Post-Differenzierung Replating von Human Pluripotent Stem Cell abgeleiteten Neuronen für High-Content Screening von Neuritogenese und Synapse Reifung

Summary

Dieses Protokoll beschreibt ein detailliertes Verfahren zur Aussetzung und Kultivierung von neuronen menschlichen Stammzellen, die zuvor mehrere Wochen lang von neuronalen Vorläufern in vitro unterschieden wurden. Das Verfahren erleichtert bildgebende Assays von Neuriten, Synapsen und spät exemitten neuronalen Markern in einem Format, das mit Lichtmikroskopie und High-Content-Screening kompatibel ist.

Abstract

Neuronen, die in der zweidimensionalen Kultur von menschlichen pluripotenten Stammzellen-abgeleiteten neuronalen Vorläuferzellen (NPCs) unterschieden werden, stellen ein leistungsfähiges Modellsystem dar, um Krankheitsmechanismen zu erforschen und ein hochgehaltiges Screening (HCS) durchzuführen, um Verbindungen zu verhören. oder Genmutationsphänotypen zu identifizieren. Bei menschlichen Zellen dauert der Übergang vom NPC zum funktionellen, reifen Neuron jedoch mehrere Wochen. Synapsen beginnen sich in der Regel nach 3 Wochen Differenzierung in der Monolayer-Kultur zu bilden, und mehrere neuronspezifische Proteine, z. B. der später exprimierende panneuronale Marker NeuN, oder die Schicht 5/6 zerebralen kortikalen Neuronenmarker CTIP2, beginnen auszudrücken ca. 4-5 Wochen nach der Differenzierung. Diese lange Differenzierungszeit kann mit optimalen Kulturbedingungen für kleine, multi-well-HCS-Plattformen nicht kompatibel sein. Zu den vielen Herausforderungen gehören die Notwendigkeit gut haftender, gleichmäßig verteilter Zellen mit minimalem Zellclustering und Kulturverfahren, die die langfristige Lebensfähigkeit und die funktionelle Synapsenreifung fördern. Ein Ansatz besteht darin, Neuronen in einem großen Volumenformat zu differenzieren und sie dann zu einem späteren Zeitpunkt in HCS-kompatiblen Multi-Wells neu zu zeichnen. Einige der Hauptherausforderungen bei der Verwendung dieses Replating-Ansatzes betreffen die Reproduzierbarkeit und Zelllebensfähigkeit aufgrund der belastenden Störung des dendritischen und axonalen Netzwerks. Hier zeigen wir ein detailliertes und zuverlässiges Verfahren zur enzymatischen Suspendierung von humaninduzierten pluripotenten Stammzell (hiPSC)-abgeleiteten Neuronen nach ihrer Differenzierung für 4-8 Wochen in einem großvolumigen Format und übertragen sie auf 384-Well-Mikrotiter und kultivieren sie für weitere 1-3 Wochen mit ausgezeichnetem Zellüberleben. Diese Replatierung menschlicher Neuronen ermöglicht nicht nur die Untersuchung der Synapsenmontage und Reifung innerhalb von zwei Wochen nach der Replatierung, sondern ermöglicht auch Studien zur Neuritregeneration und Wachstumskegeleigenschaften. Wir liefern Beispiele für skalierbare Assays für Neuritogenese und Synaptogenese mit einer 384-Well-Plattform.

Introduction

Humane pluripotente Stammzell (hiPSC)-abgeleitete Neuronen sind zunehmend relevant in den Bereichen Grundlagenforschung, Arzneimittelentwicklung und regenerative Medizin. Workflows und Verfahren zur Optimierung ihrer Kultur und Wartung und zur Verbesserung der Effizienz der Differenzierung in bestimmte neuronale Subtypen entwickeln sich schnell^1,2. Um den Nutzen und die Kostenwirksamkeit menschlicher Stammzellen-abgeleiteter Neuronen als Modellsysteme zu verbessern, die für hochklassige Analysen in der Arzneimittelentdeckung und Zielvalidierung geeignet sind, ist es sinnvoll, die Kultivierungszeit zu verringern, die erforderlich ist, um ausgereifte, funktionelle Unter Beibehaltung maximaler Robustheit, Reproduzierbarkeit und Phänotyprelevanz. Obwohl dreidimensionale organoide Kulturen den Durchbruch inder Neuroentwicklungsforschung vorantreiben 3, sind 2-dimensionale Monolayer-Kulturen aufgrund ihrer minimalen Gewebedicke besonders kompatibel mit automatisierten bildgebenden Anwendungen.

