Methodenartikel

Studie über den Stoffwechsel von sechs systemischen Insektiziden in einer neu etablierten Zellsuspensionskultur abgeleitet aus Tee (Camellia Sinensis L.) Blätter

DOI:

10.3791/59312

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15. Juni 2019

 ,  ,  ,  ,  , 
1State Key Laboratory of Tea Plant Biology and Utilization, School of Tea and Food Science & Technology, Anhui Province Key Lab of Analysis and Detection for Food Safety, 2School of Resource & Environment, Anhui Agricultural University, Key Laboratory of Agri-food Safety of Anhui Province

* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Diese Arbeit präsentiert ein Protokoll zur Etablierung einer Zellsuspensionskultur aus Tee (Camellia sinensis L.) Blätter, die verwendet werden können, um den Stoffwechsel von externen Verbindungen zu studieren, die von der ganzen Pflanze aufgenommen werden können, wie Insektizide.

Zusammenfassung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Es wurde eine Plattform zur Untersuchung des Insektizidstoffwechsels mit In-vitro-Geweben von Teepflanzen entwickelt. Blätter aus sterilen Teepflanzen wurden dazu induziert, lose Callus auf Murashige und Skoog (MS) Basalmedien mit den Pflanzenhormonen 2,4-Dichlorophenoxyessigsäure (2,4-D, 1,0 mg L-1) und Kinetin (KT, 0,1 mg L-1) zu bilden. Callus gebildet nach 3 oder 4 Runden Subkulierung, jede Dauer von 28 Tagen. Loser Callus (ca. 3 g) wurde dann in Flüssigmedien b5 geimpft, die die gleichen Pflanzenhormone enthielten, und in einem Schüttelinkubator (120 Umdrehungen pro Minute) im Dunkeln bei 25 °C bei 1 °C kultiviert. Nach 3-4 Subkulturen wurde eine aus DemTeeblatt gewonnene Zellsuspension in einem Subkulturverhältnis zwischen 1:1 und 1:2 (Suspensionsmutterflüssigkeit: frisches Medium) festgestellt. Auf dieser Plattform wurden sechs Insektizide (5 g ml-1 pro Thiamethoxam, Imidacloprid, Acetamiprid, Imidaclothiz, Dimethoat und Omethoat) in die von Teeblättern abgeleitete Zellsuspensionskultur aufgenommen. Der Stoffwechsel der Insektizide wurde mittels Flüssigchromatographie und Gaschromatographie verfolgt. Um die Nützlichkeit der Suspensionskultur der Teezellen zu validieren, wurden die Metaboliten von Thiamethoxan und Dimethoat in behandelten Zellkulturen und intakten Pflanzen mittels Massenspektrometrie verglichen. In behandelten Teezellkulturen wurden sieben Metaboliten von Thiamethoxan und zwei Metaboliten von Dimethoat gefunden, während in behandelten intakten Pflanzen nur zwei Metaboliten von Thiamethoxam und einer von Dimethoat gefunden wurden. Die Verwendung einer Zellsuspension vereinfachte die metabolische Analyse im Vergleich zur Verwendung intakter Teepflanzen, insbesondere für eine schwierige Matrix wie Tee.

Einleitung

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Tee ist eines der am häufigsten konsumierten alkoholfreien Getränke der Welt1,2. Tee wird aus den Blättern und Knospen der holzigen mehrjährigen Camellia sinensis L. Teepflanzen werden in riesigen Plantagen angebaut und sind anfällig für zahlreiche Insektenschädlinge3,4. Organophosphor und neonicotinoide Insektizide werden oft als systemische Insektizide5 verwendet, um Teepflanzen vor Schädlingen wie Weißfliegen, Blatttrichtern und einigen lepidopteranartenArten zuschützen 6,7. Nach der Anwendung werden diese Insektizide absorbiert oder in die Pflanze übertragen. Innerhalb der Pflanze können diese systemischen Insektizide durch Hydrolyse, Oxidation oder Reduktionsreaktionen durch Pflanzenenzyme transformiert werden. Diese Transformationsprodukte können polarer und weniger toxisch sein als die Ausgangsverbindungen. Bei einigen Organophosphaten sind die Bioaktivitäten einiger Produkte jedoch höher. Zum Beispiel wird Acephat in die giftigeren Methamidophos8,9, und Dimethoat in Omethoat10,11metabolisiert. Pflanzenstoffwechselstudien sind daher wichtig, um das Schicksal eines Pestizids innerhalb einer Pflanze zu bestimmen12.

