Studium der oxidativen Stress verursachten Mitis Gruppe Streptokokken in Caenorhabditis elegans

Zusammenfassung

Der Fadenwurm Caenorhabditis Elegans ist ein hervorragendes Modell, Wirt-Pathogen Interaktionen zu zergliedern. Hier beschrieben, ist ein Protokoll zu infizieren den Wurm mit den Mitgliedern der Gruppe Streptokokken Mitis und Aktivierung der oxidativen Stress-Reaktion gegen H₂O₂ produziert von dieser Gruppe von Organismen zu bestimmen.

Zusammenfassung

Caenorhabditis Elegans (C. Elegans), eine freilebende Nematode, entstanden als ein attraktives Modell für Wirt-Pathogen Interaktionen zu untersuchen. Die vorgestellte Protokoll verwendet dieses Modell um die Pathogenität von Mitis Gruppe Streptokokken über die Herstellung von H₂O₂verursacht zu bestimmen. Mitis Gruppe Streptokokken sind eine neue Bedrohung, die vielen menschlichen Krankheiten wie Bakteriämie, Endokarditis und Orbitaphlegmone verursachen. Hier beschriebenen entsteht ein Protokoll, um das Überleben dieser Würmer als Reaktion auf H₂O₂ festzustellen durch diese Gruppe von Krankheitserregern. Mithilfe der gen Skn-1 Codierung für einen Transkriptionsfaktor oxidativen Stress Reaktion, wird es gezeigt, dass dieses Modell wichtig ist für die Identifizierung von Host-Genen, die gegen Streptokokken-Infektion sind. Darüber hinaus wird gezeigt, dass Aktivierung der oxidativen Stress-Reaktion in Gegenwart dieser Erreger mit einem transgenen Reporter Wurm Stamm, in der SKN-1, grün fluoreszierendes Protein (GFP) verschmolzen wird überwacht werden kann. Diese Tests bieten die Möglichkeit, die oxidativen Stress-Reaktion auf H₂O₂ abgeleitet von einer biologischen Quelle im Gegensatz zu exogen studieren reaktiven Sauerstoff-Spezies (ROS) Quellen hinzugefügt.

Einleitung

Mitis Gruppe Streptokokken sind menschliche Kommensalen der oropharyngealen Hohlraum¹. Diese Organismen können jedoch diese Nische zu entkommen und eine Vielzahl von invasiven Erkrankungen²verursachen. Infektionen durch diese Mikroorganismen gehören Bakteriämie, Endokarditis und Orbitaphlegmone^2,3,4,5,6. Darüber hinaus entstehen sie als Erreger von Infektionen der Blutbahn in immungeschwächten, neutropenisch und Krebspatienten, die Chemotherapie

Protokoll

1. Vorbereitung von deinem Agarplatten (Todd Hewitt Hefeextrakt)

1. Fügen Sie für 1 L Medien 30 g Todd Hewitt Pulver, 2 g Hefeextrakt und 20 g Agar, ein 2 L-Erlenmeyerkolben hinzu. Der Inhalt des Kolbens 970 mL entionisiertem Wasser hinzu und bestehen aus einer Stir Bar. Autoklaven der Medien bei einer Temperatur von 121 ° C und Druck von 15 lb/Inch² für 30 min. Danach legen Sie die Medien auf einem Teller rühren und zur Kühlung mit schonenden rühren lassen.
2. Gießen Sie die Medien entsprechend dimensionierte sterile Petrischalen (100 x 15 mm Gerichte für Wachstum und Erhalt von Bakterien, 35 x 10 mm Gerichte für das Töten von Assays) unter e....

Ergebnisse

Mitglieder der der Mitis Gruppe S. Mitis, S. Oralis und S. Gordonii schnell getötet, die Würmer, im Gegensatz zu S. Mutans, S. Salivarius und nicht-pathogenen E. Coli OP50(Abbildung 3). Die mediane Überlebenszeit für S. Mitis, S. Oralis und S. Gordonii betrug 300 min., 300 min. bzw. 345 min.. Um festzustellen, ob die Tötung durch H₂O₂vermitt.......