Die Anpassung bildgebender Screening-Methoden an Modelle menschlicher neurologischer und neuroentwicklungsbasierter Erkrankungen steht jedoch vor einer großen Herausforderung. Der lange Zeitrahmen, über den das menschliche Nervensystem in vivo reift, erfordert eine längere Zeit in der Kultur, um natürliche Programme der Genexpression aufzunehmen und eine neuronale Reifung zu erreichen.

Eine praktische Folge des langwierigen neuronalen Differenzierungsprogramms ist, dass die Aufrechterhaltung von hiPSC-abgeleiteten Monolayer-Kulturen für viele Wochen aufrechterhalten werden muss, um eine angemessene Synapsenreife zu erreichen. Während dieser Zeit, neuronale Vorläufer, die undifferenziert bleiben weiterhin zu teilen. Diese können schnell die Kultur überwuchern und den Nährstoffgehalt an sich reißen, der erforderlich ist, um lebensfähige postmitotische Neuronen aufrechtzuerhalten. Kräftig trennende neuronale Vorläuferzellen (NPCs) können auch mit Neuronen um das Wachstumssubstrat konkurrieren. Dies kann solche Kulturen Zufall von Problemen der schlechten Haftung machen, eine Bedingung, die für bildgebende Assays ungeeignet ist. Darüber hinaus stellen viele Forscher fest, dass je kleiner das Kulturvolumen, desto größer die Schwierigkeit bei der Aufrechterhaltung gesunder Populationen von differenzierten Neuronen lange genug, um die späten Stadien der neuronalen Differenzierung zu beobachten. Mit anderen Worten, Assays der Synapsenreifung mit HIGH-Content-Screening -Ansätzen (HCS) können für vom Menschen abgeleitete Neuronen eine große Herausforderung darstellen.

Um einige dieser Probleme zu umgehen, wurde ein Verfahren zum Resuspendieren und Replatieren von zuvor differenzierten hiPSC-abgeleiteten Neuronen verwendet. Erstens ermöglicht es die Untersuchung des Neuritenwachstums (oder genauer gesagt der Neuritenregeneration) in einer Population voll engagierter Neuronen. Zweitens ermöglicht die Replatierung von zuvor differenzierten Neuronen von einem großvolumigen Format (z. B. 10 cm Platten oder größer) bis hin zu kleinen Volumenformaten (wie HCS-kompatible 96- oder 384-Well-Mikrotiterplatten) eine signifikante Reduzierung der Gesamtkultivierungszeit in die kleine Lautstärkebedingung. Dies erleichtert die Untersuchung der Synapsenmontage und Reifung in den folgenden Wochen in vitro.

Die Wiederherstellung von ausgereiften Neuronen, die bereits lange Neuriten und ein komplexes Konnektivitätsnetzwerk etabliert haben, stellt jedoch mehrere Herausforderungen dar, von denen eine die manchmal hohe und variable Rate des Zelltodes ist. Hier beschreiben wir ein Replating-Verfahren, das zu einem ausgezeichneten Zellüberleben und Reproduzierbarkeit führt. Üblicherweise sind Neuronen proteolytischen Enzymen für kurze Inkubationsperioden (in der Regel 3-10 min) ausgesetzt, um Zellen vor der Trituration vom Substrat zu lösen. Diese kurze Proteolysezeit wird üblicherweise für das Resuspendieren und Passieren vieler Arten von teilenden Zellen verwendet, einschließlich nicht-neuronaler Zellen und undifferenzierter Vorläufer^4,5,6. Für differenzierte Neuronen mit langen, miteinander verbundenen Neuriten ist es jedoch wichtig, nicht nur Zellen vom Substrat zu lösen, sondern auch das dendritische und axonale Netzwerk zu stören, um einzelne Zellen zu isolieren und gleichzeitig Schäden zu minimieren. Tatsächlich neigt ein dickes Netz von Neuronen in der Regel dazu, sich als einzelnes Blatt vom Substrat zu lösen, anstatt als einzelne Zellen. Wenn nicht darauf geachtet wird, das dicke Netz von Neuriten zu lösen, werden Neuronen nicht nur während der Trituration irreversibel geschädigt, sondern viele von ihnen passieren nicht den Filter, der verwendet wird, um Klumpen zu entfernen, was zu einer schlechten Zellausbeute führt. Im Folgenden beschreiben wir eine einfache Änderung an einem weit verbreiteten Protease-Inkubationsverfahren, um diesen Schwierigkeiten entgegenzuwirken.