Pflanzengewebekulturen haben sich als nützliche Plattform für die Untersuchung des Pestizidstoffwechsels erwiesen, mit den identifizierten Metaboliten ähnlich denen in intakten Pflanzengefunden 13,14,15. Die Verwendung von Gewebekulturen, insbesondere Zellsuspensionskulturen, hat mehrere Vorteile. Erstens können Experimente frei von Mikroorganismen durchgeführt werden, wodurch die Interferenz der Pestizidumwandlung oder des Abbaus durch Mikroben vermieden wird. Zweitens bietet die Gewebekultur jederzeit konsistente Materialien für den Einsatz. Drittens sind die Metaboliten leichter aus Gewebekulturen zu extrahieren als aus intakten Pflanzen, und Gewebekulturen haben oft weniger zwischenende Verbindungen und eine geringere Komplexität von Verbindungen. Schließlich können Gewebekulturen leichter verwendet werden, um eine Reihe von Pestizidstoffwechsel in einem einzigen Experiment16zu vergleichen 16 .

In dieser Studie wurde eine Zellsuspension, die aus den Blättern steril angebauter Teepflanzelet gewonnen wurde, erfolgreich etabliert. Die Teezellensuspensionskultur wurde dann verwendet, um das Ableitungsverhalten von sechs systemischen Insektiziden zu vergleichen.

Dieses detaillierte Protokoll soll einige Anleitungen bieten, so dass Forscher eine Pflanzengewebekultur-Plattform einrichten können, die nützlich ist, um das metabolische Schicksal von Xenobiotika im Tee zu untersuchen.

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Protokoll

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1. Tee-Callus-Kultur

HINWEIS: Sterile Blätter wurden aus in vitro angebauten Plantletlinien gewonnen, die zuerst in der Forschungsgruppe17entwickelt wurden. Alle Eingriffe bis Abschnitt 5 wurden in einer sterilen laminaren Durchflusshaube durchgeführt, mit Ausnahme der Kulturzeit in einem Inkubator.

  1. Stellen Sie den pH-Wert der beiden Medien (Murashige und Skoog [MS] Basalmedium und Gamborgs flüssiges Medium B5) vor dem Autoklavieren auf 5,8 ein (121 °C, 20 min).
  2. Mit einer Schere entlang der mittleren Vene eines sterilen Blattes schneiden und dann jede Hälfte in kleine Stücke von etwa 0,3 cm x 0,3 cm in einer Petrischale unterteilen.
  3. Legen Sie die sterilen Explants (die kleinen Blattstücke) auf MS-Basalmedien, die die Pflanzenhormone 2,4-D (1,0 mg L-1) und KT (0,1 mg L-1) enthalten. Sechs Explanten können in einen 300 ml-Kolben mit 100 ml MS-Basalmedien gelegt werden.
  4. Kultur die oben genannten Blatt explantiert bei einer konstanten Temperatur von 25 °C im Dunkeln. Nach 28 Tagen wählen Sie die erste Generation des induzierten Callus und übertragen Sie auf frischen Kolben (eine Subkultur). Erwerben Sie den lockeren und friablen Callus nach 3-4 Subkulturen.

2. Teezellensuspensionskultur

  1. Schneiden Sie die kräftigen, zerbrechlichen und lockeren Callusen aus dem festen Medium mit einer sterilen Klinge unter sterilen Bedingungen in kleine Stücke (Bereich hier 0,5 x 2 mm).
  2. Wiegen Sie ca. 3 g der kleinen Stücke von Callus. Legen Sie den Callus in einen 150 ml Kolben mit 20 ml Flüssigmedien B5, ergänzt durch 2,4-D (1,0 mg L-1) und KT (0,1 mg L-1).
  3. Die Flüssigzellsuspension bei konstanter Temperatur (25 x 1 °C) in einem Schüttelinkubator bei 120 Umdrehungen pro Minute im Dunkeln anseln.
  4. Nach 7 bis 10 Tagen Kultivierung die Kulturkolben entfernen und für ein paar Minuten stehen lassen.
  5. Nehmen Sie alle Überstand als Ausgangsmaterial für Subkultur zu frischem Medium (SubkulturVerhältnis von Suspension Mutterflüssigkeit zu frischen mittleren Bereich zwischen 1:1 und 1:2). Entfernen Sie die gefällten, großen Calluses.
  6. Erhalten Sie die letzte gut gewachsene Zellsuspensionskultur nach 3-4 Subkulturzyklen von jeweils 28 Tagen.

