las características visuales en las decisiones de navegación

Published: May 2, 2019 doi: 10.3791/59281
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Cognitive Ecology & Ecohydraulics Team, Environmental Laboratory, US Army Engineer Research and Development Center

Summary

Aquí, presentamos un protocolo para demostrar un ensayo conductual que cuantifica cómo las características visuales alternativas, como las señales de movimiento, influyen en las decisiones direccionales en los peces. Los datos representativos se presentan sobre la velocidad y precisión donde Golden Shiner (Notemigonus crysoleucas) sigue los movimientos de los peces virtuales.

Abstract

El comportamiento colectivo de los animales surge de las motivaciones individuales y las interacciones sociales que son fundamentales para la aptitud individual. Los peces han inspirado durante mucho tiempo investigaciones sobre el movimiento colectivo, específicamente, su capacidad para integrar la información ambiental y social en contextos ecológicos. Esta demostración ilustra las técnicas utilizadas para cuantificar las respuestas conductuales de los peces, en este caso, Golden Shiner (Notemigonus crysoleucas), a estímulos visuales mediante visualización por ordenador y análisis de imágenes digitales. Los avances recientes en la visualización de computadoras permiten realizar pruebas empíricas en el laboratorio, donde las características visuales se pueden controlar y manipular con precisión para aislar los mecanismos de las interacciones sociales. El propósito de este método es aislar las entidades visuales que pueden influir en las decisiones direccionales del individuo, ya sea solitario o con grupos. Este protocolo proporciona detalles sobre el dominio físico del laberinto Y, el equipo de grabación, la configuración y las calibraciones del proyector y la animación, los pasos experimentales y los análisis de datos. Estas técnicas demuestran que la animación por ordenador puede obtener respuestas biológicamente significativas. Además, las técnicas son fácilmente adaptables a probar hipótesis, dominios y especies alternativas para una amplia gama de aplicaciones experimentales. El uso de estímulos virtuales permite la reducción y sustitución del número de animales vivos necesarios y, en consecuencia, reduce los gastos generales de laboratorio.

Esta demostración pone a prueba la hipótesis de que las pequeñas diferencias relativas en las velocidades de movimiento (2 longitudes corporales por segundo) de los conespecíficos virtuales mejorarán la velocidad y precisión con la que las ojeras siguen las señales direccionales proporcionadas por el Siluetas. Los resultados muestran que las decisiones direccionales de shiners se ven significativamente afectadas por aumentos en la velocidad de las señales visuales, incluso en presencia de ruido de fondo (67% de coherencia de imagen). En ausencia de señales de movimiento, los sujetos eligieron sus direcciones al azar. La relación entre la velocidad de decisión y la velocidad de referencia era variable y los aumentos en la velocidad de cue tuvieron una influencia modestamente desproporcionada en la precisión direccional.

Introduction

Los animales detectan e interpretan su hábitat continuamente para tomar decisiones informadas al interactuar con los demás y navegar por entornos ruidosos. Las personas pueden mejorar su conciencia situacional y la toma de decisiones integrando la información social en sus acciones. La información social, sin embargo, se deriva en gran medida de la inferencia a través de señales no deseadas (es decir, maniobras repentinas para evitar a un depredador), que pueden ser poco fiables, en lugar de a través de señales directas que han evolucionado para comunicar mensajes específicos (por ejemplo, la ola baile en abejas de miel)1. Identificar cómo las personas evalúan rápidamente el valor de las señales sociales, o cualquier información sensorial, puede ser una tarea difícil para los investigadores, particularmente cuando las personas viajan en grupos. La visión juega un papel importante en la regulación de las interacciones sociales2,3,4 y los estudios han inferido las redes de interacción que pueden surgir en las escuelas de peces en función del campo de visión de cada individuo5, 6. Las escuelas de peces son sistemas dinámicos, sin embargo, lo que dificulta aislar las respuestas individuales a características particulares, o comportamientos de los vecinos, debido a las colinealidades inherentes y los factores de confunción que surgen de las interacciones entre los miembros del grupo. El propósito de este protocolo es complementar el trabajo actual aislando cómo las características visuales alternativas pueden influir en las decisiones direccionales de las personas que viajan solas o dentro de grupos.

La ventaja del protocolo actual es combinar un experimento manipulador con técnicas de visualización por computadora para aislar las características visuales elementales que un individuo puede experimentar en la naturaleza. Específicamente, el laberinto Y (Figura 1) se utiliza para contraer la elección direccional a una respuesta binaria e introducir imágenes animadas por computadora diseñadas para imitar los comportamientos de natación de los vecinos virtuales. Estas imágenes se proyectan desde debajo del laberinto para imitar las siluetas de los conespecíficos que nadan debajo de uno o más sujetos. Las características visuales de estas siluetas, como su morfología, velocidad, coherencia y comportamiento denatación, se adaptan fácilmente para probar hipótesis alternativas 7.