Diskussion

Die beschriebenen Methoden können verwendet werden, für andere pathogenen Bakterien wie Enterococcus Faecium, produziert auch H₂O₂ unter anaeroben angebaut oder mikroaerophil Bedingungen²⁶. In der Regel für die meisten pathogenen Organismen dauert es mehrere Tage bis Wochen dauern die Überlebens-Assays. Jedoch konnte aufgrund der robusten Produktion von H₂O₂ von den Mitgliedern des Arbeitskreises Mitis, diese Tests innerhalb von 5-6 h unter den .......

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Medien und Chemie
Agarose	Sigma Aldrich	A9539-50G
Bacto Pepton	Fisher Scientific	DF0118-17-0
BD Bacto Todd Hewitt Bouillon	Fisher Scientific	DF0492-17-6
BD BBL Schafsblut, defibriniert	Fisher Scientific	B11947
BD Difco Agar	Fisher Scientific	DF0145-17-0
BD Difco LB Bouillon	Fisher Scientific	DF0446-17-3
Blutagar (TSA mit Schafsblut)	Fisher Scientific	R01200
Calciumchlorid	Fisher Scientific	BP510-500
Carbenicillin	Fisher Scientific	BP26481
Katalase	Sigma Aldrich	C1345-1G
Cholesterin	Fisher Scientific	ICN10138201
IPTG	Fisher Scientific	MP21021012
Magnesiumsulfat	Fisher Scientific	BP213-1
Nystatin	Acros organische Stoffe	AC455500050
Kaliumphosphat Dibasisch	Fisher Scientific	BP363-500
Kaliumphosphat monobasisch	Fisher Scientific	BP362-500
Natriumazid	Sigma Aldrich	S2002-25G
Natriumchlorid	Fisher Scientific	BP358-1
Natriumhydroxid	Fisher Scientific	SS266-1
8,25% Natriumhypochlorit
Natriumphosphat zweibasisch	Fisher Scientific	BP332-500
Streptomycinsulfat	Fisher Scientific	BP910-50
Tetracyclin	Sigma Aldrich	87128-25G
(−)-Tetramisolhydrochlorid	Sigma Aldrich	L9756
Hefeextrakt	Fisher Scientific	BP1422-500
Verbrauchsmaterialien
15 ml konische sterile Zentrifugenröhrchen aus Polypropylen	Fisher Scientific	12-565-269
Serologische Einwegpipetten aus Polystyrol 10	mL Fisher Scientific	07-200-574
Serologische Einwegpipetten aus Polystyrol 25 mL	Fisher Scientific	07-200-575
Falcon Bakteriologische Petrischalen mit Deckel (35 mm x 10 mm)	Fisher Scientific	08-757-100A
Nr. 1,5  18 mm x 18 mm Abdeckung	Slips Fisher Scientific	12-541A
Petrischalen mit durchsichtigem Deckel (60 mm x 15 mm)	Fisher Scientific	FB0875713A
Petrischalen mit durchsichtigem Deckel (100 mm x 15 mm)	Fisher Scientific	FB0875712
Mikroskopische Objektträger aus Glas (75 mm x 25 mm)	Fisher Scientific	12-544-4
Software
Prism	Graphpad
Bakterielle Stämme
S. oralis ATCC 35037
S. mitis ATCC 49456
S. gordonii DL1 Challis
E. coli OP50
E. coli HT115
Wurmstämme<
strong>Stamm	Genotyp	Transgene	Source
N2	C. elegans Wildisolat		CGC
EU1	skn-1(zu67) IV/nT1 [unc-?( n754) letz-?] (IV;V)		CGC
LD002	IdIs1	SKN-1B/C::GFP + rol-6(su1006)	Keith Blackwell