3. Triphenyltetrazoliumchlorid-Assay der Zelllebensfähigkeit

  1. Töten Sie eine Probe von lebenden Zellen bei 100 °C für 10 min als Kontrollzelle, bevor die Lebensfähigkeit färbung.
  2. Zentrifuge alle Zellsuspensionskultur für 8 min bei 6000 x g. Entfernen Sie den Überstand, bevor Sie die Zellen in 2,5 ml Phosphat-gepufferter Saline(PBS) Puffer (pH 7.3) aussetzen, und schütteln Sie ihn 1 min von Hand.
  3. 2,5 ml der 0,4%Triphenyltetrazoliumchlorid (TTC)-Lösung hinzufügen und wieder von Hand schütteln.
  4. Inkubieren Sie die Mischung für 1 h in einem stehenden Inkubator (30 °C).

4. Behandlung und Probenahme von Teezellensuspensionskulturen mit Insektiziden

  1. Fügen Sie den Zellsuspensionskulturen ein Aliquot von 400 l filtersterilisierter Stofflösung (500 g ml-1) von vier Neonicotinoiden (Thiamethoxam, Acetamiprid, Imidacloprid und Imidaclothiz) oder zwei Organophosphate (Dimethoat und Omethoat) hinzu. in dieser reihenfolge.
    HINWEIS: Wenn das Ziel darin besteht, xenobiotische Verhaltensweisen zu vergleichen, verwenden Sie dieselbe Muttercharge von Zellsuspensionen, um die verschiedenen Verbindungen zu testen.
  2. Die Proben von Zellsuspensionen mit Insektiziden bei konstanter Temperatur (25 x 1 °C) und Schüttelinkubatorgeschwindigkeit (120 Rpm) kulturieren. Nehmen Sie die Proben (siehe Schritt 4.3 oder 4.4) an 0, 3, 5 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70 und 75 Tagen.
  3. Um eine Probe mit einem Neonicotinoid zu testen, entfernen Sie ein 1 ml Aliquot der homogenen Zellkultur, legen Sie es in ein 1,5 ml Kunststoffzentrifugenrohr und Zentrifuge bei 4000 x g für 2 min.
    1. Übergeben Sie die Überstände vor der Analyse durch eine 0,22-m Poren-Filtermembran durch Hochleistungsflüssigkeitschromatographie-Ultraviolett (HPLC-UV) und Ultrahochleistungs-Flüssigkeitschromatographie-Quadrupol-Zeit-des-Fluges (UPLC-QTOF) Masse Spektrometrie (Materialtabelle).
  4. Um eine Probe zu testen, die ein Organophosphat enthält, entfernen Sie ein 500 L Aliquot der Zellkultur und legen Sie es in ein 35 ml Zentrifugenrohr oder ein 1,5 ml Kunststoffzentrifugenrohr (bereiten Sie die letztere Probe wie die von Neonicotinoid).
    1. 0,1 g Natriumchlorid und 5 ml Aceton/Ethylacetat (3:7, v/v) in das 35 ml Zentrifugenrohr der 500 l Proben geben.
    2. Wirbeln Sie die Mischungen für 1 min, und lassen Sie sie dann für 10 min ruhen.
    3. 2,5 ml des Überstandes in ein 10 ml Glasrohr geben und mit einem Stickstoffverdampfer bei 40 °C nahezu trocken verdampfen.
    4. Lösen Sie den Rückstand mit 1 ml Aceton, Wirbel für 1 min, durch eine 0,22-m-Filtermembran vor der Analyse durch Gaschromatographie-Flammen-Photometriedetektor (GC-FPD).

5. Probenvorbereitung intakter Teepflanze mit Insektiziden

ANMERKUNG: Die testte für intakte Teepflanzen wurde in einem hydroponischen System mit Teesämlingen durchgeführt, die in 50 ml einer Nährlösung (30 NH4+, 10 NO3-, 3.1 PO4-, 40 K+, 20 Ca2+, 25 Mg2+, 0.35 Fe2+, 0.1 B 3+, 1.0 Mn2+, 0.1 Zn2+, 0.025 Cu2+, 0.05 Mo+, und 10 Al3+, in mg L-1)18. Ein experimentelles Gewächshaus befand sich bei 20 °C an der Anhui Agricultural University in einem hellen und dunklen Zyklus (12 h Licht und 12 h Dunkelheit).

  1. Legen Sie fünf Pflanzen in einen 4 L Kunststofftopf für 15 Tage.
  2. 0 ppm (Steuerung) bzw. 100 ppm Thiamethoxam oder Dimethoat in Plastiktöpfe geben.
  3. Bereiten Sie die intakte Pflanzenprobe nach der vorherigen Methode vor, mit Ausnahme des Voreinweichens19, und analysieren Sie dann mit Massenspektrometrie auf ein genaues Massenspektrum.