Este artículo demuestra la utilidad de este enfoque aislándolo cómo los individuos de una especie de pez social modelo, el Golden Shiner (Notemigonus crysoleucas), responden a la velocidad relativa de los vecinos virtuales. El enfoque del protocolo, aquí, está en si la influencia direccional de los vecinos virtuales cambia con su velocidad y, si es así, cuantificar la forma de la relación observada. En particular, la señal direccional se genera haciendo que una proporción fija de las siluetas actúe como líderes y se mueva balista hacia un brazo u otro. Las siluetas restantes actúan como distractores moviéndose al azar para proporcionar ruido de fondo que se puede ajustar ajustando la relación directriz/distraída. La relación de los líderes a los distractores captura la coherencia de las señales direccionales y se puede ajustar en consecuencia. Las siluetas de distractores permanecen confinadas al área de decisión ("DA", Figura 1A)haciendo que las siluetas se reflejen fuera del límite. Las siluetas de líder, sin embargo, se les permite salir de la región del DA y entrar en su brazo designado antes de desvanecirse lentamente una vez que las siluetas atraviesan 1/3 de la longitud del brazo. A medida que los líderes abandonan el fiscal, las nuevas siluetas de líder toman su lugar y recorren su camino exacto para asegurarse de que la relación líder/distracción permanece constante en el DA durante todo el experimento.

El uso de peces virtuales permite el control de la información sensorial visual, mientras se supervisa la respuesta direccional del sujeto, lo que puede revelar nuevas características de navegación social, movimiento o toma de decisiones en grupos. El enfoque utilizado aquí se puede aplicar a una amplia gama de preguntas, como los efectos del estrés subletal o la depredación en las interacciones sociales, mediante la manipulación de la animación por ordenador para producir patrones de comportamiento de complejidad variable.

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Protocol

Todos los protocolos experimentales fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso De Animales del Laboratorio Ambiental, Ingeniero del Ejército de los Estados Unidos y Centro de Investigación y Desarrollo, Vicksburg, MS, EE. UU. (IACUC- 2013-3284-01).

1. Diseño de laberinto sensorial

  1. Llevar a cabo el experimento en una plataforma de laberinto Y de polimetil metilmeco estanco (hecho internamente) en lo alto de una plataforma de soporte transparente en una sala dedicada. Aquí la plataforma es de 1,9 cm de espesor y está soportada por 4 vigas de 7,62 cm de aluminio extruido que es de 1,3 m de ancho, 1,3 m de longitud y 0,19 m de altura.
  2. Construir las áreas de retención y decisión para que sean idénticas en la construcción (Figura1A). Aquí, los brazos del laberinto Y miden 46 cm de largo, 23 cm de ancho y 20 cm de profundidad con un área de decisión central de aproximadamente 46 cm de diámetro.
  3. Adherir la pantalla de teatro de proyecto en blanco en la parte inferior del laberinto Y para proyectar estímulos visuales en el dominio.
  4. Recubrir los lados del laberinto Y con vinilo blanco para limitar los estímulos visuales externos.
  5. Instale una puerta transparente controlada remotamente (a través de un monofilamento transparente) para dividir el área de retención desde el área de decisión central para liberar a los sujetos en el laberinto después de la aclimatación.
  6. Coloque persianas adicionales para evitar que los peces vean luces, carcasas y equipos, como persianas que bloquean la luz que llegan al suelo en los marcos de las puertas para minimizar los efectos de luz y los movimientos de sombra desde la habitación externa o el pasillo.

2. Equipo de grabación

  1. Seleccione una cámara aérea (blanco y negro) en función del contraste necesario entre las imágenes de fondo, los peces virtuales y los peces sujetos.
  2. Instale una cámara aérea para grabar el laberinto desde arriba y para grabar los comportamientos de los peces y las proyecciones visuales.
    1. Para esta demostración, utilice cámaras b/w Gigabyte Ethernet (GigE), de modo que los cables IP de 9 m se conectaron a un ordenador con una tarjeta Ethernet de 1 Gb en una sala de control.
  3. Conecte la cámara a un ordenador en una sala contigua donde el observador pueda controlar de forma remota la puerta, el programa de estímulos visuales y el software de grabación de la cámara.
  4. Asegúrese de que los ajustes de la cámara están a velocidades de muestreo y frecuencia que evitan cualquier efecto de parpadeo, que se producen cuando la cámara y el software están fuera de fase con las luces de la habitación.
    1. Compruebe la frecuencia eléctrica de la ubicación; desplazar la frecuencia de muestreo de la cámara (fotogramas por segundo, fps) para evitar el parpadeo multiplicando o dividiendo la frecuencia de CA por un número entero.
  5. Establezca los ajustes de la cámara para que la claridad de la imagen se supere utilizando el software y el ordenador para visualizar los comportamientos relevantes.
    1. Para esta demostración, realice muestreos a 30 fps con una resolución espacial de 1280 píxeles x 1024 píxeles.

3. Calibre la iluminación, el proyector y la configuración de la cámara

  1. Instale cuatro sistemas de iluminación de vías aéreas a lo largo de las paredes de la sala experimental.
  2. Instale interruptores de control ajustables para las luces para proporcionar una mayor flexibilidad en el logro de la luz ambiental de la habitación correcta.
  3. Coloque las luces para evitar reflejos en el laberinto (Figura1B).
  4. Asegure un proyector de tiro corto (ST) en el borde inferior de la estructura de soporte del laberinto (Figura1C).
    1. Seleccione la resolución de proyección (establecida en 1440 píxeles x 900 píxeles para esta demostración).
  5. Ajuste los niveles de luz ambiental, creados por las luces aéreas y el proyector, para que coincidan con las condiciones de iluminación que se encuentran en la sala de alojamiento de los sujetos (aquí se establece en 134 x 5 lux durante el experimento de demostración, lo que equivale a la iluminación natural en un día nublado).
    1. Bloquee o marque la ubicación del interruptor de atenuación para facilitar y mantener la consistencia durante los ensayos experimentales.
  6. Utilice un programa de visor de cámara para configurar las cámaras para controlar el modo de exposición, la ganancia y el control del balance de blancos.
    1. En esta demostración, establezca el Visor de Pylon en "disparo continuo", tiempo de exposición de 8000 os, ganancia 0 y balance de blancos de 96, que proporciona el control de la grabación de vídeo.

