Dieses Papier stellt eine Operationsmethode für sezieren Drosophila pupal Netzhaut zusammen mit Protokolle für die Verarbeitung von Gewebe für Immunohistochemistry, westlichen Analyse und RNA-Extraktion.
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Methodenartikel
Dissektion der Drosophila Pupal Netzhaut Immunohistochemistry, westlichen Analyse und RNA-Isolation
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Die Drosophila pupal Netzhaut bietet ein hervorragendes Modellsystem für das Studium der morphogenetischen Prozesse während der Entwicklung. In diesem Beitrag präsentieren wir Ihnen ein zuverlässiges Protokoll für die Zerlegung der zarten Drosophila pupal Netzhaut. Unsere chirurgische Ansatz nutzt verfügbar Mikrodissektion Werkzeuge um Puppen zu öffnen und extrahieren Sie genau Auge-Gehirn-komplexe. Diese feste, Immunohistochemistry und Netzhaut ausgesetzt dann montiert auf Objektträger und abgebildet, wenn das Ziel, zelluläre und subzelluläre Strukturen zu erkennen. Alternativ können Sie fixierten Netzhaut von Gehirngewebe isoliert, in entsprechende Puffer lysiert und für Gel-Elektrophorese oder mRNA Proteingewinnung (, Protein oder gen-Expression, bzw. bewerten) genutzt. Bedeutende Übung und Geduld können erforderlich sein, das beschriebenen Mikrodissektion Protokoll beherrschen, aber einmal gemeistert, das Protokoll ermöglicht relativ schnelle Isolation vor allem unbeschädigt Netzhaut.
Einleitung
Die Drosophila Netzhaut besteht aus ca. 750 Ommatidien umgeben von Pigmentzellen in einer Bienenwabe Gitter1,2,3,4angeordnet. Jedes Ommatidium enthält acht Photorezeptor Neuronen, vier Objektiv-sezernierenden Zapfen und zwei primäre Pigmentzellen. Rund um jedes Ommatidium sind pigmentbildenden Gitter Zellen und sensorischen Borsten Gruppen. Aufgrund seiner Post-mitotische Natur und Stereotype hexagonalen Anordnung bietet die Drosophila pupal Netzhaut eine hervorragendes Modell-System für das Studium der morphogenetischen Pr....
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Protokoll
(1) Gewebe-Vorbereitung
- Einrichten von Drosophila kreuzt (wie zuvor beschrieben20) oder Kultur spezifische Drosophila Stämme um Puppen des gewünschten Genotyps zu erhalten. Um sicherzustellen, dass eine große Anzahl von Puppen zusammentreffend entstehen, schaffen diese Fliege Kulturen in zweifacher Ausfertigung auf nährstoffreiche Lebensmittel oder standard-Food Medien großzügig mit Hefe-Paste ergänzt.
- Pflegen von Drosophila Kulturen bei 25 ° C. Für Kreuze unter Verwendung der UAS-GAL4-System ist GMR-GAL4 eine ideale Treiber ausgedrückt in Larven Auge Bandscheibenzellen posterior der morph....
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Ergebnisse
Das pupal Auge ist eine leicht zugängliche Gewebe, das das Laufwerk Morphogenese als ein hervorragendes Modell dient, Entwicklungsprozesse zu untersuchen. Hier haben wir die Netzhaut seziert und Immunfluoreszenz zur Erkennung der apikalen Adherens Junctions (Abb. 3A, C) oder die Dcp-1 Caspase (Abbildung 3D), die während der Apoptose (Abbildung 3)25aktiviert wird verwendet. Diese Ansätze lasse.......
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Diskussion
Die Methode der Drosophila pupal Auge Dissektion hier beschriebenen ermöglicht für die Isolierung von 6 bis 10-Auge-Gehirn-komplexe innerhalb von 10 bis 15 Minuten. Geduld und Übung sind jedoch notwendig, um die Dissektion Technik beherrschen und Verbesserung der Qualität und Geschwindigkeit der Sektionen. Diesmal kurz Dissektion sorgt dafür, dass jedes Auge ungefähr gleichen Entwicklungsstadium, Reduzierung der Variabilität in der Phänotyp oder gen Ausdruck der Netzhaut in einem Dataset. Während alternative Pro.......