In dem unten beschriebenen Protokoll werden Neuronen für 40-45 min mit einer milden Protease, wie dem proteolytischen Enzym (z. B. Accutase), inkubiert. Während der ersten 5-10 min nach Zugabe des Enzyms hebt sich das neuronale Netzwerk als Blatt vom Substrat ab. Die Inkubation mit der Protease erfolgt für weitere 30-40 min, bevor es mit sanfter Triturierung und Filterung geht. Diese zusätzliche Inkubationszeit trägt dazu bei, dass die Verdauung des Materials das interzelluläre Netzwerk entspannt und somit sicherstellt, dass die nachfolgende Trituration zu einer Suspension einzelner Zellen führt. Dieses Verfahren maximiert die Gleichmäßigkeit der Zellverteilung beim Replatieren bei gleichzeitiger Minimierung des Zelltodes. Wir haben diese Replating-Methode erfolgreich auf hiPSC-abgeleitete neuronale Kulturen angewendet, die durch verschiedene Differenzierungsprotokolle^7,8 und aus verschiedenen Zeilen von hiPSCs erzeugt werden. Das Verfahren ist nominell für die Verwendung mit den meisten oder allen Linien von Stammzell-abgeleiteten Neuronen geeignet. Wir haben festgestellt, dass eine verlängerte Protease-Inkubationszeit für die Replatierung von Kulturen aus Kleinformatplatten (z. B. 35 mm Durchmesser) nicht unbedingt erforderlich ist; Wie wir hier zeigen, bietet es jedoch einen erheblichen Vorteil bei der Replatierung von Platten mit großem Durchmesser (z.B. 10 cm Durchmesser oder größer), wahrscheinlich weil Neuriten in solchen Platten sehr lange Prozesse ausdehnen und ein dicht miteinander verbundenes Array bilden können.

Hier zeigen wir diese Methode und veranschaulichen kurz ihre Anwendung in Assays für die frühe Neuritogenese und für die Synapsenreifung, die das Clustern von prä- und postsynaptischen Proteinen entlang der Dendriten und Axone beinhaltet, gefolgt von deren späteren Kolokalisierung an synaptischen Standorten. Die Beispiele zeigen die Vorteile dieses Protokolls bei der Erhaltung der Zelllebensfähigkeit und Reproduzierbarkeit. Erstens erlaubt es den Forschern, frühe Schritte in der menschlichen Neuritogenese zu untersuchen. Die experimentelle Umgebung ähnelt den häufig verwendeten Primärkulturen von Nagetierkortikal- oder Hippocampus-Neuronen, bei denen Zellen aus dem späten fetalen oder frühen postnatalen Gehirn extrahiert, durch Trituration nach sanfter Proteasebehandlung dissoziiert und erlaubt werden, Neuriten initiieren oder Neuriten regenerieren, die im Verfahren^9,10abgetrennt wurden. Ähnlich wie solche Nagetier-Primärneuronen beginnen hiPSC-abgeleitete Neuronen ihre Neuriten innerhalb von Stunden nach der Replatierung zu bilden oder zu regenerieren, was die Abbildung von Wachstumskegeln und Neuritenmorphologie in einer Umgebung ermöglicht, die für eine hohe raumzeitliche Bildgebung mit weniger umsiebende undifferenzierte Zellen. Wir haben beobachtet, dass das Neuritenwachstum im Vergleich zu den variablen Verzögerungen und unterschiedlichen Auswuchsraten, die beobachtet werden, wenn Neuronen zum ersten Mal beginnen, sich von einer Vorläuferpopulation zu unterscheiden, stärker synchronisiert ist. Darüber hinaus ermöglicht die Replatierung Assays von Neuronen, die neuronale Subtypmarker exemiten, die typischerweise später in der neuronalen Entwicklung auftreten, wie z. B. der kortikale Schicht 5/6 Transkriptionsfaktor CTIP2 (Chicken ovalbumin upstream promoter transcription Faktor-interagierendes Protein 2) oder den pan-neuronalen Marker NeuN¹¹. Ein besonders nützliches Merkmal des Replating-Ansatzes ist, dass die Synaptogenese innerhalb eines mit HCS kompatiblen Zeitrahmens verläuft.