4. Calibrar el programa de proyección visual: fondo

  1. Proyecte un fondo homogéneo en la parte inferior del laberinto y mida cualquier distorsión de luz del proyector. Aquí el fondo se creó utilizando Procesamiento (v. 3), que es una plataforma manejable y bien documentada para crear visualizaciones personalizadas para proyectos científicos (https://processing.org/examples/).
    1. Cree un programa que ejecute una ventana de procesamiento que se proyectará en la parte inferior del laberinto. La personalización del color de fondo de la ventana se realiza con el comando de fondo, que acepta un código de color RGB. Varios programas de ejemplo pequeños se encuentran en los tutoriales de procesamiento (https://processing.org/tutorials/).
    2. Utilice el programa de color de fondo para calibrar el proyector y las condiciones de iluminación externas.
  2. Mida cualquier distorsión de luz creada por el proyector utilizando un programa de procesamiento de imágenes para identificar cualquier desviación del fondo homogéneo esperado creado. Los pasos siguientes se aplican al uso de ImageJ (v. 1.52h; https://imagej.nih.gov/ij/).
    1. Captura una imagen de fotograma fija del laberinto Y iluminado con un color de fondo uniforme y ábrela en ImageJ.
    2. Usando la herramienta de línea recta, segmentada o a mano alzada dibuje una línea vertical recta desde la ubicación más brillante en el centro del punto de acceso hasta la parte superior del laberinto Y (Figura2A).
    3. En el menú Analizar, seleccione Trazar perfil para crear un gráfico de valores de escala de grises frente a la distancia en píxeles.
    4. Guarde los datos de píxeles como un archivo separado por comas (extensión de archivo .csv) que consta de una columna de índice y una columna de valor de píxel.
  3. Alinee el área de proyección con el laberinto (Figura2B)y modele cualquier distorsión de luz no deseada para reducir cualquier distorsión de color que pueda ser creada por el proyector (Figura2C). A continuación se describen los pasos dados en la demostración actual.
    1. Importe el archivo de datos de intensidad de píxeles ImageJ utilizando la función de lectura delimitada por tabulaciones adecuada (por ejemplo, read_csv desde el paquete tidyverse para leeren en archivos separados por comas).
    2. Calcular la variabilidad en la intensidad de la luz a lo largo del transecto de la muestra, como con un coeficiente de variación, para proporcionar una referencia de línea base para el nivel de distorsión creado en el fondo.
    3. Transforme los valores de píxel sin procesar para reflejar un cambio relativo en la intensidad de más brillante a más dimm, donde la intensidad de píxel más pequeña se acercará al valor de color de fondo deseado seleccionado en el programa de imagen.
    4. Trazar los valores de intensidad de píxeles de transformación comenzando en la parte más brillante de la anomalía generalmente produce una tendencia en descomposición en los valores de intensidad en función de la distancia desde el origen. Utilice mínimos cuadrados no lineales (función nls) para estimar los valores de parámetro que mejor se ajustan a los datos (aquí, una función de descomposición gaussiana).
  4. Cree el gradiente del contador utilizando el mismo programa adoptado para generar la imagen del contador de fondo (Procesamiento v. 3) para reducir cualquier distorsión de color que pueda crear el proyector utilizando R (v. 3.5.1).
    NOTA: La función de degradado generará una serie de círculos concéntricos centrados en el punto más brillante de la imagen que cambian en la intensidad de los píxeles en función de la distancia desde el centro. El color de cada anillo se define restando el cambio en la intensidad de píxeles predicho por el modelo del color de fondo. En consecuencia, el radio del anillo también aumenta con la distancia desde la fuente. El modelo de mejor ajuste debe reducir, si no eliminar, cualquier intensidad de píxel en el degradado para proporcionar una uniformidad de fondo.
    1. Cree un degradado gaussiano (Equation) utilizando el programa de estímulo visual ajustando los parámetros necesarios.
      1. El parámetro a afecta al brillo/oscuridad del gradiente de distribución gaussiano. Cuanto mayor sea el valor, más oscuro será el degradado.
      2. El parámetro b afecta a la varianza del degradado. Cuanto mayor sea el valor, más amplio será el degradado que se extenderá antes de nivelar a la intensidad de píxel de fondo deseada, c.
      3. El parámetro c establece la intensidad de píxel de fondo deseada. Cuanto mayor sea el valor, más oscuro será el fondo.
    2. Guarde la imagen en una carpeta mediante la función saveFrame, de modo que se pueda cargar una imagen de fondo fija durante los experimentos para minimizar la carga de memoria al representar los estímulos durante una prueba experimental.
    3. Vuelva a ejecutar el programa de generación en segundo plano e inspeccione visualmente los resultados, como se muestra en la figura 2C. Repita el paso 4.3 para cuantificar las mejoras observadas en la reducción del grado de variabilidad en la intensidad de la luz a través del transecto de la muestra.
  5. Ajuste empíricamente los niveles de iluminación, los parámetros del modelo o la distancia cubierta en el transecto (por ejemplo, el radio exterior del gradiente del contador) para realizar ajustes manuales adicionales hasta que los valores RGB de la zona de aclimatación sean similares al área de decisión. Los parámetros del modelo en esta prueba fueron: a 215, b a 800 y c a 4.
  6. Agregue el filtro final al programa de estímulos visuales del experimento.