6. Instrumentenanalyse

  1. HPLC-Analyse des Stoffwechselverhaltens von Neonicotinoiden
    1. Verwenden Sie ein HPLC-UV (Materialtabelle) , um den Inhalt und die Stoffwechselprodukte von Thiamethoxam und Acetamiprid bei einer Wellenlänge von 254 nm sowie von Imidacloprid und Imidaclothiz bei 270 nm in Proben aus Abschnitt 4.3 zu detektieren.
      HINWEIS: Der HPLC-UV-Zustand war derselbe wie in der vorherigen Studie19.
  2. GC-Analyse des Stoffwechselverhaltens von Organophosphaten
    1. Erkennen Sie den Gehalt an Dimethoat und Omethoat in Proben aus Abschnitt 4.4 durch eine GC-FPD mit einer chiralen Spalte (Materialtabelle).
    2. Verwenden Sie Stickstoff als Trägergas und stellen Sie den Durchfluss auf 1,0 ml min-1ein.
    3. Stellen Sie die Anfangstemperatur auf 120 °C ein und halten Sie sie 5 min. Erhöhen Sie die Temperatur auf 150 °C bei 30 °C min-1 und halten Sie 3 min. Erhöhen Sie auf 170 °C bei 10 °C min-1 und halten Sie 7 min. Zum Schluss bei 30 °C min-1 auf 210 °C anerhöhen und dann 5 min halten.
    4. Stellen Sie die Einspritztemperatur im splitless-Modus auf 200 °C ein; Stellen Sie die Detektortemperatur auf 250 °C ein.
    5. Stellen Sie das Injektionsvolumen auf 1 L ein.
  3. UPLC-QTOF Analyse der Insektizidmetaboliten in der Zellkultur
    1. Mit UPLC-QTOF mit einer C18-Spalte (Materialtabelle) können die Metaboliten der Insektizide in der Zellkultur (Proben aus Abschnitt 4.3) erkannt werden.
    2. Stellen Sie den Durchfluss auf 0,2 ml min-1ein. Stellen Sie das Injektionsvolumen auf 10 l ein.
    3. Für die mit Neonicotinoid behandelten Proben die erste mobile Phase auf 85% A (5 mM Ammoniumformatwasser) und 15% B (Acetonitril) einstellen. Über 10 min, erhöhen mobile Phase B auf 38% und Rückkehr auf 15% über 1 min, halten für 9 min.
    4. Für die organophosphatbehandelten Proben die erste mobile Phase auf 55% A (0,1% Ameisensäurewasser) und 45% B (Acetonitril) einstellen. Über 5 min, erhöhen Sie die mobile Phase B auf 70%, dann kehren Sie zu 45% von B über 0,5 min zurück, halten Sie für 2,5 min.
    5. Stellen Sie die QTOF-Betriebsparameter wie folgt ein: Gastemperatur, 325 °C; Trocknungsgas (Stickstoff), 10 L min-1; Mantelgastemperatur, 350 °C; Mantelgasdurchfluss, 11 L min-1; Kapillarspannung, 4000 V; Düsenspannung, 1000 V; Fragmentorspannung, 100 V für neonicotinoide Insektizide oder 110 V für Organophosphor-Insektizide; Abschäumerspannung, 65 V; im positiven Ionenmodus.
    6. Stellen Sie das Gerät auf das volle Scanspektrum und den Ziel-MS/MS-Modus ein.
    7. Verarbeiten der Daten mit genauen Massenwerkzeugen; Schließen Sie die Metaboliten ohne Standardprodukte aus der MS/MS-Anmerkung sowie die Literatur12,15,20,21,22ab.
  4. UPLC-Orbitrap-Analyse der Insektizidmetaboliten in intaktem Pflanzenextrakt
    1. Nachweis der Metaboliten von Insektiziden in intaktem Pflanzenextrakt mit UpLC-Orbitrap-Massenspektrometrie (Materialtabelle).
    2. Stellen Sie die Betriebsparameter für die Massenspektrometrie (Tabelle der Materialien) wie folgt ein: Mantelgasdruck, 35 arb; Gastemperatur, 300 °C; Düsenspannung, 3,5 KV; Kapillartemperatur, 350 °C.
    3. Legen Sie die Elutionsprogramme als oben beschrieben fest (Schritte 6.3.3 und 6.3.4) für die UPLC-QTOF-Analyse der Zellkultur.