Protocol

1. Differenzierungszeitraum vor dem Replatieren

1. Unterscheiden Sie Neuronen auf 10 cm Geschirr, mit einem Protokoll der Wahl^7,8 bis Neuronen haben ein dickes Netzwerk mit ihren Prozessen gebildet und drücken Nicht nur frühe neuronale Marker wie MAP2 oder TuJ1, sondern auch späte Marker wie NeuN.
2. Ändern Sie die Hälfte des Mediums der Wahl alle 4 Tage während des neuronalen Differenzierungsprozesses.
   HINWEIS: Umfangreichere oder häufige mittlere Veränderungen verdünnen wesentliche trophische Faktoren und könnten die Reifung begünstigen.
   1. Für die iPSC-abgeleiteten WT126-Neuronen verwenden Sie die folgenden Kultivierungsmedien nach der Differenzierung: 5 ml 100x N2-Ergänzung, 10 ng/mL BDNF, 10 ng/mL GDNF, 1 g/mL-Laminin, 200 M Ascorbinsäure, 1 M Dibutyryl-cAMP und 10 ml SM1 für 500 mL Dulbeccos modifiziertes Eagle-Medium/ Nährstoffgemisch F-12 (DMEM/F12). Allmählich, mit Halb-Medien-Änderungen, ersetzen mit neuronalen basalen Medium (Tabelle der Materialien) und die gleichen Ergänzungen.
   2. Verwenden Sie für die iPSC-abgeleiteten CVB-WT-Neuronen das folgende nach-Differenzierungs-Kultivierungsmedium: 500 ml neuronales Basal-A-Medium (Materialtabelle) und 500 ml DMEM/F12-Medium mit 2 g/ml Laminin, 10 ml Glutamin-Ergänzung (Materialtabelle), 0,75 mg/ml Natriumbicarbonat, 5 ml mL minimum essential medium (MEM) nonessential aminosäures, 0.2 mM Ascorbinsäure, 10 ng/mL BDNF, 20 mL 50x B27 und 10 mL 100x N2 Supplement.

2. Beschichtung Multiwells

1. Am Tag vor dem Replatieren mit Poly-L-Ornithin (PLO) beschichten. Plo in sterilem Wasser auflösen, um eine Stammlösung (10 mg/ml) herzustellen. Bewahren Sie diesen Bestand bei -20 °C auf. PLO 1:100 in Wasser verdünnen, um eine Konzentration von 50 g/ml beim Beschichten von Glas und 1:1.000 Verhältnis (10 g/ml) beim Beschichten von Kunststoff zu ergeben.
2. Tragen Sie die Beschichtung direkt auf die Zielplatten auf. Verwenden Sie das der Plattengröße entsprechende Beschichtungsvolumen (d. h. für eine 24-Well-Platte 500 l PLO-Lösung pro Bohrung auftragen).
3. Teller über Nacht bei Raumtemperatur im Dunkeln sitzen lassen.
4. Holen Sie beschichtete Platten am Tag der Replatierung ab und übertragen Sie sie in einen sterilen Biosicherheitsschrank.
5. Die PLO-Lösung ansaugen und zweimal mit sterilem Wasser abspülen.
6. Laminin (1,15 mg/ml) in phosphatgepufferter Kochsaline (PBS) bei 1:400 Verdünnung verdünnen.
   HINWEIS: Laschin bei 4 °C auftauen und schnell zu PBS hinzufügen, um eine Aggregation von Laminin und ungleichmäßiger Beschichtung zu vermeiden.
7. Steriles Wasser ansaugen und 500 l Lamininbeschichtung auf Brunnen auftragen, die zuvor mit PLO beschichtet waren.
8. Platten in einen 37 °C-Inkubator für mindestens 4-6 h legen. Verwenden Sie längere Inkubationen, bis zu 16 h, für Glasoberflächen. Verwenden Sie konsistente Inkubationszeiten.