5. Calibrar el programa de proyección visual: estímulos visuales

NOTA: La representación y la animación de los estímulos visuales también se pueden realizar en Procesamiento utilizando los pasos siguientes como guías junto con los tutoriales de la plataforma. Se proporciona un esquema de la lógica del programa actual en (Figura 3) y se pueden encontrar detalles adicionales en Lemasson et al. (2018)7. Los pasos siguientes proporcionan ejemplos de los pasos de calibración realizados en el experimento actual.

  1. Abra el programa de proyección visual Vfish.pde para centrar la proyección dentro del área de decisión del laberinto (Figura1A)y calibrar las proyecciones visuales en función de las hipótesis que se están probando (por ejemplo, calibrar el tamaño y las velocidades de las siluetas para que coincidan los de los sujetos de prueba). Las calibraciones se ajustan a mano en el encabezado del programa principal (Vfish.pde) utilizando indicadores de depuración preseleccionados. En el modo de depuración (DEBUG - TRUE) paso secuencialmente a través de cada marca DEBUGGING_LEVEL_- (números 0-2) para realizar los ajustes necesarios
    1. Establezca el indicador DEBUGGING_LEVEL_0 en 'true' y ejecute el programa pulsando el icono de reproducción en la ventana de croquis. Cambie los valores de posición x e y (parámetros de dominio dx y dy, respectivamente) hasta que la proyección esté centrada.
    2. Establezca DEBUGGING_LEVEL_1 en 'true' para escalar el tamaño de la silueta de pescado (representada como una elipse). Ejecute el programa y ajuste iterativamente el ancho (eW) y la longitud (eL) de la elipse hasta que coincida con el tamaño medio de los sujetos de prueba. Después, establezca DEBUGGING_LEVEL_2 en 'true' para ajustar la velocidad de línea base de las siluetas (ss).
    3. Establezca DEBUG en FALSE para salir del modo de depuración.
  2. Compruebe que las siluetas del distractor permanecen limitadas al área de decisión (DA, Figura 1A),que las trayectorias de la silueta de directriz están correctamente alineadas con cualquiera de los brazos y que la relación directriz/distraído dentro del DA permanece constante.
  3. Pase por la GUI del programa para garantizar la funcionalidad de las opciones.
  4. Compruebe que los datos se están escribiendo correctamente en el archivo.
  5. Asegúrese de que el software de grabación puede rastrear el pez sujeto con proyecciones visuales en su lugar. Los pasos para rastrear peces se han descrito previamente en Kaidanovich-Berlin et al. (2011)8, Holcomb et al. (2014)9, Way et al. (2016)10 y Zhang et al. (2018)11.

6. Preparación animal

  1. Elija las especies temáticas en función de la pregunta de investigación y la aplicación, incluyendo el sexo, la edad, el genotipo. Asigne sujetos a los tanques de retención experimentales y registre las estadísticas biométricas de línea de base (por ejemplo, la longitud del cuerpo y la masa).
  2. Establezca las condiciones ambientales en el laberinto con las del sistema de retención. Las condiciones de calidad del agua para los experimentos de referencia de comportamiento a menudo se mantienen en óptimo para la especie y para la configuración del dominio experimental.
    1. En esta demostración, utilice las siguientes condiciones: ciclo oscuro de 12 h de luz/12 h, luces halógenas sin parpadeo sin parpadeos superiores establecidas en 134 x 5 lux, 22 o 0,3 oC, 97,4 x 1,3% de oxígeno disuelto y pH de 7,8 a 0,1.
  3. Habitua rinde a los animales transfiriéndolos al dominio durante un máximo de 30 minutos al día durante 5 días sin los estímulos visuales generados por ordenador (por ejemplo, siluetas de peces) antes del inicio de los ensayos experimentales.
  4. Asegúrese de que el pez sujeto en ese momento esté seleccionado, asignado, pesado, medido y transferido a tanques experimentales.
    NOTA: Aquí, la longitud estándar y el peso húmedo de Golden Shiners eran de 63,4 x 3,5 mm SL y 1,8 x 0,3 g WW, respectivamente.
  5. Utilice una transferencia de agua a agua cuando mueva peces entre tanques y el laberinto para reducir el estrés de la manipulación y la exposición al aire.
  6. Llevar a cabo experimentos durante un ciclo de luz regular y fijo que refleje el ritmo biológico natural de los sujetos. Esto permite que los sujetos sean alimentados al final de los ensayos experimentales de cada día para limitar los efectos de la digestión en el comportamiento.