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Offenlegungen
Die Autoren haben nichts preisgeben.
Danksagungen
Wir danken Zack Trommel und unsere Rezensenten für hilfreiche Kommentare auf das Manuskript. Diese Arbeit wurde durch R15GM114729 unterstützt.
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| Adobe Photoshop | Adobe | Bildbearbeitungssoftware | |
| Bambusschienen, 6" | Ted Pella Inc | 116 | |
| Beta-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M3148 | |
| Beta-Glycerinphosphat | Sigma-Aldrich | 50020 | |
| Schwarze Präparierschale | Petrischale aus Glas, die bis zum Rand mit SYLG170 oder SYLG184 gefüllt ist (schwarz gefärbt mit fein gemahlenem Holzkohlepulver). 24-48 h bei Raumtemperatur polymerisieren lassen. | ||
| Klingenhalter | Fine Science Tools | 10053 | |
| Rinderserumalbumin | Sigma-Aldrich | A7906 | |
| cOmplete, EDTA-freier Proteasehemmer Cocktailtabletten | Roche | 4693132001 | |
| Konfokalmikroskop (Zeiss LSM 501) | Carl Zeiss | oder ähnliches Mikroskop | |
| Diethyl Pyrocarbonat (DEPC) | Sigma-Aldrich | 40718 | |
| Doppelseitiges Klebeband | 3M | 665 | |
| Drosophila Lebensmittelmedien, nährstoffreich | 7,5 % Saccharose, 15 % Glukose, 2,5 % Agar, 20 % Bierhefe, 5 % Pepton, 0,125 % MgSO4.7H2O, 0,125 % CaCl2.2H20 | ||
| Drosophila Lebensmittelmedien, Standard | Bloomington Drosophila Stock Center Maismehl Rezept. (https://bdsc.indiana.edu/information/recipes/bloomfood.html) | ||
| Ethylendiamintetraessigsäure | Sigma-Aldrich | E6758 | |
| Fixierlösung | 4% Formadehyd in PBS, pH 7,4. | ||
| Fluoreszenzmikroskop (TCS SP5 DM Mikroskop) | Leica Microsystems | oder ähnliches Mikroskop | |
| Pinzetten | Fine Science Tools | 91150-20 | Pinzetten sollten häufig geschärft werden. |
| Formaldehyd | Thermo Scientific | 28908 | |
| Glas 9-Well-Schalen | Corning | 7220-85 | Auch bekannt als 9-Well-Geschirr |
| Deckgläser aus Glas (22 x 22 mm) | Fisher Scientific | 12-542-B | |
| Objektträger aus Glas (25 x 75 x 1 mm) | Fisher Scientific | 12-550-413 | |
| Petrischale aus Glas | Corning | 3160-100BO | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| Image Studio Softwareversion 5.2.5 | LI-COR Biosciences | Bildverarbeitungssoftware zur Quantifizierung von Western Blots. | |
| Laemmli Probenpuffer | Bio-Rad | 161-0737 | 2X konzentrierter Protein-Probenpuffer, Ergänzung mit Beta-Mercaptoethanol gemäß Herstellerangaben. |
| Spurmarkierung zur Reduzierung des Probenpuffers | ThermoFisher Scientific | 39000 | 5X konzentrierter Proteinprobenpuffer. |
| Mikrozentritur-Röhrchen | Axygen | MCT-175-C | |
| Mikrodissektionsschere | Fine Science Tools | 15000-03 | |
| Mikrotiter-Trays (72 x 10 & Mikro; L-Wells) | Nunc | 438733 | |
| Eindeckmedien | 0,5 % N-Propylgallat und 80 % Glycerin in PBS | ||
| N-Propylgallat | Sigma-Aldrich | P3130 | |
| Nukleasefreies PBS (PBS in 0,1 % DEPC, pH 7,4) | PBS mit einer entsprechenden Menge DEPC zugeben, gut mischen und über Nacht bei Raumtemperatur unter ständigem Rühren inkubieren. Mindestens 20 Minuten lang autoklavieren. Bei 4° lagern; C | ||
| PBS (phosphatgepufferte Kochsalzlösung pH 7,4) | Sigma-Aldrich | P5368 | Herstellen gemäß Herstellerangaben |
| PBS+pi (PBS plus Protease- und Phoshatase-Hemmer) | 10 mM NaF, 1 mM Beta-Glycerinphosphat und 1 mM Na3VO4 in PBS, pH 7,4. | ||