3. Replating Differentiated Neurons

1. Spülen Sie die Platte von differenzierten Neuronen mit PBS einmal sanft. Verteilen Sie PBS sanft an der Wand der Platte und nicht direkt auf die Zellen, um sie nicht zu stören.
2. Beruhigen Sie PBS vorsichtig, achten Sie darauf, die Zellen nicht direkt zu berühren, aber vom Rand der Schale zu aspirieren, während Sie sie in Richtung des Forschers kippen.
3. Tragen Sie mindestens 1 ml des proteolytischen Enzyms (Materialtabelle) pro 10 cm Platte auf und geben Sie Zellen in den Inkubator zurück. Fügen Sie etwas höhere Volumina hinzu, wenn der Gewebekulturraum aufgrund der geringen Luftfeuchtigkeit eine hohe Verdunstungsrate aufweist.
4. Inkubieren Sie Zellen mit proteolytischem Enzym für 40-45 min, um sie von der Platte zu lösen und sie von anderen Neuronen innerhalb des neuronalen Netzwerks zu lösen.
   HINWEIS: Das Timing dieses Schritts ist entscheidend. Eine zu frühe Sautierung der Protease kann zu einem erhöhten Zelltod nach dem Replatieren führen. Der herstellerfreundliche Enzymhersteller empfiehlt, Temperaturen von weit unter 37 °C mit längeren Inkubationszeiten für passaging Zelllinien (z. B. über Nacht bei 4 °C) zu verwenden. Der Umgang mit Neuronen bei 4 °C sollte jedoch vermieden werden, da sie oft ein schlechtes Überleben nach Einer Erkältung aufweisen. Der Hersteller stellt auch fest, dass eine 60 min Inkubation mit dem Enzym bei 37 °C zu seiner enzymatischen Inaktivierung führt. Nach der Erfahrung der Autoren reicht jedoch eine 40-45 min Inkubation von hiPSC-abgeleiteten neuronalen Kulturen bei 37 °C für eine effiziente Dissoziation und ein ausgezeichnetes neuronales Überleben beim Replatieren aus.
5. Überprüfen Sie die Neuronen während der Inkubationszeit auf einem Phasenkontrastmikroskop und lassen Sie die Proteasebehandlung so lange fortsetzen, bis sich das neuronale Netzwerk vollständig von der Platte löst und beginnt, in kleineren Blättern auseinanderzubrechen, wenn die Platte unter der mikroskop.
6. Quench die Protease-Aktivität mit 5 ml frischem DMEM-Medium pro 1 ml Protease in der 10 cm Platte, um die Verdauung zu stoppen. Sanft trituieren Zellen gegen Platte 5-8 mal, um das Netzwerk zu stören, mit serologischen Pipetten. Achten Sie darauf, nicht zu viel Druck beim Trituieren anzuwenden, da differenzierte Neuronen zerbrechlich sind. Verwenden Sie keine P1000-Spitze, da das Ende zu scharf und schmal ist und somit die Neuronen verkleinern oder beschädigen kann.
7. Die Lösung mit Zellen durch ein Zellsieb mit einem Netz mit einem Durchmesser von 100 m in ein frisches 50 ml konisches Rohr Tropfen für Tropfen auftragen.
8. Spülen Siebich mit zusätzlichen 5 ml frischem DMEM-Medium, nachdem Zellen durchgefiltert wurden.