7. Procedimiento experimental

  1. Encienda el proyector de la sala y los sistemas de orugas de luz LED a un nivel predeterminado de brillo (en esta demostración de 134 x 5 lux) permitiendo que las bombillas se calienten (aproximadamente 10 minutos).
  2. Abra el programa del visor de cámara y cargue los ajustes de apertura, color y grabación guardados desde la configuración para garantizar que se pueda lograr el vídeo de la mejor calidad.
    1. Abra Pylon Viewer y active la cámara que se utilizará para la grabación.
    2. Seleccione Cargar entidades en el menú desplegable de la cámara y vaya a la carpeta de configuración de la cámara guardada.
    3. Abra los ajustes guardados (aquí etiquetados como camerasettings_20181001) para garantizar la calidad del vídeo y haga clic en la toma continua.
    4. Cierre Pylon Viewer.
  3. Abra el programa de proyección visual Vfish.pde y compruebe que la proyección permanece centrada en el laberinto, que la carpeta DataOut está vacía y que el programa funciona según lo esperado
    1. Compruebe que el anillo de calibración está centrado en el DA mediante el paso 5.1.1.
    2. Abra la carpeta DataOut para asegurarse de que está vacía durante el día.
    3. Ejecute el programa de estímulos visuales pulsando play en la ventana de boceto de Vfish.pde y utilice variables ficticias para garantizar la funcionalidad del programa.
      1. Introduzca el número de identificación de pescado (1-16), pulse Introy, a continuación, confirme la selección pulsando Y o N para sí o no.
      2. Introduzca el tamaño del grupo (fijo aquí en 1) y confirme la selección.
      3. Introduzca la velocidad de silueta deseada (0-10 BL/s) y confirme la selección.
      4. Pulse Intro para pasar el período de aclimatación y comprobar la proyección del pez virtual en el área de decisión.
      5. Pulse Pausa para pausar el programa e introducir la opción de resultado ficticio, es decir, izquierda (1) o derecha (2).
      6. Pulse Detener para finalizar el programa y escribir los datos en el archivo.
    4. Compruebe que los datos se han escrito correctamente en el archivo en la carpeta DataOut y registre el archivo como una ejecución de prueba en las notas de laboratorio antes de que los peces se coloquen en el dominio para su aclimatación.
  4. Utilice la hora del reloj y un cronómetro para registrar los tiempos de inicio y detención de la prueba en el bloc de notas de laboratorio para complementar los tiempos transcurridos que se pueden extraer posteriormente de la reproducción de vídeo debido a la corta duración de algunas pruebas de réplica.
  5. Realizar un cambio de agua (por ejemplo, 30%) utilizando el sistema de retención sump agua antes de transferir un sujeto al laberinto.
  6. Confirme que la calidad del agua es similar entre el laberinto y el sistema de sujeción, y compruebe el funcionamiento de la puerta para asegurarse de que se desliza suavemente hasta justo por encima de la altura del agua.
  7. Utilizando el calendario experimental predeterminado, que tiene exposiciones aleatorias de tratamiento de sujeto en el transcurso del experimento, introduzca los valores seleccionados para el ensayo actual (deteniéndose en la pantalla de aclimatación, pasos 7.3.3.1 - 7.3.3.3).
    1. Registre los datos de combinación de tratamiento en el cuaderno de laboratorio.
  8. Transfiera al sujeto al área de retención del laberinto Y durante un período de aclimatación de 10 minutos.
  9. Inicie la grabación de vídeo y, a continuación, pulse la tecla Retorno en la ventana Vfish.pde al final del período de aclimatación. Esto iniciará las proyecciones visuales.
  10. Cuando el pez virtual aparece en el dominio, registre la hora del reloj, y levante la puerta de retención (figura4A).
  11. Finalizar el ensayo cuando el 50% del cuerpo del sujeto se mueva en un brazo de elección (Figura4B)o cuando transcurra el período de tiempo designado (por ejemplo, 5 min).
    1. Registre la hora del reloj, las horas de inicio y parada desde el cronómetro y la elección de los sujetos (es decir, izquierda (1), derecha (2) o ninguna opción(0)).
    2. Detenga la grabación de vídeo y pulse Pausa en el programa de estímulos visuales, lo que pedirá al usuario los datos de resultados del ensayo (el número de brazo seleccionado o un 0 para indicar que no se ha realizado ninguna elección). Al confirmar la selección, el programa volverá a la primera pantalla y esperará los valores esperados para el próximo ensayo experimental.
  12. Recoja el sujeto y devuélvalo al tanque de retención respectivo. Repita los pasos 7.7-7.13 para cada prueba.
  13. Al final de una sesión (AM o PM) pulse Detener en el programa una vez que el último pez de la sesión haya tomado una decisión. Al pulsar Detener se escribirán los datos de la sesión en el archivo.
  14. Repita el intercambio de agua al final de la sesión matutina para garantizar la estabilidad de la calidad del agua.
  15. Después de la última prueba del día, revise el cuaderno de laboratorio y tome las notas necesarias.
    1. Pulse Detener en el programa de estímulos visuales para generar los datos recopilados en la carpeta DataOut, después de la última prueba del día.
  16. Compruebe el número, el nombre y la ubicación de los archivos de datos guardados por el programa de visualización.
  17. Calidad del agua de registro, junto con los niveles de luz en la sala de laberinto para comparar con los ajustes de la mañana. Coloque el sistema de aireación y los calentadores en el laberinto Y.
  18. Apague el proyector y la iluminación experimental de seguimiento de salas.
  19. Alimente a los peces con la ración diaria predeterminada.

8. Análisis de datos

  1. Asegúrese de que los datos experimentales contienen las variables necesarias (por ejemplo, fecha, prueba, identificación del sujeto, brazo seleccionado por programa, factores visuales probados, elección del sujeto, horas de inicio y parada, y comentarios).
  2. Compruebe si hay errores de grabación (humanos o inducidos por el programa).
  3. Tabular las respuestas y comprobar si hay signos de cualquier sesgo direccional por parte de los sujetos (por ejemplo, prueba binomial en la elección del brazo en la condición de control)7.
  4. Cuando el experimento se diseña utilizando mediciones repetidas en los mismos individuos, como en el caso aquí, se sugiere el uso de modelos de efectos mixtos.