| PBT | 0,15 % TritonX und 0,5 % Rinderserumalbumin in PBS, pH 7,4 | ||
| Pin-Halter | Fine Science Tools | 26016-12 | |
| Primärer Antikörper: Ziegen-Anti-GAPDH | Imgenex | IMG-3073 | Für Western Blotting. Verwendet bei 1:3000 |
| Primärer Antikörper: Kaninchen anti-gespaltene Dcp-1-Zellsignalisierung | 9578S | Für Immunfluoreszenz. Verwendet bei 1:100 | |
| Primärer Antikörper: Ratte anti-DEcad | Developmental Studies Hybridoma Bank | DCAD2 | Für Immunfluoreszenz. Verwendet bei 1:20 |
| Primärer Antikörper: Ratte anti-DEcad | DOI: 10.1006/dbio.1994.1287 | DCAD1 | Geschenk von Tadashi Uemura. Verwendet bei 1:100. |
| RNA-Extraktionskit: Relia Prep Miniprep-Kit für RNA-Gewebe | Promega | Z6110 | |
| Rnase-Dekontaminationsreagenz (RNase Away) | Molecular BioProducts | 7002 | |
| Skalpellklingen | Fine Science Tools | 10050 | Brechen Sie ein kleines Stück der Scapel-Klinge ab und befestigen Sie es im Klingenhalter. |
| Sekundärer Antikörper: 488-konjugiert Esel Anti-Ratte IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 712-545-153 | Für Immunfluoreszenz. Verwendet bei 1:200 |
| Sekundärer Antikörper: cy3-konjugiertes Ziegen-Anti-Kaninchen-IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 111-165-144 | Für Immunfluoreszenz. Verwendet bei 1:100 |
| Sekundärer Antikörper: HRP-konjugiertes Ziegen-Anti-Ratten-IgG (H+L) | Cell Signaling Technology | 7077 | Für Western Blotting. Verwendet bei 1:3000 |
| Sekundärer Antikörper: HRP-konjugiertes Kaninchen-Anti-Ziegen-IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 305-035-003 | Für Western Blotting. Verwendet bei 1:3000 |
| Natriumchlorid | Sigma-Aldrich | S3014 | |
| Natriumfluorid | Sigma-Aldrich | 215309 | |
| Natriumvanadat | Sigma-Aldrich | 50860 | |
| Spektralphotometer (NanoDrop) | ThermoFisher Scientific | 2000c | |
| Stereo-Präpariermikroskop (M60 oder M80) | Leica Microsystems | oder ähnliches | |
| Mikroskop Sylgard (schwarz) | Dow Corning | SYLG170 | |
| Sylgard (transparent) | Dow Corning | SYLG184 | Farbe schwarz mit fein gemahlenem Charcol-Pulver |
| Taschentuch: Kimwipes | KIMTECH | 34120 | |
| TritonX | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| Trizma-Hydrochlorid pH7,5 | Sigma-Aldrich | T5941 | |
| Wolframnadel, fein | Fine Science Tools | 10130-10 | Einsatz in Stifthalter |
| Wolframnadel, robust | Fine Science Tools | 10130-20 | Einsatz in Stifthalter |
| WTLB (Western Tissue Lysis Buffer) | 150 mM NaCl, 1,5 % Triton X-100, 1 mM EDTA, 20 % Glycerin, 10 mM NaF, 1 mM Beta-Glycerinphosphat und 1 mM Na3VO4 in 50 mM Tris-HCl (pH 7,5). Ergänzen Sie mit einem cOmplete Protease-Cocktailtisch pro 10 ml Lösung. | ||
| Hefepaste | (lokaler Supermarkt) | Ca. 2 Esslöffel Fleischmann's ActiveDry Hefe (oder ähnliches) aufgelöst in ~20 mL destilliertem H2O |
Referenzen
- Cagan, R. L., Ready, D. F. The emergence of order in the Drosophila pupal retina. Developmental biology. 136 (2), 346-362 (1989).
- Wolff, T., Ready, D. The development of Drosophila melanogaster. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Plainview. 1277-1325 (1993).
- Carthew, R. W.
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Nachdrucke und Genehmigungen