9. Spinzellen in Tischzentrifuge bei 1.000 x g für 5 min.
10. Kehren Sie konische Rohre in den Biosicherheitsschrank zurück und aspirieren Sie die meisten Medien, sodass sie etwa 250 l übrig lassen, um sicherzustellen, dass die Zellen Feuchtigkeit zurückhalten.
11. Zellen in 2 ml frischer DMEM-Medien sanft aussetzen. Pipette das Pellet nicht gegen die Seite des Rohres. Stattdessen, sanft invertieren konische 2-3 mal und passieren Zellen durch das Ende einer 5 ml serologischen Pipette, um sie zu vertreiben.
12. Tragen Sie 10 L resuspendierte Neuronen auf den Rand eines Hämozytometers auf.
13. Fügen Sie 8-10 L Trypanblau zu Tröpfchen von Zellen hinzu, um die Zelllebensfähigkeit während dieses Resuspensionsschritts zu bewerten. 10 L dieser Mischung auf das Hämozytometer oder andere automatische Zellzähler auftragen. Bewerten Sie als lebensfähig die Zellen, die phasenhell sind, und schließen Sie den Trypan-Blaufarbstoff aus.
14. Bestimmen Sie die Menge der lebensfähigen Zellen/ml und bereiten Sie sich darauf vor, den Inhalt des konischen Rohres entsprechend der gewünschten Zelldichte zu verdünnen.
15. Platte 10.000 Zellen pro Brunnen für eine 384-Well-Platte; Platte 150.000-200.000 Zellen pro Brunnen für eine 24-Well-Platte.
16. Fügen Sie dem konischen Rohr von resuspendierten Zellen frisches DMEM hinzu, um eine angemessene Verdünnung zu erreichen, und fügen Sie zusätzliche geeignete Ergänzungen wie B27 und/oder BDNF hinzu, je nach den Anforderungen der spezifischen Zelllinie.
17. Biegen Sie das konische Rohr vorsichtig um, um 2-3 Mal zu mischen.
18. Aspirieren Sie Lamininbeschichtung aus der 24-Well-Platte oder aus der 384-Well-Multiwell-Platte mit einer 16-Kanal-Pipette und spülen Sie einmal mit PBS.
19. Aspirieren Sie PBS mit einer P1000 für die 24-Well-Platte oder der 16-Kanal-Pipette für 384-Well-Platten.
20. Tragen Sie die Zelllösung auf jeden Brunnen in einer Bewegung der Abbildung acht auf, um Verklumpungen zu vermeiden. Die Gleichmäßigkeit der Beschichtung kann auch durch den Einsatz automatisierter Flüssigkeitshandhabungsgeräte optimiert werden.
    HINWEIS: Die Zugabe von Laminin zu den Medien ab 2-4 Tagen Nach-Replating hilft auch, eine homogene Verteilung der Zellen aufrechtzuerhalten.
21. Wiederholen Sie die Schritte 3.19 und 3.20 für jeden Brunnen.
22. Geben Sie die Platte auf 37 °C und5% CO2 an den Inkubator zurück.
23. Nach 2 Tagen beginnen Sie, alle 4 Tage die Hälfte des Mediums zu wechseln, indem Sie die in Abschnitt 1.2 beschriebenen Post-Differenzierungsmedien verwenden. Fixieren Sie nach der gewünschten Reifungszeit Kulturen mit 3,7% Formaldehyd bei 37 °C und Färben von Zellen entsprechend den experimentellen Anforderungen.