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Representative Results

Hipótesis y diseño

Para demostrar la utilidad de este sistema experimental probamos la hipótesis de que la precisión con la que Golden Shiner sigue una señal visual mejorará con la velocidad de esa cue. Se utilizaron el tipo salvaje Golden Shiner (Na 16, longitudes del cuerpo, BL, y pesos húmedos, WW, fueron 63,4 x 3,5 mm y 1,8 x 0,3 g, respetuosamente). La coherencia de los estímulos visuales (relación líder/distractor) se corrigió en 0,67, mientras manipulamos la velocidad a la que nuestras señales de movimiento (es decir, los líderes) se movieron con respecto a sus distractores. Niveles de velocidad de las siluetas de líder que proporcionan las señales direccionales oscilan entre 0-10 BL/s (en incrementos de 2), que abarca el rango de velocidades típicamente consideradas para reflejar modos de actividad de natación sostenida, prolongada o de ráfaga en peces12. En el nivel de control, 0, las siluetas de líder estaban orientadas hacia un brazo de destino entre los distractores orientados al azar, pero ninguna de las siluetas se movía. El brazo de destino fue elegido al azar para cada ensayo por el programa. Las unidades de distancia están en longitud del cuerpo, que se definió por la longitud estándar media de nuestros sujetos, y el tiempo es en segundos. El análisis representativo actual se centra en la medición de las variables de respuesta primaria (velocidad de decisión y precisión), sin embargo, el diseño del experimento también permite a los investigadores extraer información adicional mediante el seguimiento de los movimientos del sujeto y el análisis de sus Cinemática.

Nuestros sujetos de pescado fueron alojados siguiendo la sección 6 del protocolo. Cada sujeto estuvo expuesto a un nivel del tratamiento por día. Aleatorizamos tanto dentro del nivel de tratamiento del sujeto (velocidad de la señal) a lo largo de los días como del orden en que los sujetos se probaron en cada día. Los modelos lineales y generalizados de efectos mixtos lineales (LMM y GLMM, respectivamente) se utilizaron para probar los efectos de la velocidad de la silueta de líder en la velocidad y precisión con la que los sujetos siguieron los estímulos visuales. El identificador del sujeto se incluyó como el efecto aleatorio en ambos modelos.

Datos y hallazgos

En ausencia de cualquier señal de movimiento, Golden Shiner actuó según lo esperado y eligió su dirección al azar (velocidad de estímulo 0, prueba binomial, nIzquierdaa 33, nDerechaa 40, 0,45, P a 0,483). Mientras que la mayoría de los sujetos no mostraron signos de comportamiento estresante dentro del dominio y tomaron una decisión decisiva dentro del tiempo asignado (5 min), 22% de los sujetos mostraron una renuencia a salir del área de retención o entrar en el área de decisión. Los datos de estos peces indecisos no se incluyeron en el análisis. El 78% restante de nuestros sujetos mostró una mejora significativa en la precisión con la que siguieron los estímulos direccionales a medida que aumentaba la velocidad de esos estímulos (GLMM, z a 1.937, P a 0.053). La Figura 5A muestra la naturaleza de esta relación, donde encontramos un aumento de 1.2 veces en la precisión direccional por cada aumento en el nivel de velocidad de estímulo. Esta relación es sólo modestamente desproporcionada y, por sí misma, no sugiere una respuesta umbral a los cambios en la velocidad de la señal. Los aumentos en la velocidad de estímulo también dieron lugar a un aumento significativo en la velocidad de decisión (LMM, F1,56a 4,774, P a 0,033). Sin embargo, como es evidente en la Figura 5B, la tendencia en la velocidad de decisión fue inconsistente y muy variable a través de los niveles de velocidad de estímulo. Lo que es evidente en estos datos de velocidad de decisión es que los sujetos tardaron, en promedio, entre 5 y 20 veces más para tomar su decisión cuando los estímulos se movían que cuando no lo estaban (velocidades de decisión de 4,6 x 2,3 s y 81,4 x 74,7 s para estímulos velocidades de 0 y 8, respectivamente, - desviación estándar, SD). De hecho, sin el nivel de control no encontramos ningún cambio significativo en la velocidad de decisión en función de la velocidad de estímulo.