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Ergebnisse

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Die Induktion von Callus aus Blättern, die von Feldteebäumen geerntet wurden, und von Blättern, die aus in vitro in einer sterilen Umgebung angebauten Teepflanzen entnommen wurden, wurde durch Messung von Kontamination, Bräunung und Induktion nach 28 Tagen Anbau auf MS-Medien verglichen ( Abbildung 1A). Das Calluswachstum wurde bei 20, 37, 62 und 90 Tagen Kultur registriert (Abbildung 1B). Der aus den in vitro gewachsenen Blätter...

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Diskussion

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Dieser Artikel stellt den detaillierten Prozess der Etablierung eines Modells des Pestizidstoffwechsels in Teepflanzengewebe, einschließlich der Auswahl von Expflanzen, die Bestimmung der Zelllebensfähigkeit, und die Etablierung einer Teezellensuspensionskultur mit hoher metabolischer aktivität. Alle Teile eines Pflanzengewebes könnten verwendet werden, um Callus in einer sterilisierten Umgebung zu initiieren25. Teeblätter wurden in dieser Studie für die Callus-Initiation ausgewählt, nicht nur, we...

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Offenlegungen

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Die Autoren haben nichts zu verraten.

Danksagungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Diese Arbeit wurde unterstützt durch das National Key Research & Development Program (2016YFD0200900) of China, die National Natural Scientific Foundation of China (Nr. 31772076 und Nr. 31270728), Die China Postdoctoral Science Foundation (2018M630700) und der Open Fund of Of Of China (Nr. 31772076 und Nr. 31270728), die China Postdoctoral Science Foundation (2018M630700) und der Open Fund of Of Fund of China State Key Laboratory of Tea Plant Biology and Utilization (SKLTOF20180111).

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Acetamiprid (99,8%)Dr. Ehrenstorfer46717CAS-Nr.: 135410-20-7
Acetonitril (CAN, 99,9%)TediaAS1122-801CAS-Nr.: 75-05-8
AgarSolarbio Science & TechnologieA8190CAS-Nr.: 9002-18-0
Clothianidin (99,8 %)Dr. Ehrenstorfer525CAS-Nr.: 210880-92-5
Dimethoat (98,5 %)Dr. Ehrenstorfer109217CAS-Nr.: 60-51-5
Imidacloprid (99,8 %)Dr. Ehrenstorfer91029CAS-Nr.: 138261-41-3
Imidaclothiz (99,5 %)Toronto Research ChemicalI275000CAS-Nr.: 105843-36-5
Kinetin (KT, >98,0%)Solarbio Science & TechnologieK8010CAS-Nr.: 525-79-1
Omethoat (98,5%)Dr. Ehrenstorfer105491CAS-Nr.: 1113-02-6
Polyvinylpolypyrrolidon (PVPP)Solarbio Science & TechnologieP8070CAS-Nr.: 25249-54-1
SaccharoseTocris Bioscience5511CAS-Nr.: 57-50-1
Thiamethoxam (99,8%)Dr. Ehrenstorfer20625CAS-Nr.: 153719-23-4
Triphenyltetrazoliumchlorid (TTC, 98,0%)Solarbio Science & TechnologieT8170CAS-Nr.: 298-96-4
2,4-Dichlorphenoxyessigsäure (2,4-D, >98,0%)Guangzhou Saiguo BiotechD8100CAS-Nr.: 94-75-7
chirale SäuleAgilent CYCLOSIL-B112-6632Chromatographiesäule (30 m &fach; 0,25 mm > 0,25 μ m)
Gaschromatographie (GC)Shimadu2010-PlusGepaart mit Flammenphotometrischem Detektor (FPD)   
Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC)Agilent1260Gepaart mit Ultraviolett-Detektor (UV)
HSS T3 C18-SäuleWaters186003539Chromatographie-Säule (100 mm &-fach; 2,1 mm &-fach; 1,8 μ m)
Ultrahochleistungs-Flüssigchromatographie (UPLC)Agilent1290-6545Tandem-Quadrupol-Flugzeit-Massenspektrometer (QTOF)
Ultra-Hochleistungs-Flüssigchromatographie (UPLC)Thermo ScientificUltimate 3000-Q ExactiveFocus Verbunden mit einem Orbitrap-Massenspektrometer

Referenzen

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Zellsuspension von TeeInsektizidmetabolismusPflanzenzellkulturFl ssigkeitschromatographieGaschromatographieMassenspektrometrieKallusinduktionPestizidanalyseZellviabilit tsterile Pfl nzchen

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