4. Cell Viability Assays Post-Replating

1. Fügen Sie den frühen Zelltod-Reporter (VivaFix: 0,5 l der 50-L-Lagerlösung pro 500 L-Kulturmedium pro Brunnen) nach einer kurzen Wirbelung der Stammlösung hinzu.
2. Stellen Sie sich die lebenden und abgestorbenen Zellen auf Glasboden-Multiwells nach 20 min ohne Waschschritt vor, da der Farbstoff nur einmal in den Zellen fluoresziert, oder fixieren und ko-stainieren Sie mit 4', 6-Diamidino-2-Phenylindole (DAPI) und/oder anderen Antikörpern vor der Bildgebung mit einem konfokalen Mikroskop.

5. Immunostaining

1. Fixkulturen mit 3,7% Formaldehyd in PBS plus 120 mM Saccharose für 20 min bei 37 °C.
2. Spülen und permeabilisieren mit 0,2% Triton X-100 für 5 min bei Raumtemperatur, und dann für 30 min mit 2% RinderserumAlbumin (BSA) blockieren.
3. Aspirieren Sie den BSA ohne Spülen und inbrüten für 1 h bei Raumtemperatur mit Kaninchen Anti-MAP2 Antikörper 1:1.000, Maus Anti-3 Tubulin (TuJ1) Antikörper 1:2.000, Huhn Anti-NeuN Antikörper (1:100) und Rattenanti-CTIP2 Antikörper (1:500), oder mit Maus-Antikörper PSD95 ( 1:200), Kaninchen Anti-Synapsin 1 (1:200) und Huhn Anti-MAP2 Antikörper für synaptische Färbung.
4. Mit PBS abspülen und mit Alexa Fluorkonjugierten Sekundärantikörpern plus DAPI 45 min bei 37 °C inkubieren.
5. Schließlich zweimal mit PBS waschen, bevor Sie bildgebungsbilden.

6. Calcium-Bildgebung

1. Infizieren Sie kultivierte Zellen mit AAV8-syn-jGCAMP7f-WPRE (The Salk Institute for Biological Studies, GT3 Core Facility) an 10 Tagen nach der Replatierung und Bild, um spontane Kalziumtransienten bei 3-4 Wochen Nach-Replating zu bewerten.

7. Bildaufnahme und -analyse

HINWEIS: Details zum Akquisitionssystem finden Sie unter Calabrese et al.¹².

1. Verwenden Sie ein Imaging-Modul für die manuelle oder automatisierte Bildaufnahme und ein Bildanalyse-Softwaremodul, z. B. CellProfiler¹³, für morphometrische Messungen.
2. Berechnen Sie die durchschnittliche Länge der TuJ1-positiven Neuriten und MAP2-positiven Dendriten, indem Sie die Gesamtlänge pro Sichtfeld dividiert durch die Anzahl der Neuronen (DAPI + MAP2 oder TuJ1-positive Zellen) innerhalb desselben Feldes messen.

Results

Die Replatierung von hiPSCs-abgeleiteten Neuronen, die seit mehreren Wochen differenziert wurden, bietet mehrere Vorteile. Das Lösen und Replatieren differenzierter Neuronen, die lange, miteinander verbundene Dendriten und Axone haben (Abbildung 1A) kann jedoch zu einem hohen Anteil irreversibel geschädigter Neuronen führen.

Wie im Protokollabschnitt beschrieben, verwendeten wir die Inkubation mit einem proteolytischen Enzym, um die Neuronen vom S...

Discussion

Wir haben ein geradliniges Verfahren zur Resuspension und Replatierung menschlicher neuronaler Kulturen demonstriert, das die Lebensfähigkeit, den Differenzierungserfolg und die subzelluläre Bildgebung in einer Weise optimiert, die mit Screening-Plattformen mit hohem Inhalt kompatibel ist. und andere Assays, die für die Entdeckung von Arzneimitteln relevant sind. Abbildung 6 zeigt den gesamten Workflow und Beispiele für solche Anwendungen.