Figure 1
Figura 1. Dominio Y-Maze. A. Imagen del aparato del laberinto Y para la prueba de toma de decisiones. Las anotaciones representan lo siguiente: área de retención (HA, verde), área de decisión (DA, azul), brazo de decisión izquierdo (LDA) y brazo de decisión derecho (RDA). B. Imagen del laberinto Y y la habitación con iluminación de pista ajustable en la parte superior y colocación de la cámara GigE (sólo una de las cuatro tiras de luces de techo son visibles). C. Imagen del laberinto Y (vista lateral), incluida la colocación del proyector que está bloqueada por el carro deslizante para eliminar los movimientos durante o entre pruebas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2. Calibración de fondo y estímulo. A. Imagen del laberinto Y iluminado con un color de fondo uniforme y un transecto de intensidad de píxeles (línea verde) entre el área de retención y el área de decisión, DA (intensidad media de píxeles 112 a 1278). El gradiente de luz generado por la bombilla del proyector (punto de acceso) es claramente visible. B. Imagen que muestra la alineación de las proyecciones con el DA. C. Imagen del laberinto con el fondo filtrado y una silueta solitaria proyectada en el centro del DA para la calibración (tamaño, velocidad). La adición del fondo del degradado del contador en (C) da como resultado un fondo más oscuro (intensidad media de píxeles 143,1 a 5,5) y mucha menos variabilidad espacial (el coeficiente de variación disminuye de 11,4 (A.) a 0,03 (C.). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3. Esquema del flujo general de operaciones en el programa de visualización utilizado en los experimentos. Para más detalles de procedimiento, véase7. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 4
Figura 4. Ensayo experimental con siluetas de peces reales y virtuales. A. Imagen de un Shiner dorado (en vivo) dejando el área de retención (círculo verde). B. Imagen de un Shiner Dorado (en vivo) en el área de decisión (círculo verde) entre las siluetas de peces virtuales. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 5
Figura 5. Precisión y velocidad de las respuestas direccionales a los cambios en la velocidad relativa de las señales de movimiento. A. Gráfico de la precisión de la decisión de los peces con el que Golden Shiner siguió las siluetas 'líderes' trazadas contra la velocidad de estímulo (BL/s). B. Gráfico de la velocidad de decisión de los peces trazada contra la velocidad de estímulo (BL/s). Los datos son medios: errores estándar, se. Grupos de 15 siluetas virtuales se distribuyeron aleatoriamente en toda la zona de decisión con un nivel de coherencia del 67% (10 de las 15 siluetas actuaban como Líderes, las 5 siluetas restantes actuaban como distractores) y variamos las La velocidad de los líderes de 0-10 BL/s. Las velocidades de distraer permanecieron fijas en 1 BL/s en todos los niveles de velocidad, excepto el control en el que ninguna de las siluetas se movía. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Discussion

Se sabe que las señales visuales desencadenan una respuesta optomotor en peces expuestos a rejillas blancas y negras13 y hay cada vez más evidencia teórica y empírica de que la velocidad del vecino desempeña un papel influyente en la gobernanza de las interacciones dinámicas observadas en escuelas de peces7,14,15,16,17. Existen hipótesis en contraste para explicar cómo los individuos en grupos integran los movimientos de vecinos, como reaccionar proporcionalmente a todas las señales discernibles14,adoptar una respuesta de umbral de movimiento17o monitorear los tiempos de colisión 18. Un primer paso para probar estas hipótesis alternativas es validar sus supuestos subyacentes. Aquí demostramos la utilidad de nuestro protocolo en la identificación del papel que una característica sensorial determinada puede tener en guiar las decisiones direccionales.

Aislamos cómo los individuos de una especie de pez social, el Golden Shiner, respondieron a los cambios en la velocidad relativa de los estímulos visuales diseñados para imitar a los conespecíficos en una escuela. La precisión direccional de Golden Shiner mejoró con aumentos en la velocidad relativa de los estímulos visuales, pero la relación funcional entre estas variables fue sólo marginalmente desproporcionada. La relación entre la velocidad de decisión y la velocidad de estímulo, aunque significativa, fue muy variable e inconsistente. Los resultados demuestran, sin embargo, que una diferencia de velocidad encontrada en imágenes dispersas por el campo de visión de estos peces juega un papel importante en la activación de una respuesta y guiar su atención de plano. Aparte de cómo los individuos seleccionan entre las acciones de vecinos específicos podrían ser sondeados con el diseño actual mediante la introducción de direcciones contradictorias en los estímulos.

En un experimento reciente con El pez cebra, Danio rerio,no encontramos evidencia de indecisión en los ensayos solitarios 7, sin embargo, Golden Shiner en esta demostración mostró una mayor renuencia a salir de la zona de retención. Las diferencias entre estas dos especies pueden explicarse por sus estrategias de historia de vida y la fuerza relativa de sus tendencias sociales (o confianza). Los peces cebra parecen mostrar una coherencia social más variable que los Golden Shiners (por ejemplo, los escolares facultativos frente a los que obligan3). Es probable que la coherencia social más fuerte en Golden Shiner haya contribuido a sujetos que muestran mayores niveles de timidez, o vacilación dentro del dominio que sus contrapartes de pez cebra.

El orden de los pasos es sutil pero crítico en el protocolo. El proceso de equilibrio de las luces, el proyector y el filtro de programa puede tardar más tiempo del previsto a menudo para los nuevos dominios. En este protocolo, se han incluido lecciones aprendidas para reducir la configuración y el tiempo de equilibrio de la luz, como el uso de luces de pista que se reflejan fuera de la pared (no en el dominio), controladores de luz ajustables y filtros generados por programas para el proyector. Tenga en cuenta también que lo que puede parecer visualmente aceptable para el ojo humano no será visto por la cámara y el software de la misma manera, por lo que sus condiciones de iluminación pueden requerir ajustes adicionales. Incluso los ligeros cambios en los ángulos del monitor darán lugar a cambios de degradado de fondo. Por lo tanto, la toma detallada de notas y guardar la configuración del archivo reducirá en gran medida la probabilidad de que se produzcan cambios durante el experimento. Pasar por el proceso de físico a filtrado, como se presenta aquí, produce los pasos más rápidos para el éxito.