Obwohl wir uns hier auf ...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Post Replating media
L-Ascorbinsäure	Sigma	A4403	1 mL 200 mM Material zu 1 l N2B27 Medium hinzufügen
Dibutyryl-cAMP	Sigma	D0627	1 & micro; M
Human BDNF	Peprotech	450-02	10 ng/ml Endkonzentration
B27 (50x)	Thermofisher	Scientific 17504044	20 mL auf 1 l N2B27 Medium
DMEM/F12 mit Glutamax	Thermofisher Scientific	31331093	N2 zugeben und in 50 mL konischen Dosen verteilen; Parafilm-Wrap-Deckel
Human GDNF	Peprotech	450-10	10 ng/mL Endkonzentration
Glutamax	Thermofisher	Scientific 35050038	10 ml zu 1 L N2B27 Medium hinzufügen; Glutamin Supplement
Maus Laminin	Sigma	P3655-10mg	100 & Mikro hinzufügen; L bis 50 mL N2B27
MEM Nicht-essentielle Aminosäuren	Thermofisher Scientific	11140035	5 mL zu 1 l N2B27 Medium hinzufügen
N2 (100x) Ergänzung	Life Technologies	17502048	5 mL Medium 5 mL bis 500 mL Medium
Neurobasal A Media	Thermofisher Scientific	10888022	Kombinieren Sie es mit DMEM/F12, um N2B27-Medien für CVB-Gew.-Zellen zu erzeugen; neuronale basale A-Medien
Neurobasale Medien	Thermofisher Scientific	21103049	für WT126-Zellen; neuronale Basalmedien
SM1 Supplement	StemCell Technologies	5711	1:50 zum Medium hinzufügen
Natriumbicarbonat	Thermofisher Scientific	25080-094	10 mL zu 1 l hinzufügen N2B27 media
Plattenvorbereitung
10 cm Gewebekulturschalen	Fisher Scientific	08772-E	TC-behandelte Kunststoffschalen
6-Well-Gewebekulturschalen	Thomas Scientific	1194Y80	NEST-Platten
Maus Laminin	Life Technologies	23017-015	1:400 auf Kunststoff
Poly-Ornithine	Sigma	P3655-10mg	1:1.000 auf Kunststoff hinzufügen
UltraPure Distilled Water	Life Technologies	10977-015	Verdünnen Poly-L-Ornithin
Replating Reagents
100 mM Cell Strainer	Corning	431752	Sterile, einzeln verpackte
384-Well-Platte, unbeschichtet	PerkinElmer	6007550	Coat mit PLO und Laminin
DPBS	Life Technologies	14190144	phosphatgepufferte Kochsalzlösung
von DulbeccoPoly-D-Lysin-Precoated 384-Well-Platten	PerkinElmer	6057500	Vor dem Beschichten mit Laminin
StemPro Accutase	Life Technologies	A1110501	1 mL/10 cm Platte für 30-45 min auftragen; proteolytisches Enzym
Fixation Materials
37% Formaldehyd	Fisher Scientific	F79-1	Gelöst in PBS
Saccharose	Fisher	Scientific S5-12	0,8 g pro 10 ml Fixiermittel
Immunfärbemittel
Alexa Fluor 488 Ziege Anti-Maus	Invitrogen	A-11001	Sekundärantikörper
Alexa Fluor 568 Ziege Anti-Hühner	Invitrogen	A-11041	Sekundärantikörper
Alexa Fluor 647 Ziege Anti-Hühner	Invitrogen	A-21449	Sekundärantikörper
Alexa Fluor 561 Ziege Anti-Ratte	Invitrogen	A-11077	Sekundärantikörper
DAPI	Biotium	40043	visualisiert DNA
Maus Antikörper gegen b3-Tubulin (TuJ-1)	Neuromics	MO15013	frühes Stadium neuronaler
Marker Ratte Antikörper gegen CTIP2	Abcam	ab18465	Schicht 5/6 kortikal Neuronen
Hühner-Antikörper gegen MAP2	LifeSpan Biosciences	LS-B290	neuronaler Marker im Frühstadium
Hühner-Antikörper gegen NeuN	Millipore	ABN91	neuronaler Marker im späten Stadium
Kaninchen-Antikörper gegen MAP2	Shelley Halpain	N/A	neuronaler Marker im Frühstadium
Maus-Antikörper gegen PSD-95	Sigma	P-246	postsynaptischer Marker
Kaninchen-Antikörper gegen Synapsin 1	Millipore	AB1543	präsynaptischer Marker
Rinderserumalbumin (BSA)	GE Healthcare Life Sciences	SH30574.02	10 % in PBS zur Blockierung
Titon X-100	Sigma	9002931	Verdünnung auf 0,2 % unter PBS zur Permeabilisierung
Viability Markers
Vivafix 649/660	Biorad	135-1118	Zelltodmarker
Calcium Imaging
Name des Reagenzes/	Geräteherstellers	Katalognummer	Kommentare/Beschreibung
AAV8-syn-jGCAMP7f-WPRE	THE SALK INSTITUTE, GT3 Core Facility	N/A	Calcium-Reporter in einem viralen Verabreichungssystem
hiPSC-abgeleitete NPCs
WT 126 (Y2610)	Gage lab	N/A	Marchetto et al., 2010
CVB WT24	Yeo and Goldstein labs	N/A	unveröffentlicht