El uso de un proyector ST permite una mayor flexibilidad espacial sobre un monitor, pero este enfoque crea una anomalía visual no deseada llamada "punto de acceso". Un punto de acceso es un punto de acceso brillante en la superficie de proyección creado por la proximidad de la bombilla del proyector. En el protocolo, la Sección 4 se dedicó a la creación de filtros de fondo y la comprobación de rayos homogéneos en todo el dominio. Los pasos proporcionados aquí ayudarán a los usuarios a evitar, o minimizar, los efectos no deseados del punto de acceso modelando cualquier gradiente no deseado y utilizando el modelo para reproducir un degradado inverso para contrarrestar los efectos. Por último, el modelo de proyector ST puede variar, sin embargo, los ajustes de imagen (rotación, volteo, proyección de pantalla delantera o trasera) y la corrección keystone (3-5 grados) son características útiles para garantizar que la imagen deseada se ajuste al dominio y se pueda ajustar para la distorsión.

Con el tiempo, las salas experimentales se actualizaron para facilitarse mediante cambios en el hardware (es decir, cámaras, cableado, tarjetas de vídeo, monitores). Cabe mencionar que los cambios de hardware probablemente darán lugar a tiempo de arranque adicional para equilibrar la iluminación y trabajar a través de cualquier problema potencial del programa. Por lo tanto, se recomienda que cualquier hardware se dedique a un sistema hasta la finalización de los experimentos deseados. La mayoría de los desafíos se han relacionado con las diferencias de rendimiento entre monitores, tarjetas de vídeo y las cámaras, lo que a veces se traduce en la alteración del código de programación. Desde el momento de este trabajo, se han desarrollado nuevos dominios en los que el dominio de prueba interno se puede quitar y cambiar para otros dominios de prueba. Recomendamos que se tenga en cuenta esta flexibilidad al diseñar los dominios experimentales y las estructuras de soporte.

El protocolo actual permite a los investigadores aislar y manipular las características visuales de una manera que refleje el entorno visual esperado dentro de una escuela, mientras que también controla los factores de confunción que acompañan la exposición a conespecíficos reales (por ejemplo. , hambre, familiaridad, agresión)7. En general, la animación por ordenador (CA) de peces virtuales (es decir, siluetas) es una práctica que se está volviendo más común debido a sus claras ventajas en la estimulación de las respuestas conductuales19,20,21. CA permite personalizar las señales visuales (dirección, velocidad, coherencia o morfología), al tiempo que se introduce un nivel de estandarización y repetibilidad en el estímulo deseado que supera lo que se puede lograr al utilizar animales vivos como estimulante. El uso de la realidad virtual en los estudios conductuales, tanto en animales22 como en humanos23,también está aumentando constantemente y promete convertirse en una poderosa herramienta empírica a medida que la tecnología se vuelve más disponible y manejable. En conjunto, estos enfoques virtuales también reemplazan y reducen las necesidades de los animales vivos de la ética animal en la ciencia (por ejemplo, IACUC, AAALAC y ACURO)24,al tiempo que reducen de forma concomitante los costos y cargas de laboratorio.

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Disclosures

Todos los autores contribuyeron al diseño experimental, analiza y escriben el artículo. A.C.U. y C.M.W. configuraron y recopilaron los datos. Los autores no tienen nada que revelar.

Acknowledgments

Agradecemos a Bryton Hixson por la asistencia de configuración. Este programa fue apoyado por el Programa Básico de Investigación, Calidad Ambiental e Instalaciones (EQI; Dra. Elizabeth Ferguson, Directora Técnica del Centro de Investigación y Desarrollo de Ingenieros del Ejército de los Estados Unidos.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Black and white IP camera Noldus, Leesburg, VA, USA https://www.noldus.com/
Extruded aluminum 80/20 Inc., Columbia City, IN, USA 3030-S https://www.8020.net 3.00" X 3.00" Smooth T-Slotted Profile, Eight Open T-Slots
Finfish Starter with Vpak, 1.5 mm extruded pellets Zeigler Bros. Inc., Gardners, PA, USA http://www.zeiglerfeed.com/
Golden shiners Saul Minnow Farm, AR, USA http://saulminnow.com/
ImageJ (v 1.52h) freeware National Institute for Health (NIH), USA https://imagej.nih.gov/ij/
LED track lighting Lithonia Lightening, Conyers, GA, USA BR20MW-M4 https://lithonia.acuitybrands.com/residential-track
Oracle 651 white cut vinyl 651Vinyl, Louisville, KY, USA 651-010M-12:5ft http://www.651vinyl.com. Can order various sizes.
PowerLite 570 overhead projector Epson, Long Beach CA, USA V11H605020 https://epson.com/For-Work/Projectors/Classroom/PowerLite-570-XGA-3LCD-Projector/p/V11H605020
Processing (v 3) freeware Processing Foundation https://processing.org/
R (3.5.1) freeware The R Project for Statistical Computing https://www.r-project.org/
Ultra-white 360 theater screen Alternative Screen Solutions, Clinton, MI, USA 1950 https://www.gooscreen.com. Must call for special cut size
Z-Hab system Pentair Aquatic Ecosystems, Apopka, FL, USA https://pentairaes.com/. Call for details and sizing.

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References

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Comportamiento Problema 147 Y-Maze Toma de decisiones Visión Señales de movimiento Estímulos virtuales Animación por computadora
Integración de ensayos psicofísicos visuales dentro de un laberinto Y para aislar el papel que desempeñan las características visuales en las decisiones de navegación
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Woodley, C. M., Urbanczyk, A. C., Smith, D. L., Lemasson, B. H. Integrating Visual Psychophysical Assays within a Y-Maze to Isolate the Role that Visual Features Play in Navigational Decisions. J. Vis. Exp. (147), e59281, doi:10.3791/59281 (2019).

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